一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法
本发明属于食品安全检测，具体涉及一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、沙门菌是世界卫生组织认定的一种广泛存在的食源性病原体，可通过污染鸡蛋、牛奶、肉类、水果和蔬菜进行传播，导致食源性疾病。因此，及时的发现和监测是遏制和减轻沙门菌暴发的最有效策略。
3、核酸适配体作为一种能特异性识别靶标的dna或rna，使适配体在特异性识别靶标的基础上具有核酸序列可编程、碱基互补配对、可扩增形成双链等特性，为适配体在检测领域应用提供更多的可操作空间。目前基于适配体的变构调节特性及多种核酸扩增技术已构建了多种高灵敏的沙门菌检测技术。专利cn118064442a公开了一种基于截短适配体和便携式血糖仪的沙门菌检测方法，基于抗基质干扰截短适配体，设计适配体-dna桥的复合变构探针并利用dna聚合酶的扩增和链置换作用，将复合变构探针上的dna桥挤下，最后利用蔗糖酶转变为糖浓度信号被血糖仪检测出。通过糖的信号构建与靶标的关系，实现沙门菌的检测。但是该方法没有利用循环放大技术对沙门菌的检测灵敏度较低，检出限高(200cfu·ml-1)。因此，仍需要开发高灵敏度、低检出限的沙门菌检测方法。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，本发明提出的由靶标激发的聚合酶循环扩增技术，有效结合适配体识别靶标技能和聚合物酶的dna扩增与链置换技术，实现靶标激发后自动循环扩增，实现对靶标的高灵敏、便携式定量检测。
2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
3、本发明的第一个方面，提供一种用于沙门菌检测的复合变构探针，包括复合物1和复合物2，所述复合物1由沙门菌功能适配体和引物1组成，所述复合物2由长链dna、引物2和dna桥组成；
4、所述沙门菌功能适配体的核酸序列如seq id no:1所示，所述引物1的核酸序列如seq id no:2所示，所述引物2的核酸序列如seq id no:3所示，所述dna桥的核酸序列如seqid no:4所示；
5、所述长链dna为单链dna，其核酸序列与引物1、引物2和dna桥的核酸序列互补。
6、在本发明的一些实施例中，所述长链dna的核酸序列如seq id no:5所示。
7、本发明的第二个方面，提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，包括上述的复合变构探针、dna聚合酶、蔗糖酶-dna、磁珠-dna和血糖仪。
8、在本发明的一些实施例中，所述蔗糖酶-dna的制备方法包括：
9、将sh-dna与pb缓冲液、三-(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris 2-carboxyethylphosphine，tcep)混匀，孵育，孵育完毕后，离心，得到处理后的sh-dna溶液；
10、将sulfo-smcc和蔗糖酶溶于缓冲液中，混匀，孵育，孵育完毕后，离心，洗涤，得到活化的蔗糖酶；
11、将处理后的sh-dna溶液和活化的蔗糖酶混合，孵育，孵育完毕后，离心，洗涤，得到蔗糖酶-dna。
12、在本发明的一些实施例中，所述sh-dna的核酸序列如seq id no:6所示。
13、在本发明的一些实施例中，所述磁珠-dna的准备方法包括：
14、取链霉亲和素修饰的磁珠加入缓冲液进行稀释，磁分离后，用缓冲液清洗，并用缓冲液复溶；然后，加入bio-dna孵育，孵育完成后，用缓冲液清洗并用缓冲液复溶，得到磁珠-dna。
15、在本发明的一些实施例中，所述bio-dna的核酸序列如seq id no:7所示。
16、本发明的第三个方面，提供一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，采用上述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒进行，包括如下步骤：
17、将待测样品与功能适配体链混合均匀，进行第一次孵育使功能适配体链的适配体区域识别沙门菌；孵育完成后加入引物1并混匀，进行第二次孵育；孵育完成后加入复合物2、dtnp、缓冲液、dna聚合酶、磁珠-dna，混合均匀后，得到第一溶液，进行第三次孵育；孵育完成后，磁分离，清洗，去除多余的dna链和沙门菌，收集沉淀；
18、用dna-蔗糖酶复溶所得沉淀，进行第四次孵育，孵育完成后磁分离，清洗，去除上清液，用蔗糖溶液复溶，进行第五次孵育，孵育完成后采用便携式血糖仪测定葡萄糖浓度，基于葡萄糖浓度值的变化对沙门菌进行定性或定量检测。
19、在本发明的一些实施例中，所述第一溶液中，长链与dna桥结合碱基数为23碱基；dna聚合酶浓度为270u·l-1；功能适配体与引物1浓度比例为1:1.2；磁珠浓度为4μm；功能适配体浓度1μm；长链与引物2浓度比例1:0.8；所述适配体为rou-77，其核酸序列如seq idno:8所示。
20、在本发明的一些实施例中，所述第三次孵育，孵育时间为30min。
21、在本发明的一些实施例中，建立不同浓度梯度的沙门菌和葡萄糖浓度的标准曲线，基于所述标准曲线进行沙门菌浓度的定量检测。
