一种大麦Transib转座子及其系统和应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种大麦transib转座子及其系统和应用。

背景技术：

1、dna转座子是一类能在基因组dna上跳跃的遗传元件，dna转座子包含编码转座酶的基因和两侧转座酶特异性识别的末端重复序列(inverted terminal repeats，tir)。转座酶能识别特定tir序列并携带两侧tir中间序列从基因组的一个位置转座至另一个位置。根据自身是否编码转座酶基因，dna转座子分为自主型转座子和非自主型转座子，自主型转座子编码自身转座所需要的转座酶基因，而非自主型dna转座子自身并不编码转座酶基因，而是依赖于自主型转座子编码的转座酶进行转座。根据此特征，dna转座子可应用于转基因细胞构建、基因敲除以及car-t细胞治疗等领域。

2、dna转座子系统由编码转座酶基因的载体和含有目的基因片段的底物载体两部分组成，将该系统转入细胞后，编码的转座酶将含有目的片段的dna片段从载体上切割下来，然后转座至基因组上。利用转座子系统能将外源基因稳定整合至宿主细胞基因组中，具有方便、快捷、费用低、安全和高效的优点。从鲑鱼基因组中发现，并通过氨基酸突变复活的sleeping beauty转座子和粉纹夜蛾中发现的piggybac是目前使用最广泛的转座子系统。其中sleeping beauty转座子全长约1.6kb，其编码一个含340个氨基酸的转座酶，两侧是200bp-250bp的ir序列。sleeping beauty转座系统具有转座效率高、转座位置无偏好性等优点，其主要应用于脊椎动物的基因操纵。piggybac转座子全长约2.5kb，其中存在一个编码594个氨基酸的转座酶基因，两侧存在长度为13bp的tir序列和19bp的subtir序列。piggybac转座子系统已成功应用于原生生物、酵母、昆虫和脊椎动物的转基因和基因突变研究。sleeping beauty和piggybac转座系统现均在尝试应用于临床基因治疗。但是，sleeping beauty转座子来源于脊椎动物，其应用极大地限制在脊椎动物中。并且，sleeping beauty和piggybac转座子分布广泛，它们在某些动物中应用时可能会引起宿主内源性同源转座序列的转座，相反，内源存在的同源转座酶会影响目的基因的整合效果，这两种情况均会增加宿主细胞基因组的不稳定性。此外，sleeping beauty转座子和piggybac转座子的转座插入位点分别为at和ttaa，这样专一的整合位点可能限制了转座工具的广泛应用。

3、因此，亟需研发普适性好、安全性高、整合位点偏好性不同的转座子系统，以弥补现有技术中转座子系统的不足之处。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种大麦transib转座子及其系统和应用。以克服现有技术中常用转座子系统可能引起内源同源性转座序列转座的问题，减少dna转座子系统在脊椎动物中应用的风险。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种大麦transib转座子序列，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明首次发现了在脊椎动物中不存在，但在脊椎动物中具有转座活性的dna转座子，该转座子为源自植物大麦(hordeum vulgare，hvu)的hvutransib转座子。真核表达载体上的hvutransib基因可以在哺乳动物细胞中高效表达，表达的hvutransib蛋白可以特异性识别dna底物中的hvutransib_5tir和hvutransib_3tir序列，hvutransib蛋白在hvutransib_5tir和hvutransib_3tir序列的边界进行切割，随后hvutransib蛋白将hvutransib_5tir和hvutransib_3tir中间的dna序列整合至另外的dna上，实现dna片段在不同dna之间移动。

5、第二方面，本发明提供一种大麦transib转座酶，其氨基酸序列包括如seq id no：5所示的序列。

6、作为本发明所述的大麦transib转座酶的优选实施方式，其氨基酸序列如seq idno：2所示。

7、第三方面，本发明提供一种大麦transib转座子tir底物序列，其核苷酸序列包括如seq id no：6和7所示的序列。

8、作为本发明所述的大麦transib转座子tir底物序列的优选实施方式，其核苷酸序列如seq id no：3和4所示。

9、第四方面，本发明提供一种大麦transib转座子系统，包括编码所述的大麦transib转座酶的辅助载体和含有目的基因片段的底物载体两部分；所述底物载体包括所述的大麦transib转座子tir底物序列。

