一种用于快速检测剧毒卡尔藻的crRNA及其RAA引物对

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种快速检测剧毒卡尔藻的crrna及其raa引物对。

背景技术：

1、剧毒卡尔藻属于甲藻门中的裸甲藻目卡尔藻属，在世界各地均有分布，该物种能分泌具有溶血毒性、鱼毒性和细胞毒性的卡罗毒素，对海水养殖业、沿海民众安全以及海洋生态环境造成重大威胁和损害。剧毒卡尔藻具有很强的适应性并广泛分布于世界各地，自从该物种在英国被首次分离、描述以来，由它引起的赤潮就在全世界广泛报道。

2、防治赤潮的最佳方法就是在赤潮藻大规模繁殖之前，对藻种进行快速、准确地鉴定并提供有效的赤潮预警信息。近年来，随着赤潮研究的逐步深入，核酸分子检测技术基于其快速、准确、专一性高，可对大量样品进行同时分析等优点，在赤潮生物的定性与定量分析领域中发挥着越来越重要的作用。传统的核酸检测技术主要包括普通pcr、荧光定量pcr、核酸等温扩增技术(rpa或lamp)等，但这些方法大多需要依赖较大型的仪器设备，且对于目标序列中的单个碱基差异无法准确区分，这种误差可能对鉴定结果的准确性产生重要影响。因此，本领域迫切需要开发一种能快速、灵敏、高特异、裸眼可视化的且适用于现场快速检测靶标核酸的赤潮检测方法。

3、重组酶介导链替换核酸扩增技术(raa)，是一种恒温核酸快速扩增技术(30℃～42℃)，避免了普通pcr和荧光定量pcr等核酸扩增技术受仪器和反应温度的限制，在常温下，扩增产物以指数级增长，可对目的基因序列进行超过1000万倍的扩增，具有可检测性、灵敏性、快速性以及特异性等优点。因此，该技术对于有害藻种的野外快速鉴定，非常具有应用前景。

4、近年来，crispr-cas系统已经被用于核酸的特异性、快速、敏感和便携式检测。该方法的主要原理是核酸酶(cas12a)在特异的crrnas的引导下与特定靶标结合，激活内切酶活性后，其单链dnase活性被激活，能够非特异性、无差别地切割附近的含有报告基团的单链dna底物，从而释放出可检测到的信号。

技术实现思路

1、本发明提供了一种灵敏、高特异、简便且能实现现场快速检测剧毒卡尔藻的试剂盒检测方法及其应用，靶标核酸的检测信号可分别通过荧光定量pcr、蓝光或紫外激发及侧流层析试纸条三种不同方式呈现，首次实现了基于rispr-cas12系统的针对有毒有害赤潮藻的现场精准检测。用提供的crrna及其raa引物对来检测剧毒卡尔藻方法简单，快速，且灵敏度高，特异性强。

2、为实现上述目的，本发明提供一种用于快速检测剧毒卡尔藻的crrna及其raa引物对，其特征在于，所述crrna的序列如seq id no:9所示，raa引物对的序列如seq id no:5和seq id no:6所示。

3、本发明还提供一种用于快速检测剧毒卡尔藻的方法，其特征在于，使用所述的crrna及其raa引物对序列。

4、进一步，包括如下步骤：

5、提取待检测藻或环境样品的基因组；

6、以上述提取的基因组为模板，使用raa等温扩增试剂盒进行raa扩增得到raa扩增产物；

7、cas12a-crrna酶切反应混合液：lba cas12a，nebuffertm r2.1，crrna，fq-ssdna或fb-ssdna；

8、将raa扩增产物加入到cas12a-crrna酶切反应混合液中检测；检测一或检测二均可；

9、检测一为基于cas12a-fq的特异性检测：将上述所得raa扩增产物加入到含fq-ssdna的cas12a-crrna酶切反应混合液中，37℃下，通过荧光定量qpcr仪检测荧光信号，每一分钟收集一次信号，共1小时；或者等反应结束后，直接在蓝光或凝胶成像仪紫外下查看；

10、检测二为基于cas12a-lfa的检测：将上述所得raa扩增产物加入到含fb-ssdna的cas12a-crrna酶切反应混合液中，37℃条件下反应1小时后，将100ul hybridetect assaybuffer(twistdx)加入到反应混合液中，混合后，室温静置5分钟；最后将侧流层析试纸条(twistdx)插入其中，1-2分钟后查看结果；

11、结果判断：

12、检测一的结果判断为，如果有释放出强烈的荧光信号，则是剧毒卡尔藻，如果没有释放出强烈的荧光信号，则不是剧毒卡尔藻；

13、检测二的结果判断为，如果侧流层析试纸条上有对照处和更上位置的测试线处共两处截留，则是剧毒卡尔藻；如果只有对照处一处被截留，则不是剧毒卡尔藻。

14、采用本发明的crrna及其raa引物对来检测，灵敏度高，当模板dna低至3.6x10-2ng(终浓度1.8pg/μl)时，仍有强烈的荧光信号产生，或上方测试线处仍有明显的条带产生。

15、采用本发明的crrna及其raa引物对来检测，特异性好，能够准确区分环沟藻(gyrodinium sp.)，比斯马特鲁姆藻(bysmatrum sp.)，东海原甲藻(prorocentrumdonghaiense)，具齿原甲藻(prorocentrum triestinum)，赤潮异湾藻(heterosigmaakashiwo)，针胞藻(fibrocapsa japonica)，塔卡藻(takayama tasmanica)，短凯伦藻(karenia brevis)，三角褐指藻(phaeodactylum sp.)，血红哈卡藻(akshiow sanguinea)，亚历山大藻(alexandrium pacificum)，斯氏藻(scrippsiella sp.)，米氏凯伦藻(kareniamikimotoi)，剧毒卡尔藻-株系a(karlodinium veneficum)和剧毒卡尔藻-株系b(karlodinium veneficum)。

技术特征：

1.一种用于快速检测剧毒卡尔藻的crrna及其raa引物对，其特征在于，所述crrna的序列如seq id no:9所示，raa引物对的序列如seq id no:5和seq id no:6所示。

2.一种用于快速检测剧毒卡尔藻的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的crrna及其raa引物对序列。

3.如权利要求2所述的用于快速检测剧毒卡尔藻的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种用于快速检测剧毒卡尔藻的crRNA及其RAA引物对。所述crRNA的序列如SEQ ID NO:9所示，RAA引物对的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。用提供的crRNA及其RAA引物对来检测剧毒卡尔藻的方法简单、快速、灵敏度高、特异性强。

技术研发人员：李荣茂,王路,潘非斐,李聪,吴隐生,陈建明
受保护的技术使用者：闽江学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23