一种中草药活性成分快速筛选鉴定方法

本发明属于药物筛选方法，具体涉及一种中草药活性成分快速筛选鉴定方法。

背景技术：

1、中草药具有悠久的应用历史，其疗效确切，是活性天然产物的重要来源。天然产物结构类型丰富多样，生物活性广泛，是药物筛选的重要对象。目前已经上市的小分子药物中，超过一半源于天然产物或以天然产物为结构基础的衍生物。因此从中草药中筛选发现苗头化合物或先导化合物是一条命中率较高的药物发现途径。

2、目前，中草药中活性成分的研究主要有两种策略，一种是传统的活性追踪策略，通过分离和活性检测交替进行，逐步缩小范围，但分离纯化阶段的目标性不强。故此种方法虽然有效，但是实验过程繁琐、周期长、效率底，并且分离过程中容易导致活性成分丢失。另一种是近些年来发展较快的配体垂钓策略，通过利用配体与靶蛋白的亲和力，将活性成分分离。该方法有效的提高了活性成分发现效率，但是存在需要固定蛋白、只能发现强结合配体、结构鉴定需要标准品等缺点。因此，如果能直接从中草药提取物中筛选活性成分，并鉴定其化学结构，建立筛选、鉴别一体化的方法，将显著提升活性成分的发现效率。

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的缺点，本发明提供了一种中草药活性成分的快速筛选与鉴定方法，本发明采用核磁共振技术(nmr)检测和数据库检索联用技术，从复杂中草药提取物中筛选并鉴别作用于靶标蛋白的活性成分，方法简单，显著提升活性成分的发现效率。

2、实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

3、一种中草药活性成分快速筛选鉴定方法，包括如下步骤：

4、s1、采用横向弛豫编辑谱检测方法，采集中草药提取物的横向弛豫编辑谱作为对照谱；

5、s2、将中草药提取物和药物靶标混合，采用横向弛豫编辑谱检测方法，采集中草药提取物和药物靶标混合物的横向弛豫编辑谱作为实验谱，将实验谱与对照谱进行对比，如果存在谱峰强度或化学位移的变化，表明中草药提取物中存在活性成分和靶标蛋白发生了相互作用，变化的谱线即为活性成分的特征1h信号；

6、s3、采集中草药提取物的异核单量子相关谱和异核二键相关谱，获取中草药提取物化学成分碳氢基团的化学位移以及碳氢基团之间的连接关系，以步骤s2发现的活性成分特征1h信号为线索，通过异核单量子相关谱确定活性成分的特征碳氢基团谱峰信号及其化学位移数据，进一步根据异核二键相关谱提供的特征碳氢基团之间连接关系，确定中草药提取物中活性成分的特征结构片段；

7、s4、利用中草药提取物中活性成分具有的特征结构片段和特征碳氢基团的化学位移数据作为筛选条件，检索中草药化学成分核磁共振数据库，从而快速确定中草药提取物中活性成分的化学结构。

8、进一步，具体的方法如下：

9、p1、配制中草药提取物的第一样品溶液；

10、p2、配制药物靶标和中草药提取物混合的第二样品溶液；

11、p3、将第一样品溶液放入核磁共振波谱仪中，采用横向弛豫编辑谱检测方法，采集第一样品溶液的1h谱，将第二样品溶液放入核磁共振波谱仪中，采用横向弛豫编辑谱检测方法，采集第二样品溶液的1h谱；

12、p4、对比第一样品溶液的1h谱和第二样品溶液的1h谱，若存在谱峰强度或化学位移的变化，则这些变化的谱峰即为中草药提取物中活性成分的特征1h信号；

13、p5、将第一样品溶液放入核磁共振波谱仪中，采集中草药提取物的二维核磁共振谱，即异核单量子相关谱和异核二键相关谱，获取中草药提取物化学成分碳氢基团的1h和13c化学位移数据，以及碳氢基团之间的连接信息，根据步骤p4获得的中草药提取物中活性成分的特征1h信号，通过异核单量子相关谱确定活性成分的特征碳氢基团谱峰信号及其1h和13c化学位移数据，进一步根据异核二键相关谱提供的特征碳氢基团之间连接关系，确定中草药提取物中活性成分的特征结构片段；

14、p6、以中草药提取物中活性成分具有的特征结构片段以及特征碳氢基团的1h和13c化学位移作为筛选条件，检索中草药化学成分核磁共振数据库，满足筛选条件的化合物作为候选化合物；

