一种工程化gD外泌体、单纯疱疹病毒感染疫苗及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种工程化gd外泌体、单纯疱疹病毒感染疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒(hsv)属于疱疹病毒科的α疱疹病毒，是一类包含双链dna基因组的病毒。hsv可分为两种血清型，现在被归于两种病毒，即hsv-1和hsv-2。hsv-1和hsv-2分别倾向于感染面部和生殖器，hsv-1主要引起口唇疱疹和角膜炎，而hsv-2则是生殖器疱疹的主要病原体。这两种病毒引起的疾病并没有绝对的界限，如它们都可引起生殖器疱疹和新生儿疱疹。当人体免疫功能正常时，hsv-1感染通常不会造成危及生命的疾病，但当人体免疫系统不成熟或受损时(如感染hiv、重症covid-19或进行器官移植后)，hsv-1就可能会引起发育障碍、战力和听力丧失以及危及生命的癌症、肺炎、脑炎等严重疾病问。当人体遭遇应激刺激或免疫力下降时，hsv还会被重新激活，造成感染反复发作。如何有效控制hsv感染，减少乃至消除hsv复发，已成为亟待解决的世界性难题。

2、迄今为止，以阿昔洛韦(acv)为代表的核苷类似物一直是临床治疗hsv感染的主要药物，它能抑制hsv特异性dna聚合酶，阻碍hsv复制和进一步感染。由于hsv感染无法治愈且反复发作、持续时间长，过量使用acv等核苷类似物会导致严重的副作用，包括神经毒性和肾功能损害，并出现耐药性。据报道，在免疫力低下的患者中，acv的耐药性为7％，但在免疫力正常的健康成人中仅为0.27％。耐药hsv株的出现限制了治疗方案的选择，阻碍了及时治疗，并引发多种疾病。尽管长期以来一直在尝试治疗和预防，hsv仍然是最流行的人类传染性病毒病原体之一。

3、除了抗病毒疗法，疫苗的研发一直是一个持续性的挑战。目前已进行多项研究寻找控制hsv疾病的疫苗，但理想的候选疫苗仍无明显进展。病毒的特异性抗原糖蛋白是细胞免疫和体液免疫的主要靶标，gb和gd是基于重组蛋白的亚单位hsv疫苗最常使用的两种免疫原。现如今各种疱疹候选疫苗是基于dna，修饰的mrna，蛋白质亚基和减毒活病毒疫苗等技术进行研发的。多价dna疫苗仍然是一种相对较新的病毒疫苗接种方法，目前正被认为是其他病毒性疾病(如轮状病毒病)的潜在疫苗方法。正在研究脂质纳米颗粒中的三价核苷修饰mrna疫苗也有潜力胜过传统的亚单位疫苗。尽管近100年来人们一直在尝试开发hsv疫苗，但都没有成功。单纯疱疹病毒的糖蛋白d(gd)介导病毒进入和细胞间传播。hsv预防性疫苗的抗体反应通常针对病毒进入分子。糖蛋白d是病毒进入细胞所必需的四种糖蛋白之一。糖蛋白d与细胞受体nectin-1、疱疹病毒进入介质(hvem)或3-o硫代硫递酶硫酸肝素结合，诱导gd发生构象变化，从而激活gh/gl异源二聚体复合物。gh/gl的活化使gb进入融合状态，从而促进病毒与宿主细胞膜的融合，随后病毒帽进入细胞。病毒从一个细胞有效传播到另一个细胞也需要gd。

4、外泌体是一种常见的膜结合纳米囊泡，含有多种生物大分子，如脂类、蛋白质和核酸，在细胞间通讯和免疫调节过程中发挥着重要作用。外泌体的分泌是一种构成性现象，参与生理和病理过程，并决定了外泌体的表面分子和内容物。因此，我们可以利用外泌体作为生物标记物、疫苗和药物载体，并对其进行合理改造，用于治疗干预。

5、本技术工程外泌体作为天然载体可以作为靶向递送的强大工具，在这里，特定蛋白gd通过基因修饰在细胞膜上表达，并通过pdisplay系统将gd蛋白富集于外泌体膜表面。在动物实验中，gd外泌体疫苗显示出良好的防治hsv感染的作用。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种gd外泌体、单纯疱疹病毒感染疫苗及其制备方法和应用。本发明gd外泌体作为疫苗，可以将gd抗原递呈到外泌体膜上，并通过膜锚定蛋白将靶蛋白富集于ev即外泌体中(pdgfrn-tm，也称为pdisplay系统)，可以触发相应的免疫反应。本发明涉及的gd外泌体疫苗对于在预防hsv感染中的用途属于首次公开，而且其对防治hsv感染具有良好的效果，能够显著性延长生存时间，同时能够减轻或消除感染hsv特征，在用于hsv的防治显然具有良好的作用，这一类外泌体疫苗可被开发成新型的抗hsv感染的生物制剂。

