一种制备醇类化合物的方法

本发明属于生物技术、生物催化领域，具体涉及一种制备醇类化合物的方法。

背景技术：

1、醇类化合物如脂肪醇、芳香醇等在工业生产中具有极其重要的应用。以脂肪醇为例，它是多种重要精细化工产品的主要成分，如增塑剂、粘合添加剂、油墨和脱墨溶液、润滑剂、洗涤剂以及个人护理产品。此外，低碳数脂肪醇可作为生物可再生燃料，有望解决能源短缺问题。截至2023年，全球脂肪醇市场达到100亿美元，年产量超300万吨。

2、目前，脂肪醇工业生产以化学法为主，主要包括两条路线：石油基底物路线和生物基底物路线。前者即齐格勒法(ziegler process)，主要涉及乙烯低聚及后续氧化反应，是生产脂肪醇的常见工业工艺；而后者主要涉及油、脂肪以及脂肪酸的甲基酯和蜡酯的氢化。无论以何种底物出发，化学法制备脂肪醇都需要金属催化剂，不可避免地伴随着高温高压反应、大量的能源消耗以及碳排放。在全球气候变暖及“双碳”战略背景下，不需要高能耗和苛刻的反应条件的生物工艺有望实现长期的可持续生产，逐渐受到各国政府及产业界的广泛关注。在自然界当中，脂肪醇以脂肪酸或脂肪酸衍生物、脂肪酰基coa或酰基载体蛋白(acp)三类化合物为底物，通过一步反应路径或两步反应路径合成。一步反应路径通过成醇脂肪酰基辅酶a还原酶(affar)催化脂肪酰基coa或酰基载体蛋白(acp)还原实现；两步反应路径首先通过脂肪酰基coa还原酶(acr)、酰基acp还原酶(aar)和羧酸还原酶(car)分别还原脂肪酰coa、acp和脂肪酸生成脂肪醛，然后通过醛还原酶或者醇脱氢酶生成脂肪醇。脂肪醇的天然合成路径是开发新型醇类化合物制备方法的重要理论基础。

3、在众多生物工艺中，全细胞生物催化凭借其高效性、优异的鲁棒性及可重复使用性，为化学品和生物燃料的生物生产提供了新的动力，是最有望取代传统化学催化的新工艺。全细胞催化剂由“核-壳”两部分组成，酶是全细胞催化剂的核心，可通过改变编码基因实现灵活变化；而壳则为酶提供了天然保护，且有助于酶的回收和重复使用。

4、基于上述特征，全细胞催化剂的设计需要选择合适的底盘宿主以及关键酶。红球菌是一类高gc含量的革兰氏阳性放线菌，为非模式菌株，近年来由于优异的高抗逆特性、高有机溶剂耐受性、独特的基因诱导表达机制以及高效的外源蛋白表达效率而受到研究者们的关注。红球菌细胞壁外围包裹有致密的分枝菌酸层，形成了独特的细胞封皮结构，可为其中的酶提供强大的保护；此外，红球菌也是高效的蛋白表达宿主，在玫瑰红球菌rhodococcus rhodochrous中，腈水合酶能够占到可溶性蛋白总量的45％左右。这一特性更加有利于其被开发为全细胞催化剂的底盘。

5、醛还原酶(aldehyde reductase，又名醇脱氢酶)(ec 1.1.1.2)是脂肪醇两步法合成的关键酶，开发醛还原酶全细胞催化剂可赋予醇类生物制备工艺最大的灵活性：它既可作为两步法级联反应中第二步，以脂肪酸等羧酸为底物制备醇类；还可直接以醛类为底物进行合成。基于醛还原酶的全细胞催化工艺可极大拓宽醇类生物制备工艺的底物谱，提高其工业泛用性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种制备醇类化合物的方法。

2、第一方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，按照包括如下步骤的方法制备：

3、在底盘宿主红球菌中导入醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌，培养所述重组菌，收集重组菌细胞，得到全细胞催化剂。

4、上文所述全细胞催化剂中，所述醛还原酶为yqhd，yahk，yjgb，fuco，fudc，adh1，adh6，ygha，adhe1，adhe2，adhe3或adhe4；

