一种提高锦鲤孵化效率的方法

本发明涉及鱼类繁殖，具体涉及一种提高锦鲤孵化效率的保存方法。

背景技术：

1、锦鲤（ cyprinus carpio）是一种高档观赏鱼，有“水中活宝石”的美称。锦鲤色彩鲜艳、变化多端，游姿飘逸，观赏价值高，被称作“会游泳的艺术品”。在中国，锦鲤被视为和平、友谊的象征，它不仅给人以美的享受，还寓意吉祥欢乐、繁荣幸福，中国自古也有“鲤鱼跳龙门”之说，寓意人飞黄腾达，所以深受人们喜爱，所以被很多人饲养于庭院里或者水族箱中，是十分受欢迎的鱼类宠物。锦鲤作为一种鱼类资源，具有多种品种和亚种。

2、冷冻保存锦鲤精液可以保存不同品种的遗传信息，防止品种的丢失和基因多样性的减少，这有助于维护锦鲤种群的健康和外表。由于物种的差异，现有技术中不同的冷冻液中稀释剂、保护剂，对于不同的鱼的效果存在天差地别，例如《“圆口铜鱼精子冷冻保存技术研究”，刘光霞，上海海洋大学硕士学位论文》中采用了3种保护剂dmf、dmso和meth对圆口铜鱼进行冷冻保存，结果是 dmso 组的精子活率显著低于 meth、dmf 组。但是在《“斑鳜精液超低温冷冻保存及其效果分析”，周磊等，中国水产科学 2014 年 3 月》中dmso对斑鳜精子冻后存活率明显优于dmf。

3、目前有方案针对鲤科精子冻存，但没有专门针对锦鲤精子的冷冻保存方案，使用针对其他鲤科鱼类的方案冻存锦鲤精子效果并不理想，使用鱼类精子超低温冷冻保存简易方法（专利号cn101088511a）冻存锦鲤精子14天后，精子存活率只有12.41%，因此为了实现锦鲤精子的冷冻保存，有必要开发新的冷冻保存液和冷冻保存方案。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对冻存后的锦鲤精子存活率、受精及孵化效率低的问题，提供一种适用于锦鲤精子的冷冻保存液。

2、本发明另一目的在于提供一种提高锦鲤精子孵化率的方法。采用上述冷冻保存液结合冷冻保存步骤，有效提高了锦鲤精子冷冻保存后的精子存活率，以及复苏后的精子的受精率和孵化率。

3、本发明目的通过如下技术方案实现：

4、一种适用于锦鲤精子的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液是以稀释液、渗透性保护剂和非渗透性添加剂组成，其中稀释液为d17，非渗透保护剂为二甲亚砜（dmso），所述非渗透添加剂为蔗糖和海藻糖组成。

5、进一步，所述冷冻保存液中dmso为8~12%，非渗透添加剂中蔗糖为3~4%，海藻糖为0.8~1.2%，其余为稀释液d17。

6、进一步，所述稀释液d17具体是由nacl、kcl和葡萄糖和超纯水组成，1l稀释液中含有9gnacl、5gkcl和15g葡萄糖，其余为超纯水。

7、进一步，冷冻保存液中各组分浓度为8.1g/l nacl、0.45g/l kcl和13.5g/l葡萄糖，80~120ml/l dmso、3~4g/l蔗糖、0.8~1.2g/l海藻糖。

8、一种提高锦鲤精子冷冻保存后的孵化率的方法，包括锦鲤精子的冷冻保存，其特征在于：所述冷冻保存包括配制冷冻保存液、精子采集、稀释分装和降温冷冻步骤，其中配制冷冻保存液是按照1l冷冻保存液中含有8.1gnacl、0.45g kcl、13.5g葡萄糖，80~120mldmso、3~4g蔗糖和0.8~1.2g海藻糖，其余为超纯水组成。

9、进一步，所述稀释分装是使用移液枪将精液吸取与冷冻保存液混合稀释，分装加入冷冻保存管中，具体是精液与冷冻保存也按照体积比为1：8~10进行混合稀释，按照45~55μl为单位进行分装。

10、进一步，所述降温冷冻是将分装了稀释精液的冷冻保存管在4℃下平衡5min，然后在液氮上方约10cm处平衡15min左右，最后置于液氮中保存。

11、一种提高锦鲤精子冷冻保存后的孵化率的方法，包括锦鲤精子的冷冻保存，其特征在于，包括如下步骤：

12、（1）配制冷冻保存液：以配方为8.1g/lnacl，0.45g/lkcl，13.5g/l葡萄糖，3g/l蔗糖，1g/l海藻糖，100ml/ldmso，称取nacl、kcl、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和dmso加入超纯水，震荡混合均匀后，与37℃水浴30min，得冷冻保存液，置于4℃下保存备用；

