一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法

本发明属于化工合成领域，涉及一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法。

背景技术：

1、异色满酮骨架结构广泛存在于具有生物活性的天然产品和药物结构中，其骨架结构具有的天然活性包括抗菌、抗疟疾和抗炎活性(nat.prod.res,2020(1):1-6.)，其部分天然产品和药物结构如下所示。同时，异色满酮类化合物也是重要的有机合成中间体，在合成医药相关化合物以及某些复杂的天然产物方面有许多应用(mar.drugs,2017,(15):359-376.)。

2、

3、因此，异色满酮骨架结构的构建受到了极大的关注，寻找绿色且高效的异色满酮结构的有机合成方法引起了科学界的浓厚兴趣。目前异色满酮类化合物的合成主要是化学合成且需要有机催化剂或金属催化剂的催化，比如使用钙(ii)盐或三氟化亚胺在六氟异丙醇中对未活化的烯基羧酸分子进行分子内酯化；或在光催化的条件下使用分子碘和一种有机催化剂的协同催化将c-h键直接转化为c-o键；使用氧化银和甲酸进行催化得到异色满酮类化合物，如下所示：

4、

5、参见现有技术n.denizot et al.,divergent oxidative couplings betweenindoles and2,3-dihydroxybenzoic acid derivatives for the biomimetic synthesisof voacalgine a and bipleiophylline,synthesis 2018,50,4229–4242，现有技术d.lachkar et al.,unified biomimetic assembly of voacalgine a andbipleiophylline via divergent oxidative couplings,nature chemistry,vol 9,august 2017。

6、在前述的传统的合成方法中，通常需要有机催化剂或金属催化剂进行催化，这些反应通常需要相对苛刻的条件，严重损害环境友好，且反应时间较长，工艺较为复杂，这都极大地限制了这些方法的实用性。这些缺陷不仅带来了安全和环境隐患，还给工业放大生产带来了较高的成本。因此，急需开发一种不需要金属氧化剂的、适合放大生产的绿色工艺。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明公开了一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法，包括如下步骤：

4、2,3-二羟基苯甲酸与1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i在多铜氧化酶的作用下进行环合反应，制得异色满酮类化合物ii；

5、其中，

6、所述1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i的结构式如式i所示，所述异色满酮类化合物ii的结构式如式ii所示：

7、

8、其中，r1、r2独立地选自氢、卤素、给电子基团或吸电子基团。

9、在一些实施例中，优选地，r1选自氢、氯、溴、甲基或甲氧基；r2选自氢或甲基。

10、在一些实施例中，所述多铜氧化酶为cueo，其氨基酸序列如seq id no.2所示，对应地，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、在一些实施例中，所述2,3-二羟基苯甲酸与1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i的摩尔比为0.3～1.0：0.075～0.500；所述环合反应，反应温度为10～40℃。

12、在一些实施例中，优选地，所述2,3-二羟基苯甲酸与1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i的摩尔比为0.5：0.075～0.250，进一步优选为0.5：0.125～0.250，更进一步优选为0.5：0.125；所述环合反应，反应温度为25～40℃，进一步优选为25℃。

13、在一些实施例中，所述多铜氧化酶以含有多铜氧化酶的细胞裂解物的形式存在；

14、所述含有多铜氧化酶的细胞裂解物按照如下方法制备得到：

15、将重组大肠杆菌bl21(de3)-cueo接种至培养基中经iptg和cuso4诱导培养，得到的发酵液经超声、离心，去上清，即得含有多铜氧化酶的细胞裂解物；

16、所述2,3-二羟基苯甲酸与所述含有多铜氧化酶的细胞裂解物的摩尔质量比为0.1～5.0mmol：1～2g。

17、在一些实施例中，优选地，所述2,3-二羟基苯甲酸与所述含有多铜氧化酶的细胞裂解物的摩尔质量比为1.0mmol：1～2g，进一步优选为1.0mmol：2g。

18、其中，所述的重组大肠杆菌bl21(de3)-cueo根据现有技术(l.zhang,h.cui,z.zou,t.m.garakani,c.n.henriquez,b.jooyeh,u.schwaneber,angew.chem.int.ed.2019,58,4562–4565.)制备得到。