5、所述yqhd，yahk，yjgb，fuco，fudc，adh1，adh6，ygha，adhe1，adhe2，adhe3或adhe4的氨基酸序列依次为如下任一种：

6、a1)依次包括seq id no.1-seq id no.12；

7、a2)与a1)所示各个序列同源性大于80％且具有醛还原酶功能的蛋白质的氨基酸序列；

8、a3)a1)所示各个序列上进行单个或者多个氨基酸的插入、替换或者缺失，且具有醛还原酶功能的蛋白质的序列。

9、进一步地，所述醛还原酶可为yqhd，adh1或fudc。更进一步地，所述外源醛还原酶可为yqhd或fudc。

10、在本领域内，以上单个或者多个氨基酸的插入、替换或者缺失特别是采用性质相似的氨基酸进行替换不会改变原始酶的功能，因此也在本发明的保护范畴之内。

11、上文所述全细胞催化剂中，所述底盘宿主红球菌为浑浊红球菌、红色红球菌、红平红球菌、食醚红球菌或紫红红球菌。

12、进一步地，所述底盘宿主红球菌可为红色红球菌，在本发明的实施例中以敲除了酰胺酶和腈水合酶基因的红色红球菌thdadn、浑浊红球菌rhodococcus opacus pd630或食醚红球菌rhodococcus aetherivorans ncimb 13964为例。

13、上述全细胞催化剂的作用是转化醛类化合物生成醇类。

14、第二方面，本发明提供了第一方面所述全细胞催化剂在如下任一中的应用：

15、b1)制备醇类；

16、b2)以醛类化合物为底物制备醇类；

17、b3)转化醛类化合物；

18、b4)转化醛类化合物生成醇类。

19、第三方面，本发明提供了一种构建第一方面所述全细胞催化剂的方法，包括如下步骤：在第一方面中所述底盘宿主红球菌中导入第一方面中所述醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌，培养所述重组菌，收集重组菌细胞，得到全细胞催化剂。

20、上文所述方法中，所述导入采用质粒的形式或基因组整合的形式。

21、上文所述方法中，所述醛还原酶通过重组质粒导入所述底盘宿主红球菌；

22、所述重组质粒为将醛还原酶的编码基因插入表达载体得到的重组质粒；

23、所述表达载体可为pnv18.1-pnh-1，pnv18.1-pnh-2，pnv18.1-pnh-3，pnv18.1-pa2-1，pnv18.1-pa2-2或pnv18.1-pa2-3；具体序列如seq id no.13-seq id no.18所示。

24、或，所述醛还原酶的编码基因通过整合到基因组的形式导入所述底盘宿主红球菌；

25、所述整合到基因组的位置在所述底盘宿主红球菌的腈水合酶启动子或酰胺酶启动子的下游。

26、第四方面，本发明提供了一种重组菌，其为在第一方面中所述底盘宿主红球菌中导入第一方面中所述醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌；

27、或，本发明提供了所述重组菌在制备全细胞催化剂中的应用。

28、第五方面，本发明提供了第三方面所述方法或第四方面所述重组菌在如下任一中的应用：

29、b1)制备醇类；

30、b2)以醛类化合物为底物制备醇类；

31、b3)转化醛类化合物；

32、b4)转化醛类化合物生成醇类。

33、上文醛类化合物及其转化后对应生成的醇类具体如下：丁醛生成丁醇、甘油醛生成甘油醇、丙二醛生成丙二醇、异丁醛生成异丁醇、丙酮醛生成羟基丙酮、丙醛生成丙醇、丙烯醛生成丙烯醇、糠醛生成糠醇、乙二醛生成乙二醇、3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇、乙醇醛生成乙二醇、乙醛生成乙醇、5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基糠醇或香草醛生成香草醇。

34、在本发明的实施例中以糠醛生成糠醇，5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基糠醇，或香草醛生成香草醇为例。

35、第六方面，本发明提供了一种转化醛类化合物的方法，包括如下步骤：将第一方面所述全细胞催化剂或第三方面所述方法制备的全细胞催化剂或第四方面所述重组菌在含有醛类化合物的体系中发酵培养或者进行催化反应，实现转化醛类化合物为醇类。

