一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质F组分的方法

本发明涉及微生物工程领域，特别涉及一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法。

背景技术：

1、生二素链霉菌作为一种工业菌株，尽管其产量可观，但在链霉菌的发酵过程中，仍有一些难以分离的杂质组分，这些杂质组分不仅影响了最终产品的纯度，还增加了下游分离纯化过程的复杂性和成本，为了有效去除或减少杂质组分。杂质f是其中最难以分离的成分之一，其性质与spm i非常相似，如图1所示，弗洛氨糖上n-甲基转移酶从氨基上少转移了一个甲基会导致杂质f的生成。根据蛋白的相似性srm7和srm21可编码n,n-二甲基转移酶，srm21基因在现有文献中曾过表达但效果不好。现有的技术中，对于如何有效去除或减少这些杂质组分，尤其是杂质f，尚无有效的方法。因此，在此提供一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

3、本发明提供一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，包括以下步骤：

4、第一步：构建过表达srm7的生二素链霉菌基因工程菌株；

5、第二步：对第一步中所得基因工程菌株进行发酵，发酵过后进行菌株的初步分纯，以获得杂质f组分减少的基因工程菌株；

6、第三步：对第二步中所得基因工程菌株移种时间的选择和碳酸钙含量进行优化，获得更少的杂质f组分。

7、作为本发明的一种优选技术方案，第一步的操作流程为：

8、a：构建编码n,n-二甲基转移酶的基因srm7的过表达质粒pib-srm7；

9、b：通过接合转移操作，将pib-srm7质粒导入生二素链霉菌，获得过表达菌株s7，并对s7菌株进行菌落pcr和测序验证。

10、作为本发明的一种优选技术方案，pib-srm7质粒制备方法为：

11、通过pcr获得线性化质粒pib139，从生二素链霉菌基因组上获得目的基因，对线性质粒pib139和基因片段进行连接，形成重组质粒，将重组质粒转化进入dh5α感受态细胞，在含apr抗性的平板上过夜培养进行菌落pcr和测序验证。

12、作为本发明的一种优选技术方案，s7菌株制备方法为：

13、将构建好的过表达质粒pib-srm7转化到et12567感受态细胞中，将转化后的细胞涂布到含有km、cm和apr抗性的lb平板上过夜培养，对平板上的单菌落进行菌落pcr验证和测序验证，确认重组质粒转入et12567细胞，并将其作为接合转移供体菌，制备接合转移受体菌进行接合转移操作，将接合转移平板上的单菌落转接至含有na和apr抗性的平板上，选择质粒上特有的抗性基因盒作为验证片段，对转接平板上的单菌落进行pcr验证，对测序结果正确的菌落命名为s7，并将其保种。

14、作为本发明的一种优选技术方案，对菌株进行发酵的步骤包括：

15、进行发酵，获得发酵结果，记录发酵液中螺旋霉素i和杂质f的峰面积，计算杂质f的相对产量，比较发酵菌株与出发菌的发酵结果，分析杂质f组分的含量变化，保存发酵的菌作为后续实验的菌株。

16、作为本发明的一种优选技术方案，移种时间为40—49小时，以优化种子培养基的状态，初始ph为6.4—7.0，以调节发酵培养基初始ph，碳酸钙含量为0.8％—1.5％，以优化钙离子浓度和发酵过程ph值。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

18、本发明通过基因工程改造生二素链霉菌，过表达n,n-二甲基转移酶基因srm7，成功减少了发酵过程中杂质f组分的产生；通过发酵条件的优化，进一步降低了杂质f组分的含量。

技术特征：

1.一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，第一步的操作流程为：

3.根据权利要求2所述的一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，pib-srm7质粒制备方法为：

4.根据权利要求2所述的一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，s7菌株制备方法为：

5.根据权利要求1所述的一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，对菌株进行发酵的步骤包括：

6.根据权利要求1所述的一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质f组分的方法，其特征在于，移种时间为40—49小时，以优化种子培养基的状态，初始ph为6.4—7.0，以调节发酵培养基初始ph，碳酸钙含量为0.8％—1.5％，以优化钙离子浓度和发酵过程ph值。

技术总结
本发明公开了一种应用生二素链霉菌基因工程改造以减少杂质F组分的方法，包括以下步骤：构建过表达srm7的生二素链霉菌基因工程菌株；对第一步中所得基因工程菌株进行发酵，发酵过后进行菌株的初步分纯，以获得杂质F组分减少的基因工程菌株；对第二步中所得基因工程菌株移种时间的选择和碳酸钙含量进行优化，获得更少的杂质F组分。本发明通过基因工程改造生二素链霉菌，过表达N,N‑二甲基转移酶基因srm7，成功减少了发酵过程中杂质F组分的产生；通过发酵条件的优化，进一步降低了杂质F组分的含量。

技术研发人员：高淑红,徐可心,付雨
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23