13、（2）精子采集：在容器中倒入1l曝气水，中加入5mlms-222鱼用安定剂，将一条锦鲤进行麻醉处理， 将鱼体表面以及泄殖孔附近水分擦干，用湿布包裹鱼头部，将鱼尾与鱼头握住，将泄殖孔方向朝下，将200 μl移液枪枪头悬于泄殖孔上，用手沿着鱼腹部到泄殖孔方向按压，使精液流出，使用移液枪吸取精液，移至1.5ml无菌管中；

14、（3）稀释分装：使用移液枪将精液吸取与冷冻保存液混合稀释，分装加入冷冻保存管中，具体是精液与冷冻保存也按照体积比为1：8~10进行混合稀释，按照45~55μl为单位进行分装；

15、（4）降温冷冻：将步骤（3）中的冷冻保存管在4℃下平衡5min，然后在液氮上方10cm处平衡15min，最后置于液氮中保存。

16、本发明具有如下技术效果：

17、本发明中通过配制出与锦鲤精子适配度极高的保存液，再结合合适的具体步骤，提高了锦鲤精子冷冻保存后的存活率，达到48.62±5.62%，同时还能保证冷冻复苏后的锦鲤精子具有较高受精率，冷冻14天和210天后的精子受精率达到63.03%和55.09%，受精后的孵化率分别高达55.15%和45.34%，保持在与鲜精（孵化率为62.34%）极为接近的孵化水平。该方法有效提高了锦鲤精子的存活率，受精率和孵化率，有效保证了不同品种的锦鲤育苗和鱼种的高效繁殖，达到了锦鲤品种的延续。

技术特征：

1.一种适用于锦鲤精子的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液是以稀释液、渗透性保护剂和非渗透性添加剂组成，其中稀释液为d17，非渗透保护剂为二甲亚砜（dmso），所述非渗透添加剂为蔗糖和海藻糖组成。

2.如权利要求1所述的一种适用于锦鲤精子的冷冻保存液，其特征在于：所述冷冻保存液中dmso质量占比为8~12%，非渗透添加剂中蔗糖质量占比为3~4%，海藻糖质量占比为0.8~1.5%，其余为稀释液d17，所述稀释液d17具体是由nacl、kcl和葡萄糖和超纯水组成，1l稀释液中含有9gnacl、5gkcl和15g葡萄糖，其余为超纯水。

3.一种适用于锦鲤精子冷冻保存方法，包括锦鲤精子的冷冻保存，其特征在于：所述冷冻保存包括配制冷冻保存液、精子采集、稀释分装和降温冷冻步骤，其中配制冷冻保存液是按照1l冷冻保存液中含有8.1gnacl、0.45g kcl、13.5g葡萄糖，80~120ml dmso、3~4g蔗糖和0.8~1.2g海藻糖，其余为超纯水组成。

4.如权利要求3所述的一种适用于锦鲤精子冷冻保存方法，其特征在于：所述稀释分装是使用移液枪将精液吸取与冷冻保存液混合稀释，分装加入冷冻保存管中，具体是精液与冷冻保存也按照体积比为1：8~10进行混合稀释，按照45~55 μl为单位进行分装。

5.如权利要求3或4所述的一种适用于锦鲤精子冷冻保存方法，其特征在于：所述降温冷冻是将分装了稀释精液的冷冻保存管在4℃下平衡5min，然后在液氮上方约10cm处平衡15min左右，最后置于液氮中保存。

6.一种适用于锦鲤精子冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
一种提高锦鲤孵化率的方法，具体是采用保存液将精子保存后，再进行受精，所述保存液是以稀释液、渗透性保护剂和非渗透性添加剂组成，其中稀释液为D17，非渗透保护剂为二甲亚砜（DMSO），所述非渗透添加剂为蔗糖和海藻糖组成。本发明中通过配制出与锦鲤精子适配度极高的保存液，再结合合适的步骤，提高了锦鲤精子冷冻保存后的存活率，达到48.62±5.62%，同时还能保证锦鲤精子具有较高受精率，保存14天后的精子受精率达到63.03%，受精后的孵化率分别高达55.15%，保持在与鲜精（孵化率为62.34%）极为接近的孵化水平。该方法有效提高了锦鲤精子的存活率，受精率和孵化率，有效保证了不同品种的锦鲤育苗和鱼种的高效繁殖，达到了锦鲤品种的延续。

技术研发人员：徐红艳,朱政
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23