一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽及其应用
本发明属于生物化学，涉及一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，本发明同时还涉及该类抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
背景技术：
1、自从1928年微生物学家alexander fleming发现了青霉素的抑菌作用后，大量的抗生素被开发使用，开启了抗生素治疗的黄金时代，使以往致命的传染病不再战无不胜(chem soc rev.2021,50(8):4932-4973)。抗生素是挽救了无数的生命，是20世纪医学领域的重大突破之一(who.2017)。尽管抗生素拯救了无数的生命，但由于在抗生素的使用中缺乏合理的方案，使细菌对抗生素产生了耐药性和抗药性，出现了多药耐药和泛耐药的“超级细菌”(science.1992,257(5073):1064-1073)。仅2019年，细菌耐药造成全球约500万人死亡(lancet.2022,399(10325):629-655)，而这一威胁还在逐年增加，预计至2050年，抗生素耐药将导致约3亿人过早死亡(npj antimicrob resist.2023,1(1):17-38)。因此，开发新型抗菌剂以应对全球耐药危机迫在眉睫。
2、抗菌肽(amps，antimicrobial peptides)广泛分布于自然界中，几乎对所有生物的先天免疫起着重要作用，能帮助生物体抵制外来微生物入侵(front cell infectmicrobiol.2021,11:668632-668654)。amps通常具有阳离子和两亲性结构，能够与细菌膜上的亲水基团和膜结构产生强烈的相互作用，展现出广谱抗菌活性，对真菌及病毒等微生物也具有较好的抗性。amps可通过作用于细菌细胞壁、细胞膜、靶向细胞内靶点、抑制生物膜生成或进行免疫调节等多种方式发挥抗菌活性(molecules.2022,27(9):2675-2703)。因amps具有多种作用机制，不易使细菌产生抗性，被认为是治疗“超级细菌”的新型抗生素的潜在来源(nat rev microbiol.2023,4627-4740)。
3、在天然分离的amps中，由微生物非核糖体合成的脂肽类抗菌肽在临床抗菌中发挥着重要的作用，如临床常见的多粘菌素(jama.2018,320(14):1455-1463)、达托霉素(drugs.2004,64(4):445-455)、杆菌肽(j infect.2007,55(3):205-213)等均属于脂肽类抗菌肽。此外，许多天然分离的脂肽也均具有较好的抗菌活性，如天然环脂肽pe2(bmcmicrobiol.2013,13:87-94)、polypeptin a(j med chem.1976,19(10):1228-1231)和brevicidine b(front microbiol.2021,12:693117)等。对比这些脂肽类抗菌肽的结构，可发现它们分子中大多同时含有l型和d型氨基酸残基。故基于这一现象，本发明设计了将l型和d型氨基酸残基对称分布于肽链中的全新结构的镜像二聚结构。本发明提出的镜像二聚抗菌肽设计理念为抗菌肽的从头设计提供了新的思路和方法，同时本发明提出的镜像二聚抗菌肽模板有助于进行广泛的药物筛选，且便于对抗菌肽进行构效关系研究。
技术实现思路
1、本发明的目的之一是提供一类设计简单、易于合成、制备成本低、抗菌活性强且具有低溶血活性和低耐药发生性的镜像二聚广谱抗菌肽。
2、本发明的另一目的是提供上述具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
3、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
4、一、一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽的结构设计
5、本发明涉及的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其分子中同时存在l型和d型氨基酸，且l型氨基酸和d型氨基酸对称分布，结构通式为：
6、yyk’k’k’k’yy-nh2，记为：m-y；
7、或yyxk’k’k’k’xyy-nh2，记为：m-yx；
8、或xyyk’k’k’k’yyx-nh2，记为：m-yx-1；
9、或yyk’k’xxk’k’yy-nh2，记为：m-yx-2；
10、或k’k’xyyyyxk’k’-nh2，记为：m-yx-3；
11、或yk’yk’xxk’yk’y-nh2，记为：m-yx-4；
12、或yyxk’k’k’k’xyy-nh2，记为：m-yx-ld；
13、或yyxk’k’k’k’xyy-nh2，记为：m-yx-dl；
14、或yyxk’k’k’k’xyy-nh2，记为：m-yx-d/l；
15、其中，y为leu或trp；x为dab，thr，glu，leu或trp；k’为dab；k’为d-dab；x为d-dab，d-thr，d-glu，d-leu或d-trp；y为d-leu或d-trp。
