一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建方法及其应用

本发明属于噬菌体应用领域，涉及了一种用于促进骨形成的噬菌体的构建及其应用；具体的是，涉及了一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建方法及其应用。

背景技术：

1、骨流失，也称为骨质疏松，是一种常见的骨骼疾病，其特征是骨密度下降和骨微结构退化，导致骨骼变得脆弱，容易发生骨折。骨流失的原因多种多样，包括年龄增长、性别(尤其是女性绝经后)、遗传因素、营养不良(如钙和维生素d摄入不足)、缺乏运动、某些慢性疾病和药物使用(如长期使用激素类药物)等。特别是在老年人中，这种骨折风险增加，可能导致严重的健康问题，如脊椎压缩性骨折、髋部骨折等。临床广泛应用抗骨吸收药物(如双膦酸盐)或合成代谢药物(如特立帕肽)来减缓骨流失速度或增加骨密度，缺乏其他有效的治疗手段。与传统的病毒基因载体相比，改造后的m13噬菌体具有肌肉靶向性特点，通过促进mirna-144的表达有效调控骨稳态促进骨形成。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明目的是提出了一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体(myo-m13-mir144)，包含该噬菌体的构建方法及其应用。

2、本发明的技术方案是：

3、为了实现上述目标，本发明第一方面公开了一种肌肉靶向性m13噬菌体(myo-m13)的构建方法，具体制备步骤包括：

4、将肌肉靶向性多肽(rgdlttp)通过pcr和同源重组克隆至噬菌体m13 piii基因的n端中，随后转化至e.coli xl1-blue感受态细胞中，挑取单克隆进行培养，通过pcr扩增后经过测序验证正确的单克隆经peg纯化后生产出重组噬菌体myo-m13，透射电镜观察其形态。

5、本发明的第二方面公开了一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体，对上述的肌肉靶向性m13噬菌体的进一步改造得到该噬菌体；具体制备步骤包括：

6、将aav-itr-mirna-144(itr:腺病毒相关病毒末端反向重复序列)片段(5'-aav-itr-cmv-mirna-144-sv40 poly a-aav-itr-3')，命名为itr-mir144，克隆至puc57载体中；通过双酶切(sacii-saci)将itr-mir144片段克隆至噬菌体myo-m13基因组中，并转化至xl1-blue感受态中涂布lb平板，挑取单克隆进行培养，并进行菌液pcr扩增鉴定和测序比对，将测序成功纯化后的重组噬菌体命名为myo-m13-mir144，透射电镜观察其形态。

7、进一步的，所述改造后的肌肉靶向性噬菌体可以转录mirna

8、进一步的，所述改造后的肌肉靶向性噬菌体能够促进mirna-144的表达，促进骨形成。

9、本发明的第三方面是公开前述的myo-m13-mir144噬菌体制备的试剂用于老年鼠骨形成(包括骨质流失等)或去卵巢(ovx)模拟绝经后骨质疏松小鼠(包括鼠龄较小的或者鼠龄较大的均可)；

10、所述构建的具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体在制备用于骨质疏松症或老年鼠骨形成的试剂中的应用；

11、通过腹腔或尾静脉注射有效促进老年鼠骨形成或改善骨质疏松的小鼠；

12、在优选的实施方案中，应用时噬菌体制备的试剂为(0.8-1.2)*1011cfu/ml，按100μl每次给予小鼠尾静脉连续注射8周，每周1次。

13、本发明的有益效果是：本发明成功改造了一种可以转录mirna的噬菌体，利用该噬菌体能有效靶向肌肉组织促进mirna-144的表达，从而有效改善骨稳态促进骨形成。

技术特征：

1.一种肌肉靶向性m13噬菌体的构建方法。

2.一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建方法，其特征在于，将m13噬菌体经改造后得到该肌肉靶向性噬菌体；即噬菌体myo-m13-mir144。

3.根据权利要求2所述的一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建方法，其特征在于，所述改造后的肌肉靶向性噬菌体可转录mirna。

4.根据权利要求2所述的一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建方法，其特征在于，所述肌肉靶向性噬菌体的改造能促进mirna-144的表达，促进骨形成。

5.如权利要求2-4任意一项构建方法构建的所述的具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体在骨质疏松症中的应用。

6.如权利要求2-4任意一项构建方法构建的所述的具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体在促进老年鼠骨形成中的应用。

7.如权利要求5或6任意一项所述构建的具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体在制备用于骨质疏松症或老年鼠骨形成的试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体制备试剂的方法。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过腹腔或尾静脉注射噬菌体制备的试剂治疗骨质疏松症或促进老年鼠骨形成。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述噬菌体制备的试剂为(0.8-1.2)*1011cfu/ml，按100μl每次给予小鼠尾静脉连续注射8周，每周1次。

技术总结
本发明公开了一种具有肌肉靶向性促进骨形成的噬菌体的构建及其应用；属于噬菌体技术领域，本发明通过M13噬菌体经改造后得到该肌肉靶向性噬菌体，即Myo‑M13‑miR144；所述的噬菌体应用于促进骨形成、改善骨质疏松症及其通过制备的试剂经过腹腔或尾静脉注射；本发明改造的一种大肠杆菌噬菌体进行基因组，可利用该噬菌体靶向肌肉组织调控miRNA，进而增强肌肉组织细胞因子的表达，显著促进骨形成；本发明对于大肠杆菌噬菌体的成功改造，通过其靶向性介导肌肉细胞因子的释放从而实现调控骨稳态。操作简便，效果显著。

技术研发人员：陈昊,林文正,刘婷婷,顾苏煜
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23