15、p7、对p6步骤确定的每一个候选化合物，将其在中草药化学成分核磁共振数据库中存储的碳氢基团化学位移数据与中草药提取物化学成分碳氢基团的1h和13c化学位移数据进行匹配，并根据匹配程度打分，得分高的候选化合物即为候选活性成分，或者具备活性成分特征的先导化合物。

16、进一步，所述的步骤p1中，中草药提取物的用量为0.1毫克以上。

17、进一步，配制第一样品溶液和第二样品溶液所用的水性溶剂为ph缓冲液和氘代水的混合溶剂，ph缓冲液与氘代水的体积比为9-99:1。

18、进一步，配制第一样品溶液时，事先将中草药提取物溶解在氘代二甲基亚砜溶剂中，随后将中草药提取物的氘代二甲基亚砜溶液加入水性溶剂中，混匀后离心，取上清液即为第一样品溶液。

19、进一步，所述的第一样品溶液中氘代二甲基亚砜的体积含量不超过10％。

20、进一步，所述药物靶标为可溶于水的蛋白质，药物靶标在第二样品溶液中的浓度在微摩尔每升以上。

21、进一步，所述的第二样品溶液的配制方法为：先配制第一样品溶液，然后向第一样品溶液中加入药物靶标，混合均匀，得到第二样品溶液。

22、进一步，所述的横向弛豫编辑谱检测方法所采用的脉冲序列为：在自旋回波和水峰压制模块同时使用完美回波技术，在压制样品水信号的同时，消除j耦合调制引起的相位扭曲和谱峰强度变化，图1为脉冲序列示意图。

23、与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：

24、1、本发明基于核磁共振技术，通过对比有无药物靶标存在时中草药提取物磁共振谱图中的信号强度变化或化学位移移动，快速识别提取物混合物中靶标活性分子的信号，再通过对中草药提取物进行特征二维相关谱的采集，获取活性成分碳氢基团的连接信息和化学位移数据。最后，利用上述信息作为输入条件，依托大型中草药化学成分核磁共振数据库进行结构检索，快速鉴定活性成分化学结构。本发明的方法简单高效，解决了传统方法筛选活性成分所需繁琐的分离过程，直接对中草药提取物混合物进行筛选，无需进行成分分离。

25、2、本方法无需对中草药化学成分进行系统分离，直接从中草药提取物中筛选并鉴别活性成分，集活性成分筛选和结构鉴定于一体，具有简单、快速的特点，能从中草药提取物有效发现作用于药物靶标的活性成分。

技术特征：

1.一种中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于具体的方法如下：

3.根据权利要求2所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于：所述的步骤p1中，中草药提取物的用量为0.1毫克以上。

4.根据权利要求2所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于：配制第一样品溶液和第二样品溶液所用的水性溶剂为ph缓冲液和氘代水的混合溶剂，ph缓冲液与氘代水的体积比为9-99:1。

5.根据权利要求3所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于：配制第一样品溶液时，事先将中草药提取物溶解在氘代二甲基亚砜溶剂中，随后将中草药提取物的氘代二甲基亚砜溶液加入水性溶剂中，混匀后离心，取上清液即为第一样品溶液。

6.根据权利要求5所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于：所述的第一样品溶液中氘代二甲基亚砜的体积含量不超过10％。

7.根据权利要求1所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于：所述药物靶标为可溶于水的蛋白质，药物靶标在第二样品溶液中的浓度在微摩尔每升以上。

8.根据权利要求1所述的中草药活性成分快速筛选鉴定方法，其特征在于所述的第二样品溶液的配制方法为：先配制第一样品溶液，然后向第一样品溶液中加入药物靶标，混合均匀，得到第二样品溶液。

技术总结
本发明公开了一种中草药活性成分的快速筛选和鉴定方法。该方法基于核磁共振技术，通过对比有无药物靶标存在时中草药提取物磁共振谱图中的信号强度变化或化学位移移动，快速识别提取的混合物中靶标活性分子的特征信号，再通过对中草药提取物进行特征二维相关谱的采集，获取活性成分碳氢基团的化学位移和连接信息。最后，以上述信息作为输入条件，依托大型中草药化学成分核磁共振数据库进行结构检索，快速鉴定活性成分化学结构。本方法无需对中草药化学成分进行系统分离，直接从中草药提取物中筛选并鉴别活性成分，集活性成分筛选和结构鉴定于一体，具有简单、快速的特点，能从中草药提取物中有效发现作用于药物靶标的活性成分。

技术研发人员：张许,黄滔,柴鑫,李双利,刘买利
受保护的技术使用者：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23