16、具体地，本发明所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其结构如下：
17、y-y-dab-dab-d-dab-d-dab-d-y-d-y-nh2，记为：m-y；其中，y＝leu或trp；
18、或y-y-x-dab-dab-d-dab-d-dab-d-x-d-y-d-y-nh2，记为：m-yx；其中，
19、y＝leu或trp；x＝dab，thr，glu，leu或trp；
20、或leu-trp-trp-dab-dab-d-dab-d-dab-d-trp-d-trp-d-leu-nh2，记为：m-wl-1；
21、或trp-trp-dab-dab-leu-d-leu-d-dab-d-dab-d-trp-d-trp-nh2，记为：m-wl-2；
22、或dab-dab-leu-trp-trp-d-trp-d-trp-d-leu-d-dab-d-dab-nh2，记为：m-wl-3；
23、或trp-dab-trp-dab-leu-d-leu-d-dab-d-trp-d-dab-d-trp-nh2，记为：m-wl-4；
24、或trp-d-trp-leu-d-dab-dab-d-dab-dab-d-leu-trp-d-trp-nh2，记为：m-wl-ld；
25、或d-trp-trp-d-leu-dab-d-dab-dab-d-dab-leu-d-trp-trp-nh2，记为：m-wl-dl；
26、或d-trp-d-trp-d-leu-d-dab-d-dab-dab-dab-leu-trp-trp-nh2，记为：m-wl-d/l。
27、优选地，本发明具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽为溶血活性较低的m-w、m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-2、m-wl-3、m-wl-4、m-wl-dl、m-wl-ld或m-wl-d/l；更优选地，本发明所述具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽为溶血活性更低的m-w、m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-3或m-wl-d/l；最优选地，本发明具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽为抗菌活性最优的m-wl-d/l。
28、二、一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用
29、1、体外抗菌实验
30、采用经典微量二倍稀释法测定上述抗菌肽对革兰氏阳性菌株(s.aureus atcc25923，b.subtilis atcc 23857，s.epidermidis atcc 12228，e.faecalis atcc 29212)和革兰氏阴性菌株(e.coli atcc 25922，k.pneumoniae atcc 700603，p.aeruginos atcc27853，a.baumannii atcc 19606)的最低抑菌浓度(mic)，评估其抗菌活性。具体实验方法为：用mh肉汤培养基将生长至对数中期的实验细菌稀释成1×106cfu/ml的细菌悬浮液；将抗菌肽溶解于无菌水，经二倍稀释法用mh肉汤配制成一系列不同浓度的抗菌肽类似物溶液，再将其与等体积细菌悬浮液混合，加入96孔培养板中37℃孵育18h后观察，以无明显细菌生长的最小浓度为抗菌肽类似物的最低抑菌浓度(mic)。以抗生素多粘菌素b作为阳性对照，平行重复三次，结果如表1。
31、表1本发明低毒广谱镜像二聚抗菌肽对抗标准菌株的最低抑菌浓度
32、
33、表1结果表明，本发明所设计的镜像二聚抗菌肽对常见实验菌株均具有较强抗菌活性，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。
34、2、溶血实验
35、取健康小鼠的新鲜血液，1000g，4℃，离心10min，弃去上层血浆，用生理盐水清洗下层血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，100μl/孔加入96孔板中；将抗菌肽类似物溶解于生理盐水中，用二倍稀释法配制成不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，取100ul/孔上清液至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值。生理盐水组作阴性对照，1％ tritonx-100作阳性对照，根据公式：hemolysis rate(％)＝[(od490nmpeptides-od490nmnegativecontrol)/(od490nmpositivecontrol-od490nmnegativecontrol)]×100％，计算溶血率，结果如图1。