19、其中，优选地，所述含有多铜氧化酶的细胞裂解物可参照现有技术(guo,huan,etal."expanding the promiscuity of a copper-dependent oxidase forenantioselective cross-coupling of indoles."angewandte chemie internationaledition 62.16(2023))制备得到，也可以按照如下方法制备得到：

20、将甘油储备菌株(重组大肠杆菌bl21(de3)-cueo)接种到装有培养基(培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素)的摇瓶中，预培养至生长饱和。然后，将种子培养液接种到新的培养瓶中，并加入培养基，培养至od 600值达到0.8，加入iptg和cuso4以诱导酶的表达，继续培养。培养结束后超声破碎，离心，去上清，得到含有多铜氧化酶cueo的细胞裂解物。

21、其中，进一步优选地，所述含有多铜氧化酶的细胞裂解物按照如下方法制备得到：

22、将5μl甘油储备菌株(重组大肠杆菌bl21(de3)-cueo)接种到装有5ml lb培养基(lb培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素)的摇瓶中，在37℃摇床中预培养22小时至生长饱和。然后，将5ml种子培养液接种到新的2l培养瓶中，并加入1l lb培养基，在37℃下培养至od 600值达到0.8，加入终浓度为0.2mm iptg和1.5mm cuso4以诱导酶的表达，在30℃、900rpm下培养18h。培养结束后超声破碎15min，离心，去上清，得到含有多铜氧化酶cueo的细胞裂解物。

23、在一些实施例中，采用常规反应器或微流场反应装置制备异色满酮类化合物ii。

24、在一些实施例中，优选地，采用微流场反应装置制备异色满酮类化合物ii，包括如下步骤：

25、将2,3-二羟基苯甲酸、1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i、第一溶剂混合，得到溶液a；将含有多铜氧化酶的细胞裂解物与缓冲液混合，得到溶液b；将溶液a、溶液b分别同时泵入微流场反应装置的微流场反应器中进行环合反应，制得异色满酮类化合物ii。

26、在一些实施例中，所述第一溶剂为乙腈、四氢呋喃、甲苯和乙酸乙酯中的任意一种或几种的组合；所述缓冲液为pbs缓冲液和tris缓冲液中的任意一种或两种的组合；所述缓冲液的ph为5～8。

27、在一些实施例中，优选地，所述第一溶剂为乙腈和乙酸乙酯中的任意一种或两种的组合，进一步优选为乙腈；所述缓冲液为pbs缓冲液或tris缓冲液，进一步优选为pbs缓冲液；所述缓冲液的ph为7～8，进一步优选为7。

28、其中，所述缓冲液的离子浓度优选为0.01m。

29、在一些实施例中，所述溶液a中，2,3-二羟基苯甲酸的浓度为0.0125～0.6250mmol/ml；所述溶液b中，含有多铜氧化酶的细胞裂解物的浓度为0.0625g/ml～0.2500g/ml；所述溶液a泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.02～0.40ml/min；所述溶液b泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.02～0.40ml/min；所述环合反应的反应停留时间为4.5～90min。

30、在一些实施例中，优选地，所述溶液a中，2,3-二羟基苯甲酸的浓度为0.0125～0.100mmol/ml，进一步优选为0.0125～0.0625mmol/ml，更进一步优选为0.0312～0.0625mmol/ml，最优选为0.0625mmol/ml。

31、在一些实施例中，优选地，所述溶液b中，含有多铜氧化酶的细胞裂解物的浓度为0.0625g/ml～0.1500g/ml，进一步优选为0.0625g/ml～0.1250g/ml，更进一步优选为0.1250g/ml。

32、在一些实施例中，优选地，所述溶液a泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.05～0.20ml/min，进一步优选为0.09～0.15ml/min，更进一步优选为0.12ml/min。

33、在一些实施例中，优选地，所述溶液b泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.05～0.20ml/min，进一步优选为0.09～0.15ml/min，更进一步优选为0.12ml/min。