36、上文中，醛类化合物为呋喃醛或芳香醛；所述呋喃醛具体为糠醛或5-羟甲基糠醛，所述芳香醛具体为香草醛。

37、具体地，以表达醛还原酶的红球菌为全细胞催化剂，催化丁醛生成丁醇、甘油醛生成甘油醇、丙二醛生成丙二醇、异丁醛生成异丁醇、丙酮醛生成羟基丙酮、丙醛生成丙醇、丙烯醛生成丙烯醇、糠醛生成糠醇、乙二醛生成乙二醇、3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇、乙醇醛生成乙二醇、乙醛生成乙醇、5-羟甲基糠醛生成5-羟甲基糠醇或香草醛生成香草醇。

38、上述发酵培养或者进行催化反应可选择地，将上述表达醛还原酶的重组红球菌活化后，接种于红球菌种子培养基，28-32℃培养48-60h，离心收集菌体或者将其作为种子液，按照1-10g/l湿菌体或者5％-10％接种量的比例加入到含醛类化合物底物的体系，28-60℃反应12-60h，得到含有对应的醇类化合物的发酵产物。

39、上述含醛类化合物底物的体系可为含醛类化合物底物的红球菌发酵培养基。

40、醛还原酶催化醛生成醇需要nadph/nadh作为辅因子，在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主中表达这类酶后，以醛作为底物时会严重影响宿主自身生长(因为催化反应消耗大量辅因子)，而红球菌表达醛还原酶后，不影响菌株的正常生长，且具有良好的催化效果。本发明充分考虑红球菌天然的有机溶剂耐受性和高抗逆特性，结合其对目标蛋白高表达的特征，以红球菌为底盘宿主，构建红球菌全细胞催化剂，表达对nadh/nadph辅因子消耗量较高的醛还原酶，期望氧化还原反应活跃的红球菌能为目标酶提供充足的辅因子供给，从而减弱辅因子匮乏。本发明所构建的红球菌全细胞催化剂实现了多种不同来源醛还原酶的可溶性高表达。本发明的最优体系在48h内可实现对5g/l糠醛、2.5g/l 5-羟甲基糠醛、4g/l香草醛100％转化效率。本发明的有益效果得益于底盘宿主红球菌和基因高表达的结合，二者缺一不可。

技术特征：

1.一种全细胞催化剂，按照包括如下步骤的方法制备：

2.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其特征在于：所述醛还原酶为yqhd，yahk，yjgb，fuco，fudc，adh1，adh6，ygha，adhe1，adhe2，adhe3或adhe4；

3.根据权利要求1或2所述的全细胞催化剂，其特征在于：所述底盘宿主红球菌为浑浊红球菌、红色红球菌、红平红球菌、食醚红球菌或紫红红球菌。

4.权利要求1-3任一所述全细胞催化剂在如下任一中的应用：

5.一种构建权利要求1-3任一所述全细胞催化剂的方法，包括如下步骤：在权利要求1-3任一中所述底盘宿主红球菌中导入权利要求1-3任一中所述醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌，培养所述重组菌，收集重组菌细胞，得到全细胞催化剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述导入采用质粒的形式或基因组整合的形式。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

8.一种重组菌，其为在权利要求1-3任一中所述底盘宿主红球菌中导入权利要求1-3任一中所述醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌；

9.权利要求5-7任一所述方法或权利要求8所述重组菌在如下任一中的应用：

10.一种转化醛类化合物的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述全细胞催化剂或权利要求5-7任一所述方法制备的全细胞催化剂或权利要求8所述重组菌在含有醛类化合物的体系中发酵培养或者进行催化反应，实现转化醛类化合物为醇类。

技术总结
本发明公开了一种制备醇类化合物的方法。本发明提供了一种全细胞催化剂，按照包括如下步骤的方法制备：在底盘宿主红球菌中导入醛还原酶的编码基因并使其表达，得到重组菌，培养所述重组菌，收集重组菌细胞，得到全细胞催化剂。本发明所构建的红球菌全细胞催化剂实现了多种不同来源醛还原酶的可溶性高表达。本发明的最优体系在48h内可实现对5g/L糠醛、2.5g/L 5‑羟甲基糠醛、4g/L香草醛100％转化效率。本发明的有益效果得益于底盘宿主红球菌和基因高表达的结合，二者缺一不可。

技术研发人员：于慧敏,杜岩,李付龙
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23