36、图1结果表明，本发明的镜像二聚肽m-w、m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-2、m-wl-3、m-wl-4、m-wl-dl、m-wl-ld和m-wl-d/l均具有较低的溶血毒性，其中，m-w，m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-3、和m-wl-d/l在最高检测浓度(256μm)的溶血率低于10％，m-wl-2、m-wl-4、m-wl-dl和m-wl-ld在256μm的溶血率虽然高于10％，但其溶血发生浓度远大于发挥抗菌活性的有效浓度。总体来说，本发明合成的抗菌肽类似物溶血毒性低，安全性较高。
37、3、诱导细菌耐药实验
38、选取本发明的优选抗菌肽m-wl-d/l(溶血毒性低，抗菌活性最优)，测定其对e.coli atcc 25922和s.aureus atcc 25923的最小抑菌浓度mic，然后将其1/2×mic组分别接种于新的mh培养基中培养至对数期，测定抗菌肽在新菌液中的mic，以此类推，以相同的方法重复20次，观察mic值的变化，以反映抗菌肽诱导细菌产生耐药特性的能力。抗生素多粘菌素b、庆大霉素和利福平做对照药，结果如图2。
39、图2结果表明，在连续传代20代后，庆大霉素容易引起e.coli atcc 25922和s.aureus atcc 25923产生耐药性，而本发明的镜像二聚抗菌肽m-wl-d/l不易诱导细菌耐药发生。
40、4、对临床耐药菌的mic测定
41、采用上述经典微量二倍稀释法测定本发明的优选抗菌肽m-wl-d/l对临床耐药菌的最低抑菌浓度(mic)，以抗生素多粘菌素b，庆大霉素，美罗培南，万古霉素以及甲氧西林作为阳性对照，平行重复三次，结果如表2。
42、表2本发明优选抗菌肽m-wl-d/l对抗临床耐药菌株的最低抑菌浓度
43、
44、表2结果表明，m-wl-d/l对12种临床多药耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抗菌活性。
45、本发明相较于现有技术的有益效果在于：
46、1、本发明首次提出镜像二聚的设计理念，合成的多肽结构新颖、设计简单，制造成本低，易于临床抗菌药物筛选。
47、2、本发明的镜像二聚抗菌肽具有广谱抗菌活性和低的溶血毒性。
48、3、与传统抗生素相比，本发明的镜像二聚抗菌肽具有低的耐药发生性。
49、4、本发明的镜像二聚抗菌肽对临床耐药菌有较好的抗菌活性。
50、因此，本发明所设计的镜像二聚抗菌肽在制备临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
技术特征：
1.一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽分子中同时存在l型和d型氨基酸，且l型氨基酸和d型氨基酸对称分布，其结构通式为：
2.如权利要求1所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述镜像二聚低毒广谱抗菌肽为m-w、m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-2、m-wl-3、m-wl-4、m-wl-ld、m-wl-dl或m-wl-d/l。
3.如权利要求2所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述镜像二聚低毒广谱抗菌肽为m-w、m-wk’、m-wl、m-wl-1、m-wl-3或m-wl-d/l。
4.如权利要求3所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述镜像二聚低毒广谱抗菌肽为m-wl-d/l。
5.如权利要求1-4任一项所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
6.如权利要求5所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所述抗菌药物抑制的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
7.如权利要求6所述的一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡糖球菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌或粪链球菌，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌。
技术总结
本发明公开了一类具有镜像二聚结构的低毒广谱抗菌肽及其应用。基于许多天然脂肽中同时含有L型和D型氨基酸这一现象，本发明通过将L型和D型氨基酸对称分布于肽链中设计了镜像二聚抗菌肽。所述抗菌肽的结构通式为YY(X)K’K’
技术研发人员：倪京满,王锐,张景莹
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23