一种抗胃癌药物的高通量筛选方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种抗胃癌药物的高通量筛选方法。

背景技术：

1、胃癌是一种常见的起源于胃粘膜上皮细胞的恶性肿瘤，其在恶性肿瘤中全球发病率居第五位、死亡率居第四位。

2、进展期胃癌患者难以通过外科手术等手段进行根治性治疗，目前主要治疗方案仍是联合化疗，但有效的化疗药物种类较少且易出现毒副作用。而传统细胞毒性药物对胃癌治疗效果已达到瓶颈，分子靶向药物与其相比具有低毒、高效等特点，因此近年来开发新型分子靶向药物成为胃癌研究热点之一。

3、sos1(gene id：6654)和grb2(gene id：2885)是参与胃癌发生和发展的关键蛋白质。sos1是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，在kras(一种ras蛋白突变亚型)从gdp负载的“关闭”状态到gtp负载的“开启”状态的转换中发挥着重要作用。而生长因子受体结合蛋白2(grb2)是一种衔接蛋白，它将sos1从细胞质招募到质膜，在质膜上sos1与ras结合，启动ras－mark通路，参与细胞生长和分化的调控，这一途径在胃癌等多种肿瘤中都发挥着重要作用(punekar sr,velcheti v,neel bg,wong kk.the current state of the art andfuture trends in ras-targeted cancer therapies.nat rev clin oncol.2022；19(10):637-655.doi:10.1038/s41571-022-00671-9)。

4、扰乱sos1活性反过来会破坏kras信号传导，因此，筛选抑制sos1和grb2相互作用的小分子抑制剂，有望成为治疗胃癌的新策略(moore ar,rosenberg sc,mccormick f,malek s.ras-targeted therapies:is the undruggabledrugged？[publishedcorrection appears in nat rev drug discov.2020dec；19(12):902].nat rev drugdiscov.2020；19(8):533-552.doi:10.1038/s41573-020-0068-6)。

5、目前，已报道的靶向蛋白相互作用小分子抑制剂筛选方法主要包括酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)筛选法、4t1细胞荧光素酶报告基因筛选法、果蝇细胞化学遗传学筛选法和虚拟筛选法。但上述筛选模型普遍存在假阳性率高、筛选周期长、筛选成本高、操作繁琐等问题，较大地限制了其在大规模高通量筛选中的应用。因此，积极开发操作简便、稳定可靠、经济快速的新型grb2-sos1小分子抑制剂高通量筛选模型具有重要意义。

6、荧光偏振技术利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的分子与其他分子相互作用前后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高；如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值低，从而计算出样品的毫偏值(millipolarization units，mp)。该方法具体可以参考文献(jameson dm,rossja.fluorescence polarization/anisotropy in diagnostics and imaging.chemrev.2010；110(5):2685-2708.doi:10.1021/cr900267p)。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种抗胃癌药物的高通量筛选方法。

2、一种抗胃癌药物的高通量筛选方法，包括以下步骤：

3、(1)分别表达获得融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst，

4、其中，融合蛋白grb2-egfp为grb2蛋白的c端融合表达有egfp蛋白；融合蛋白sos1-gst为sos1蛋白的c端融合表达有gst蛋白；

5、(2)将融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst混合孵育，并加入待筛选的药物，基于荧光偏振技术检测毫偏值；

6、(3)计算待筛选药物的抑制率，抑制率的计算公式如下：

7、抑制率(％)＝(mp目标化合物-mp阴性对照)/(mp阳性对照-mp阴性对照)

8、其中，mp目标化合物为待筛选的药物的毫偏值；mp阴性对照为未加任何待筛选的药物测得的毫偏值；mp阳性对照为加入阳性对照药物测得的毫偏值；

9、筛选抑制率＞50％的药物为候选的抗胃癌药物。

10、优选的，融合蛋白grb2-egfp的氨基酸序列如seq id no.1所示，融合蛋白sos1-gst的氨基酸序列如seq id no.2所示。

11、融合蛋白grb2-egfp的编码基因序列如seq id no.3所示，融合蛋白sos1-gst的编码基因序列如seq id no.4所示。

12、优选的，步骤(1)中，融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst均使用大肠杆菌表达后，再纯化所得。

13、优选的，步骤(2)中，融合蛋白grb2-egfp的终浓度为78nmol·l-1；融合蛋白sos1-gst的终浓度为0.5μmol·l-1。步骤(2)中，待筛选的药物的终浓度为60μmol·l-1。

14、优选的，步骤(2)中，加入待筛选的药物前，融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst混合孵育30min；加入待筛选的药物后，继续孵育30min，然后进行检测。检测使用多功能酶标仪。

15、本发明又提供了毛地黄皂苷在制备抗胃癌药物中的应用。

16、本发明还提供了一种抗胃癌药物，活性成分为毛地黄皂苷。

17、本发明的有益效果：

18、本发明构建了一种抗胃癌药物的高通量筛选方法，是基于荧光偏振技术来筛选抑制sos1和grb2相互作用的小分子抑制剂，而抑制sos1和grb2相互作用的小分子抑制剂具有制备治疗胃癌的药物的潜力。

19、通过本发明抗胃癌药物的高通量筛选方法，提高了抗胃癌药物的筛选效率，同时毛地黄皂苷作为潜在的抗胃癌药物候选物质，经过实验验证证明其具有抗胃癌作用。具有抑制sos1和grb2相互作用的能力。这一发现为开发胃癌治疗药物提供了新的方向和可能性，为胃癌患者带来了更多治疗选择。

技术特征：

1.一种抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，融合蛋白grb2-egfp的氨基酸序列如seq id no.1所示，融合蛋白sos1-gst的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，融合蛋白grb2-egfp的编码基因序列如seq id no.3所示，融合蛋白sos1-gst的编码基因序列如seq idno.4所示。

4.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst均使用大肠杆菌表达后，再纯化所得。

5.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，融合蛋白grb2-egfp的终浓度为78nmol·l-1；融合蛋白sos1-gst的终浓度为0.5μmol·l-1。

6.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，待筛选的药物的终浓度为60μmol·l-1。

7.根据权利要求1所述抗胃癌药物的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，加入待筛选的药物前，融合蛋白grb2-egfp和sos1-gst混合孵育30min；加入待筛选的药物后，继续孵育30min，然后进行检测。

8.毛地黄皂苷在制备抗胃癌药物中的应用。

9.一种抗胃癌药物，其特征在于，活性成分为毛地黄皂苷。

技术总结
本发明公开了一种抗胃癌药物的高通量筛选方法。本发明构建了一种抗胃癌药物的高通量筛选方法，是基于荧光偏振技术来筛选抑制SOS1和GRB2相互作用的小分子抑制剂，而抑制SOS1和GRB2相互作用的小分子抑制剂具有制备治疗胃癌的药物的潜力。通过本发明抗胃癌药物的高通量筛选方法，提高了抗胃癌药物的筛选效率，同时毛地黄皂苷作为潜在的抗胃癌药物候选物质，经过实验验证证明其具有抗胃癌作用。具有抑制SOS1和GRB2相互作用的能力。这一发现为开发胃癌治疗药物提供了新的方向和可能性，为胃癌患者带来了更多治疗选择。

技术研发人员：叶足,郦骁,黄懿行,周卫,程向东
受保护的技术使用者：浙江省肿瘤医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23