22、dna扩增形成双链的过程是在dna聚合酶作用下，由引物的3’端引入能和模板互补配对的碱基，从而扩增形成双链dna的过程。其中聚合酶链式反应技术(pcr)则是结合此原理进行的扩增技术。但pcr不断扩增需要依靠外界温度的升高和降低从而实现核酸链的解链、退火及延伸的过程，依赖于有快速变化温度能力的仪器。因此pcr过程离不开昂贵的pcr仪控制条件。此外dna聚合酶除了具有dna扩增功能，还存在dna解链功能，能在常温下以单链dna为模板进行扩增，在扩增的同时将模板上的双链dna部位解开并置换出模板上原始互补链。通过调研，目前尚未有利用dna聚合酶扩增和链置换功能建立相应的循环放大系统的研究。
23、本发明提出了一种由靶标激发的聚合酶循环扩增技术，有效结合适配体识别靶标技能和聚合酶的dna扩增与链置换技术，实现靶标激发后自动循环扩增。循环过程所用核酸链无需任何标记，无需大型仪器设备，常温下便能完成。同时结合便携式血糖仪建立对靶标的高灵敏、便携式定量检测方法。此循环扩增技术可通过简单的更换适配体和引物链实现多种靶标的检测，具有普适性应用潜力。
24、本发明的有益效果为：
25、本发明利用沙门菌适配体设计了一种由靶标激发的恒温自动循环扩增技术，并结合便携式血糖仪作为信号读取设备实现了鼠伤寒沙门菌的高灵敏、便携式、定量快速检测。在电泳证明循环扩增技术可行性后对检测条件进行优化，其条件优化结果为：长链与dna桥结合碱基数为23碱基；dna聚合酶浓度为270u·l-1；循环时间优化为30min；功能适配体与引物1浓度比例为1:1.2；磁珠浓度4μm；功能适配体浓度1μm；长链与引物2浓度比例1:0.8；最优适配体为rou-77。在最优条件下新建方法对鼠伤寒沙门菌的检出限为9cfu·ml-1，线性范围为101～107cfu·ml-1。同时此方法在自来水、牛奶、猪肉和蛋清的真实样品中的加标回收率均在95.5％～112％之间，证明具有良好的抗基质干扰性能，能用于真实样品的检测。此外本方法具有良好的特异性，稳定性和重复性。
26、本发明提供的检测方法还具有普适性，通过简单更换适配体链和配套未修饰核酸链，能够实现有机农药、基因等的检测，比如检测有机农药马拉硫磷，此方法对马拉硫磷的检出限为190ng·ml-1，具有良好的特异性，在多种有机磷农药的混合系统对马拉硫磷的检测不会产生干扰。再比如检测循环肿瘤dna(即鼠类肉瘤病毒癌基因(kras))，此方法对循环肿瘤dna kras基因的检出限为44.7fm，且能有效区分靶标基因和只有一个碱基突变的核酸分子，具有良好的特异性。证明本发明的循环信号检测技术具有可实现不同靶标检测的普适性，为食源性危害物的现场高灵敏检测提供新的技术支持。
技术特征：
1.一种用于沙门菌检测的复合变构探针，其特征在于，包括复合物1和复合物2，所述复合物1由沙门菌功能适配体和引物1组成，所述复合物2由长链dna、引物2和dna桥组成；
2.如权利要求1所述的用于沙门菌检测的复合变构探针，其特征在于，所述长链dna的核酸序列如seq id no:5所示。
3.一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的复合变构探针、dna聚合酶、蔗糖酶-dna、磁珠-dna和血糖仪。
4.如权利要求3所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，其特征在于，所述蔗糖酶-dna的制备方法包括：
5.如权利要求4所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，其特征在于，所述sh-dna的核酸序列如seq id no:6所示。
6.如权利要求3所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠-dna的制备方法包括：
7.如权利要求6所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒，其特征在于，所述bio-dna的核酸序列如seq id no:7所示。
8.一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，其特征在于，采用权利要求3-7任一所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大的沙门菌检测试剂盒进行，包括如下步骤：
9.如权利要求8所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，其特征在于，所述第一溶液中，长链与dna桥结合碱基数为23碱基；dna聚合酶浓度为270u·l-1；功能适配体与引物1浓度比例为1:1.2；磁珠浓度为4μm；功能适配体浓度1μm；长链与引物2浓度比例1:0.8；所述适配体为rou-77，其核酸序列为seq id no:8，所述第三次孵育，孵育时间为30min。
10.如权利要求8所述的基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，其特征在于，建立不同浓度梯度的沙门菌和葡萄糖浓度的标准曲线，基于所述标准曲线进行沙门菌浓度的定量检测。
技术总结
本发明公开了一种基于适配体和血糖仪的信号循环放大沙门菌检测方法，属于食品安全检测技术领域。本发明提出了一种由靶标激发的聚合酶循环扩增技术，有效结合适配体识别靶标技能和聚合酶的DNA扩增与链置换技术，实现靶标激发后自动循环扩增。循环过程所用核酸链无需任何标记，无需大型仪器设备，常温下便能完成。同时结合便携式血糖仪建立对靶标的高灵敏、便携式定量检测方法。此循环扩增技术可通过简单的更换适配体和引物链实现多种靶标的检测，具有普适性应用。
技术研发人员：杜淑媛,葛园园,张鸿雁,王静雯,陈璐,胡亭雨
受保护的技术使用者：山东师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23