2、本发明以gd外泌体疫苗的设计与生产进行阐述。为了生成gd阳性的外泌体，将编码gd的序列克隆到pdisplay载体中。该载体利用血小板衍生生长因子受体(pdgfr)的跨膜结构域促进蛋白质在质膜上的表达。我们用编码gd的pdisplay转染人胚肾细胞系293(hek293)细胞，然后克隆稳定表达构建体的细胞。使用超速离心方案从培养上清液中纯化外泌体。

3、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一方面，本发明提供了一种工程化外泌体的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)将编码gd的序列克隆至pdisplay载体中；

6、(2)利用上述编码gd的pdisplay载体进行转染；

7、(3)克隆稳定表达含有gd序列的细胞，超速离心，获得纯化外泌体。

8、所述的一种工程化外泌体的制备方法，所述gd的核苷酸序列如seq id no.1或seqid no.2所示。

9、其中，单纯疱疹病毒1型的糖蛋白d为gd1，核苷酸序列如seq id no.1所示；单纯疱疹病毒2型的糖蛋白d为gd2，核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、所述的一种工程化外泌体的制备方法，步骤(1)中将所述编码gd的序列克隆至pdisplay载体上的血小板衍生生长因子受体跨膜结构域中。

11、所述的一种工程化外泌体的制备方法，步骤(2)中所述转染为转染人胚肾细胞系293细胞。

12、第二方面，本发明提供了一种工程化外泌体，由任一项所述的制备方法得到。

13、第三方面，本发明提供了一种病毒感染疫苗，所述病毒感染疫苗包含如权利要求5所述的细胞外泌体。

14、所述的一种病毒感染疫苗，所述病毒为单纯疱疹病毒。

15、所述的一种病毒感染疫苗，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型。

16、第四方面，本发明提供了一种药物组合物，包含所述的工程化外泌体，以及药学上可接受的载体。

17、第五方面，本发明提供了所述的工程化外泌体在制备治疗和/或预防单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。

18、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

19、工程外泌体作为天然载体可以作为靶向递送的强大工具，特定蛋白gd通过基因修饰在细胞膜上表达，并通过pdisplay系统将gd蛋白富集于外泌体膜表面。

20、本发明工程化外泌体作为预防hsv病毒感染疫苗，用于递呈ⅰ型或ii型单纯疱疹病毒(hsv-1或hsv-2)糖蛋白d(gd1或gd2)中的应用。动物实验中经工程化外泌体疫苗免疫三次的老鼠感染hsv-112天存活率可达100％，同时对老鼠的体重几乎没有影响。而且外泌体的免疫原性低，几乎不具有任何的毒性。因此，gd工程化外泌体可进一步开发为预防hsv感染的药物，具有广泛的应用前景。

21、经工程化外泌体免疫三次的老鼠感染hsv-1后，感染特征几乎消失，生存时间也显著延长，老鼠血清中的子代病毒数量均下降90％以上，较于对照组老鼠，免疫组老鼠角膜和鼻部几乎没有病变，肺部炎性浸润也显著降低。

技术特征：

1.一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，所述gd的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

3.如权利要求1所述的一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将所述编码gd的序列克隆至pdisplay载体上的血小板衍生生长因子受体跨膜结构域中。

4.如权利要求1所述的一种工程化外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述转染为转染人胚肾细胞系293细胞。

5.一种工程化外泌体，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到。

6.一种病毒感染疫苗，其特征在于，所述病毒感染疫苗包含如权利要求5所述的细胞外泌体。

7.如权利要求6所述的一种病毒感染疫苗，其特征在于，所述病毒为单纯疱疹病毒。

8.如权利要求7所述的一种病毒感染疫苗，其特征在于，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型或单纯疱疹病毒2型。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求5所述的工程化外泌体，以及药学上可接受的载体。

10.如权利要求5所述的工程化外泌体在制备治疗和/或预防单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。

技术总结
一种工程化gD外泌体、单纯疱疹病毒感染疫苗及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明工程化外泌体的制备方法，包括：将编码gD的序列克隆至pDisplay载体中；利用上述编码gD的pDisplay载体进行转染；克隆稳定表达含有gD序列的细胞，超速离心，获得纯化外泌体。还提供了一种单纯疱疹病毒感染疫苗，包含上述外泌体。本发明gD外泌体疫苗对防治HSV感染具有良好的效果，能够显著性延长生存时间，同时能够减轻或消除感染HSV特征，在用于HSV的防治显然具有良好的作用。

技术研发人员：姚新刚,雷启云,吴文玉,刘叔文
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23