一种ATP驱动适配体探针组合及其应用

本发明涉及细胞检测，尤其是涉及一种atp驱动适配体探针组合及其应用。

背景技术：

1、核酸适配体是具有15-60个碱基的特殊三维结构的rna或dna寡核苷酸单链，具有特异性和亲和力，能与靶分子结合，增加递药系统靶向性。目前适配体主要用于靶向细胞膜外的蛋白受体，通过抑制或激活受体信号通路来调控细胞行为，包括增殖、分化、细胞凋亡等。相关技术中，研究人员开发了各种基于适配体的探针已被用来检测癌细胞，使得适配体在检测方面取得了重大进展，但这些适配体探针的检测灵敏度有限，因此开发适配体探针信号放大策略受到越来越多的关注。

2、相关技术中，通过如杂交链反应(hcr)、催化发夹组装、滚环扩增(rca)、聚合酶链式反应等能够有效放大探针信号，且这些技术在生物检测方面表现出良好的检测性能。有报道开发了一种细胞外atp激活的杂交链式反应，适配体探针识别并靶向单个受体后，在atp的激动下触发链反应扩大荧光信号，用于检测癌细胞。此外还有研究者构建了一个三维dna逻辑门纳米机器，通过双特异性识别靶向过表达的肿瘤标志物。然而这些研究存在一定的局限性，如适配体检测探针的构建过程复杂，检测结果重复性差，并且如果探针是通过与触发点结合后直接被动启动检测，则触发点不能被精确控制，同时还有可能会增大检测结果假阳性的概率。

3、基于此，亟需寻求一种简便高效的核酸适配体检测探针，以降低检测结果假阳性的概率，提高癌症早期诊出率。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种适配体探针组合，能够利用细胞外atp激活并发生链置换杂交反应，可用于特异性检测癌细胞。

2、本发明还提出了一种检测试剂盒。

3、本发明还提出了一种用于筛选和/或识别肿瘤细胞的产品。

4、本发明还提出了一种非诊断目的地定性和/或定量检测靶细胞的方法。

5、本发明还提出了一种细胞检测系统。

6、本发明的第一方面，提供了一种适配体探针组合，包括：探针h1、探针h2、atp适配体单链和猝灭链单链；

7、所述探针h1的5’端开始依次包含a1区域、b1区域和c1区域，其中：

8、所述a1区域为靶向结合受体1的核酸适配体序列；

9、所述b1区域为猝灭序列；

10、所述c1区域为atp适配体反向互补序列，所述c1区域的序列与所述atp适配体单链部分或完全互补配对；

11、所述h2的5’端开始依次包含a2区域、b2区域和c2区域，其中：

12、所述a2区域为与所述c1区域的部分或全部序列反向互补的序列；

13、所述b2区域为所述猝灭序列的反向互补序列，所述b2区域的序列与所述猝灭链单链互补配对，所述b2区域的3’端修饰有荧光基团，所述猝灭链单链的5’端修饰有猝灭基团；

14、所述c2区域为靶向结合受体2的核酸适配体序列；

15、所述靶向结合受体1与所述靶向结合受体2互不相同。

16、根据本发明实施例的适配体探针组合，至少具有如下有益效果：

17、(1)本发明的适配体探针组合能够在细胞外atp驱动下发生链置换杂交反应进行双特异性检测癌细胞类型，具体地，其检测的癌细胞类型取决于适配体荧光探针1和适配体荧光探针2上的受体适配体，如检测乳腺癌细胞时，其可以选自her2适配体和igf2r适配体，在对两种受体的特异性识别作用下，能够大大降低检测结果假阳性的概率，有助于癌症的早期诊出率。

18、(2)本发明的适配体探针组合结构简单，制备成本低，可控性强，且检测过程耗时短，将所需检测探针和细胞混合半小时内即可通过仪器检测得到结果，此外，本发明的适配体探针组合适用性广，在检测不同的癌细胞时，仅需要改变相应的适配体和受体结合部分的序列即可轻松实现各种癌细胞检测，在临床诊断中显示巨大的潜力。

19、另能够理解的是，本发明中所指代的猝灭序列是指能够与3’端修饰荧光基团的序列互补的序列。所述“互补配对”是指核酸分子中各核苷酸残基的碱基按a与t、g与c的对应关系互相以氢键相连。

20、在本发明的一些实施方式中，所述猝灭序列的长度约为10～25bp；优选地，所述长度为12～20bp。

21、在本发明的一些实施方式中，所述atp适配体单链的核苷酸序列如seq id no.2所示。

22、在本发明的一些实施方式中，所述猝灭链单链的核苷酸序列如seq id no.4所示。

23、在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团选自tamra、fam、cy3、cy5中的任一种。

