MIR2911在制备抗黄热病毒YFV的药物中的应用

本技术涉及生物制药，具体涉及mir2911在制备抗黄热病毒yfv的药物中的应用。

背景技术：

1、黄热病毒(yellow fever virus，yfv)属于黄病毒科黄病毒属，为单链正链rna病毒。该病毒主要通过蚊虫传播，感染蚊叮咬人后，将含黄热病病毒的唾液注入人体皮下毛细血管，病毒迅速扩散到局部淋巴结，并在其中复制繁殖，数日后进入血循环形成病毒血症，主要累及肝、脾、肾、淋巴结、骨髓、横纹肌等。临床以高热、头痛、黄疸、蛋白尿、相对缓脉和出血等为主要表现，严重的可发展为多器官衰竭、出血性休克甚至死亡。

2、尽管黄热病毒的疫苗能有效预防黄热病毒的感染，但疫苗覆盖率低，加上蚊虫管控措施低下，且引起的疾病无特效治疗药物，使疫情抑制在流行区域呈周期性爆发。黄热病在南美和非洲的热带和亚热带地区很常见，在世界范围内，约有6亿人生活在流行地区，每年感染人数约20万，死亡人数高达4万。我国也相继报道了多例输入性病例，这对国内无免疫屏障的人群来说是非常大的威胁。因此，对抗yfv药物的开发至关重要。

3、早期报道显示，金银花、板蓝根和黄柏等能“清热解毒”的中药材具有抑制病毒复制的功能。2015年在金银花中首次发现了mir2911，它是天然功能性小分子，能在非植物体内调控靶基因，抑制多种病毒，是一种具有广谱抗病毒潜力的新型核酸类有效成分。

4、其抗病毒机制如下：mir2911的序列为ggccgggggacgggcuggga，在碱基组成上是高gc序列，几乎所有病毒基因组含有60％的高gc序列，mir2911是通过碱基配对的方式结合病毒靶mrna，抑制病毒基因表达。目前报告mir2911能够靶向94％的已知病毒。而在人的基因组中仅有10％的高gc序列，因此安全性有保证。

5、研究发现外源mir2911是通过胃粘膜的胃顶细胞的sidt1蛋白转运到细胞，进而进入循环系统；但16％的中国人群有sidt1基因多态性无法吸收外援mirnas，导致口服合成或者提取的mir2911因未被吸收，在体内不能抑制病毒复制，鉴于此，研发一种抗病毒的注射型小核酸药物很有必要。

6、目前，小核酸药物的临床应用发展进度远远落后于预期，根本原因是目前缺乏合适的sirna传递系统，将sirna安全地、精确地、高效地输送到目标组织，该问题已经成为制约小核酸药物应用的核心问题。

7、综上所述，以mir2911为基础设计抗黄热病毒的小核酸药物具有非常广阔的应用前景，如何将mir2911送到目标组织发挥抗病毒功能尤为重要。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术局限性，本技术提出了mir2911在制备抗黄热病毒yfv的药物中的应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

2、申请人研究团队发现内源性细胞可以选择性地将mirnas封装到外泌体(exosome)中，外泌体可以将mirna传递到受体细胞中，其分泌的mirna在相对较低的浓度下，即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫系统生物相容，并具有在体内保护和运输mirna跨越生物屏障的先天能力，因此成为克服与小核酸药物传递相关的问题的潜在解决方案。研究团队进一步研发了体内自组装第三代小核酸技术，使其成为一种安全有效的sirna递送系统，结合自主研发的高效表达mir2911的质粒递送系统，开发生物合成mir2911小核酸药物，能够为靶向yfv提供潜在策略并补偿口服吸收mir2911的个体差异。

3、为实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

4、本技术的发明点是提供了mir2911在制备抗黄热病毒yfv的药物中的应用。

5、可选地，所述的应用中，mir2911是来源于基因组件中的，所述基因组件包括用于表达mir2911序列的dna序列以及与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

6、可选地，所述的应用中，所述表达mir2911的dna编码链序列(5′-3′)如seq idno.1所示，所述与表达mir2911序列的dna序列完全互补的补偿序列(5′-3′)为如seq idno.2所示的序列。为了使mir2911更易表达，对补偿序列上的碱基进行突变从而降低mir2911与补偿序列的结合能。更优的，补偿序列(5′-3′)如seq id no.3所示，从注射后外泌体内表达的mir2911的定量检测中得出此结论。

7、seq id no.1：

8、ggccgggggacgggctggga。

9、seq id no.2：

10、tcccagcctcccccggcc。

11、seq id no.3：

12、ttttagccttttttggcc。

13、可选地，所述的应用中，所述基因组件还包括loop序列；所述基因组件的组成顺序为表达mir2911序列的dna序列-loop序列-与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

14、可选地，所述的应用中，所述loop序列(5′-3′)为seq id no.4所示的序列。

15、seq id no.4：

16、gttttggccactgactgac。

17、基因组件整体按照mir2911序列-loop序列-补偿序列排列；

18、如seq id no.5所示(对应补充序列seq id no.2)：

19、ggccgggggacgggctggga-gttttggccactgactgac-tcccagcctcccccggcc；

20、或如seq id no.6所示(对应补充序列seq id no.3)：

21、ggccgggggacgggctggga-gttttggccactgactgac-ttttagccttttttggcc。

22、可选地，所述的应用中，所述mir2911是包含在递送系统中的，所述递送系统含有所述的基因组件，递送系统能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有mir2911序列的复合结构。