34、在一些实施例中，优选地，所述环合反应的反应停留时间为10～40min，进一步优选为10～25min，更进一步优选为13～20min，最优选为15min。

35、在一些实施例中，所述微流场反应装置包括第一注射泵、第二注射泵、微流场反应器以及接收器；所述第一注射泵、所述第二注射泵分别通过连接管道并联连接至微流场反应器上；所述微流场反应器与所述接收器通过连接管道连接。

36、其中，所述微流场反应器为三通阀式微流场反应器，体积为优选为0.5～40ml，进一步优选为0.5～25ml，更进一步优选为1.0～6.0ml，最优选为3.6ml；所述3.6ml的三通阀式微流场反应器的管道内径为2mm，管道外径为4mm。

37、其中，所述微流场反应器的温度，根据需要可使用水浴控制。

38、其中，所述环合反应结束后的反应流出液经萃取，干燥，浓缩，柱层析得到异色满酮类化合物ii；所述柱层析的洗脱剂为乙酸乙酯与石油醚按照体积比1:1-1:20的混合溶剂。

39、有益效果：

40、(1)与现有技术相比，本发明提供的采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法，相较于传统的有机催化剂或金属催化剂，本发明使用多铜氧化酶为催化剂，绿色环保，节能高效，生产成本低，毒性和污染小，产品质量好，适于推广应用。且直接使用细胞裂解液进行催化相较于纯化后的酶制剂来说，大大地简化了酶的提纯工艺，提高了效率。

41、(2)进一步地，本发明采用微流场反应器使用多铜氧化酶催化直接进行c-c双键氧化并进行[4+2]环化反应偶联制备异色满酮类化合物，由于微流场反应器高传质高传热的特性，副反应少，反应时间大大缩短，解决现有技术存在的反应时间长，反应条件苛刻及需要有机催化剂或金属催化剂催化的问题，由在常规反应器上的96h时间缩短至15min。

技术特征：

1.一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，r1选自氢、氯、溴、甲基或甲氧基；r2选自氢或甲基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶为cueo，其氨基酸序列如seq id no.2所示，对应地，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2,3-二羟基苯甲酸与1,2,3,4-四氢咔唑类化合物i的摩尔比为0.3～1.0：0.075～0.500；所述环合反应，反应温度为10～40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶以含有多铜氧化酶的细胞裂解物的形式存在；

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，采用常规反应器或微流场反应装置制备异色满酮类化合物ii。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用微流场反应装置制备异色满酮类化合物ii，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一溶剂为乙腈、四氢呋喃、甲苯和乙酸乙酯中的任意一种或几种的组合；所述缓冲液为pbs缓冲液和tris缓冲液中的任意一种或两种的组合；所述缓冲液的ph为5～8。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述溶液a中，2,3-二羟基苯甲酸的浓度为0.0125～0.6250mmol/ml；所述溶液b中，含有多铜氧化酶的细胞裂解物的浓度为0.0625g/ml～0.2500g/ml；所述溶液a泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.02～0.40ml/min；所述溶液b泵入微流场反应装置的微流场反应器中的流速为0.02～0.40ml/min；所述环合反应的反应停留时间为4.5～90min。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微流场反应装置包括第一注射泵、第二注射泵、微流场反应器以及接收器；所述第一注射泵、所述第二注射泵分别通过连接管道并联连接至微流场反应器上；所述微流场反应器与所述接收器通过连接管道连接。

技术总结
本发明属于化工合成领域，涉及一种采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法。2,3‑二羟基苯甲酸与1,2,3,4‑四氢咔唑类化合物I在多铜氧化酶的作用下进行环合反应，制得异色满酮类化合物II。与现有技术相比，本发明提供的采用多铜氧化酶氧化[4+2]环合合成异色满酮类化合物的方法，相较于传统的有机催化剂或金属催化剂，本发明使用多铜氧化酶为催化剂，绿色环保，节能高效，生产成本低，毒性和污染小，产品质量好，适于推广应用。且直接使用细胞裂解液进行催化相较于纯化后的酶制剂来说，大大地简化了酶的提纯工艺，提高了效率。

技术研发人员：郭凯,王舒展,方正,张瑞,周千喜,胡玉静
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23