10、作为本发明所述的大麦transib转座子系统的优选实施方式，所述辅助质粒的骨架质粒为ptt5-mbp真核表载体；所述底物载体为pegfpn1载体和/或ptetrss*载体。

11、优选的，含有hvutransib基因的ptt5-mbp真核表载体，其中mbp标签蛋白融合表达在hvutransib蛋白的n端；人工合成包含hvutransib_5tir、hvutransib_3tir序列以及两者中间的polya序列的dna片段，将其通过xhoi+apai双酶切连接到pegfpn1载体上，称为phvutransib_tir；将hvutransib_5tir和hvutransib_3tir序列替换ptetrss*载体上的12rss和23rss，形成的转座底物质粒ptet-hvutransibtir。

12、作为本发明所述的大麦transib转座子系统的优选实施方式，所述转基因供体质粒可插入目的基因；所述目的基因包括能在哺乳动物细胞中表达的任一基因。

13、第五方面，本发明提供一种转染系统或试剂盒，包含所述的大麦transib转座子系统。

14、第六方面，本发明将所述大麦transib转座子序列、所述的大麦transib转座酶、所述的大麦transib转座子tir底物序列、所述的大麦transib转座子系统、所述转染系统或试剂盒在基因编辑中应用。优选的，在哺乳动物细胞中国带入外源基因中的应用。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

16、本发明的大麦transib转座子是植物性来源，并且在脊椎动物基因组中是不存在的。利用该大麦transib转座子在哺乳动物细胞中导入外源基因具有安全性较高的优点。另外，大麦transib转座子具有如下的特征：一是其识别的底物序列短，仅为39bp，底物质粒上能承载较大的目的基因，而sleeping beauty转座酶的底物识别序列约为200bp。二是通过初步的转座实验，发现大麦transib转座子偏好插入富含gc的区域，这与常用的sleepingbeauty和piggybac转座系统偏好插入at序列不同。因此，大麦transib转座子系统有不同于现有dna转座子的整合模式，可有效弥补现有转座子系统的不足。

技术特征：

1.一种大麦transib转座子序列，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

2.一种大麦transib转座酶，其特征在于，其氨基酸序列包括如seq id no：5所示的序列。

3.根据权利要求2所述的大麦transib转座酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno：2所示。

4.一种大麦transib转座子tir底物序列，其特征在于，其核苷酸序列包括如seq idno：6和7所示的序列。

5.根据权利要求4所述的大麦transib转座子tir底物序列，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：3和4所示。

6.一种大麦transib转座子系统，其特征在于，包括编码权利要求2或3所述的大麦transib转座酶的辅助载体和含有目的基因片段的底物载体两部分；所述底物载体包括权利要求4或5所述的大麦transib转座子tir底物序列。

7.根据权利要求6所述的大麦transib转座子系统，其特征在于，所述辅助质粒的骨架质粒为ptt5-mbp真核表载体；所述底物载体为pegfpn1载体和/或ptetrss*载体。

8.根据权利要求6所述的大麦transib转座子系统，其特征在于，所述转基因供体质粒可插入目的基因。

9.一种转染系统或试剂盒，其特征在于，包含权利要求6～8任一项所述的大麦transib转座子系统。

10.权利要求1所述大麦transib转座子序列、权利要求2或3所述的大麦transib转座酶、权利要求4或5所述的大麦transib转座子tir底物序列、权利要求6-8任一项所述的大麦transib转座子系统、权利要求9所述转染系统或试剂盒在基因编辑中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种大麦Transib转座子及其系统和应用。本发明提供一种大麦Transib转座子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明首次发现了在脊椎动物中不存在，但在脊椎动物中具有转座活性的DNA转座子，该转座子为源自植物大麦(Hordeum vulgare，Hvu)的HvuTransib转座子。利用该大麦Transib转座子在哺乳动物细胞中导入外源基因具有安全性较高的优点，且识别的读物序列短，偏好插入富含GC的区域。本发明弥补了现有技术中转座子系统的不足。

技术研发人员：元少春,徐安龙,黄子文,蔡振西,陶鑫
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23