23、可选地，所述的应用中，所述递送系统为病毒载体或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。

24、优选的，所述载体为质粒载体。

25、递送系统为质粒系统，质粒中包含有所述的启动子、靶向标签和所述的基因组件。

26、可选地，所述的应用中，所述递送系统还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在被施用对象的器官组织中形成复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述mir2911序列递送进入目标组织；

27、优选的，所述递送系统包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子与表达mir2911序列的dna序列、启动子与靶向标签、启动子与表达mir2911序列的dna序列与靶向标签；

28、优选的，所述复合结构为外泌体。

29、递送系统按照启动子-靶向标签-基因组件排列。

30、可选地，所述的应用中，所述启动子为cmv启动子，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白；

31、优选的，所述靶向肽包括rvg靶向肽、ge11靶向肽、ptp靶向肽、tcp-1靶向肽、msp靶向肽；更优选的，选自rvg靶向肽，狂犬病病毒肽rvg能穿过血脑屏障，进入脑组织，使小核酸在脑内发挥作用，对于针对脑部疾病的小核酸治疗有重要作用；

32、优选的，所述靶向蛋白包括rvg-lamp2b融合蛋白、ge11-lamp2b融合蛋白、ptp-lamp2b融合蛋白、tcp-1-lamp2b融合蛋白、msp-lamp2b融合蛋白；更优选的，选自rvg-lamp2b融合蛋白。

33、通过靶点预测发现，mir2911可以直接靶向yfv-ns3、yfv-ns4b和yfv-e，优选为yfv-ns3，在细胞水平上能抑制yfv毒株的复制，细胞水平包括但不限于在hek-293t、bhk-21、huh-7细胞中起到抑制yfv毒株复制的作用(包括在mrna、蛋白质和病毒颗粒三个水平上的复制)。

34、本技术的第二个发明点是提供了一种抗黄热病毒yfv的药物组合物，所述药物组合物中包括所述的基因组件或所述的递送系统；还含有药用辅料；所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。

35、此种药物，可在体内自组装形成包裹mir2911的外泌体，随后进入血液循环进而将mir2911递送至各个组织。

36、本技术还提供了一种体外抑制yfv复制或抑制yfv蛋白基因表达的方法，通过将人工合成的表达mir2911的质粒与受yfv感染的细胞进行接触实现抑制作用。

37、与现有技术相对比，本技术具有以下优点：本技术提供的mir2911在制备抗黄热病毒yfv的药物中的应用，创新性地提出了应用一种mir2911小核酸药物抑制yfv复制的新型策略，能够特异性地靶向yfv的多个基因，更有效地在体外抑制yfv的复制。细胞实验证明，该小核酸药物能够直接靶向yfv基因，能够在mrna、蛋白质和病毒颗粒三个水平显著抑制yfv的复制。质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好，最终发挥效果的rna序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性，而且能够补偿口服mir2911的个体差异。mir2911能直接靶向yfv的多个基因，能够有效应对病毒基因组突变，与市面上具有单一靶点的蛋白多肽类药物相比，成本低廉且更加高效。此外，sirna的生产工艺简单，设计灵活多变，应用功能强大，为靶向其他病毒或治疗目前其他传统疗法无法治愈或效果不佳的疾病提出了一种代替方法，应用前景广阔。

技术特征：

1.mir2911在制备抗黄热病毒yfv的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir2911是来源于基因组件中的，所述基因组件包括用于表达mir2911序列的dna序列以及与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在基因组件的编码链中，所述表达mir2911的dna序列为如seq id no.1所示的序列，所述与表达mir2911序列的dna序列互补的补偿序列为如seq id no.2或seq id no.3所示的序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因组件还包括loop序列；所述基因组件的组成顺序为表达mir2911序列的dna序列-loop序列-与该dna序列能够形成至少80％互补的补偿序列。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在基因组件编码链中，所述loop序列为seqid no.4所示的序列。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir2911是来源于递送系统中的，所述递送系统含有如权利要求2-5任意一项所述的基因组件，递送系统能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有mir2911序列的复合结构。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述递送系统为病毒载体或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体；优选的，所述载体为质粒载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述递送系统还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在被施用对象的器官组织中形成复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述mir2911序列递送进入目标组织；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述启动子为cmv启动子，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白；

10.一种抗黄热病毒yfv的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求2-5任意一项所述的基因组件，或权利要求6-9任意一项所述的递送系统；还含有药用辅料；所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。

技术总结
本申请提供了MIR2911在制备抗黄热病毒YFV的药物中的应用。与现有技术相对比，本申请具有以下优点：本申请提供的应用，创新性地提出了应用MIR2911小核酸药物抑制YFV复制的策略，能够特异性地靶向YFV的多个基因，与利巴韦林相比更有效地抑制YFV的复制；细胞实验验证了在mRNA、蛋白质和病毒颗粒水平上的抑制作用。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证外泌体安全性，也能够补偿口服MIR2911的个体差异。与市面上具有单一靶点的蛋白多肽类药物相比，成本低廉且更加高效。

技术研发人员：张芳琳,张辰宇,雷迎峰,周祯,雷洁琼,董阳超,夏立静
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23