24、在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团选自dabcyl、bhq1、bhq2、bhq3中的任一种。

25、在本发明的一些实施方式中，所述靶向结合受体1和所述靶向结合受体2为靶细胞特异性表达受体。

26、在本发明的一些实施方式中，所述靶细胞选自乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、淋巴癌细胞、卵巢癌细胞、免疫细胞中的任一种。

27、在本发明的一些实施方式中，所述靶向结合受体1和所述靶向结合受体2选自her2和igf2r中的一种。

28、在本发明的一些实施方式中，所述靶细胞为乳腺癌细胞，所述靶向结合受体1为her2，所述靶向结合受体2为igf2r。

29、在本发明的一些实施方式中，所述her2的核酸适配体序列为：

30、5’-agcgtcgaataccactacacaccacatccgtcttactccccaattacagaccacgagctccattag-3’(seq id no.7)。

31、在本发明的一些实施方式中，所述igf2r的核酸适配体序列为：

32、5’-gggcgcgtagatgacgagcagtcctaacatcgtttaggac-3’(seq id no.8)。

33、在本发明的一些实施方式中，所述探针h1的核酸适配体序列如seq id no.1所示。

34、在本发明的一些实施方式中，所述探针h2的核酸适配体序列如seq id no.3所示。

35、本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，包含第一方面任一项所述的适配体探针组合。

36、本发明的第三方面，提供了一种用于筛选和/或识别肿瘤细胞的产品，包含第一方面任一项所述的适配体探针组合。

37、本发明的第四方面，提供了一种非诊断目的地定性和/或定量检测靶细胞的方法，包括以下步骤：

38、将第一方面任一项所述的适配体探针组合与待测细胞、atp混合，经孵育后，根据荧光信号强度定性或定量所述待测细胞。

39、根据本发明实施例的方法，至少具有如下有益效果：采用本发明的适配体探针组合对靶细胞进行定性和/或定量，其方法简单，整个检测过程中所涉及到的试剂价格便宜、耗时短，将所需适配体探针组合和细胞混合半小时内即可通过仪器检测得到结果，能够实现“一锅法”检测。

40、在本发明的一些实施方式中，所述atp的终浓度为0.01～100mm。优选地，所述atp的终浓度为0.01～30mm。

41、在本发明的一些实施方式中，所述孵育的温度为37±5℃。优选地，所述孵育的温度为37±2℃。

42、在本发明的一些实施方式中，所述孵育的时间为5～120min。优选地，所述孵育的时间为10～90min。

43、本发明的第五方面，提供一种细胞检测系统，包含第一方面任一项所述的适配体探针组合和/或第二方面所述检测试剂盒，以及检测装置。

44、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述。

技术特征：

1.一种适配体探针组合，其特征在于，包括：探针h1、探针h2、atp适配体单链和猝灭链单链；

2.根据权利要求1所述的适配体探针组合，其特征在于，所述atp适配体单链的核苷酸序列如seq id no.2所示；

3.根据权利要求1所述的适配体探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自tamra、fam、cy3、cy5中的任一种；

4.根据权利要求1所述的适配体探针组合，其特征在于，所述靶向结合受体1和所述靶向结合受体2为靶细胞特异性表达受体；

5.根据权利要求4所述的适配体探针组合，其特征在于，所述her2的核酸适配体序列如seq id no.7所示；

6.根据权利要求5所述的适配体探针组合，其特征在于，所述探针h1的核酸适配体序列如seq id no.1所示；

7.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的适配体探针组合。

8.一种用于筛选和/或识别肿瘤细胞的产品，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的适配体探针组合。

9.一种非诊断目的地定性和/或定量检测靶细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种细胞检测系统，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的适配体探针组合或权利要求7所述检测试剂盒，以及检测装置。

技术总结
本发明公开了一种ATP驱动适配体探针组合及其应用，该适配体探针组合包括探针H1、探针H2、ATP适配体单链和猝灭链单链；探针H1的5’端开始依次包含a1区域、b1区域和c1区域，a1区域为靶向结合受体1的核酸适配体序列，c1区域的序列与ATP适配体单链部分或完全互补配对；H2的5’端开始依次包含a2区域、b2区域和c2区域，b2区域的序列与猝灭链单链互补配对，c2区域为靶向结合受体2的核酸适配体序列。该适配体探针组合能够在细胞外ATP驱动下发生链置换杂交反应进行双特异性检测癌细胞类型，检测准确性高，且适用性广，仅需要改变相应的核酸适配体序列即可实现各种癌细胞检测，在临床诊断中显示巨大的潜力。

技术研发人员：李浩,卢俊君,谢智勇,黄子洪
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23