一种基于RPA和CRISPRCas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法及试剂盒
本发明涉及生物检疫，具体地说，涉及一种基于rpa和crispr/cas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法及试剂盒。
背景技术：
1、果实蝇属（ bactrocera），隶属于双翅目（ diptera），实蝇科（ tephritidae），寡鬃实蝇亚科( dacinae)，寡鬃实蝇族 ( dacini)，由于其取食习性多样，耐受性强，滞育能力强，能迅速适应并在入侵地定居，对当地农业经济造成严重破坏，不但给发生地区的水果和蔬菜生产造成重大损失，而且还严重影响着我国水果和蔬菜的对外出口贸易。橘小实蝇( bactrocera dorsalis)是影响最广泛的果实蝇属之一，已扩散到印度、菲律宾、泰国、美国、澳大利亚等国，在我国华南地区种群数量不断上升，有不断向北扩散的趋势。根据已有报道，橘小实蝇对46科的250多种植物的果实产生危害，并且容易随寄主果实的调运从而远距离传播，从而严重影响了果蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境植物的检疫性有害生物。
2、进口水果在入境时需经现场检验，实蝇的鉴定主要是基于其形态特征而确定的，由于生活环境不同，实蝇形态特征会随之发生相应的变化，给鉴定带来困难。检测的蝇类样本多为幼虫或蛹，通过形态学检测难度较高，需在实验室内饲养为成虫进一步鉴定，而近缘种成虫之间也极为相似，这给实蝇的检疫防控带来困难。
3、当前，对于橘小实蝇分子检测的方法主要是基于聚合酶链式反应(pcr)、实时荧光定量(real-time pcr)或等温扩增技术即环介导等温扩增法(lamp)进行的。例如，cn202111265477.9公开了一种基于可视化lamp技术检测橘小实蝇的方法。但这些技术均存在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、结果观察困难、对实验仪器及检测人员的技术要求高等缺点，因此难以满足基层实验室的检测需求。
4、重组酶等温扩增（recombinase polymerase amplification, rpa）检测技术是近年来研究较多的等温扩增方法，该方法具有操作简单、扩增速度快、反应温度在37 ~ 42℃等优点，非常适合现场检测。如今，随着样品处理工艺、扩增系统、结果检测系统的不断完善，rpa在分子诊断中的应用似乎越来越广泛，包括主要涉及细菌、真菌、寄生虫、病毒、sars-cov-2检测等多个领域。
5、clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas（crispr/cas）系统具有特异的基因靶向能力，其作为一种诊断工具受到越来越多的关注。它由cas酶和guide rna (grna)组成，可以根据grna的序列切割目标dna或rna，使其成为一种有吸引力的基因工程技术。除了靶向性结合和切割外，一些cas蛋白(包括cas12和cas13)还具有反式切割活性，即在cas-grna复合物上切割周围的单链dna或rna。crispr/cas系统的所有这些活性都是基于其特异性结合，使其能够在检疫方面，包括植物检疫、动物检疫以及卫生检疫中发挥相应的作用。cas12b是一种双rna引导的核酸酶，含有单个ruvc结构域，同时需要crrna和tracrrnas，能识别更简单的pam序列(5'ttn-3')，可以显著增加基因组的靶向范围，并且具有最小的脱靶效应。
6、将rpa与crispr/cas系统结合起来，具有3个优势。首先，等温扩增极大增加了靶标序列的数量，在cas蛋白的反式切割下，产生了放大的读出信号用于检测，提高了检测的灵敏度；第二，crispr系统的识别是序列特异性的，这将减少等温扩增步骤中副产物产生的假阳性结果，从而提高特异性；第三，等温扩增技术的发展使dna扩增不再需要复杂的热循环设备，而crispr的反式切割可以切割具有不同信号的单链rna (ssrna)或ssdna，更容易简化读取设备。
7、在crispr检测技术中，cas12b多用于植物、哺乳动物基因组编辑，也与lamp、rt-raa方法结合构建检测系统，但在昆虫检测方面未见报道。因此，如何对橘小实蝇进行精准、快速检测的问题仍然亟需解决。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种基于rpa和crispr/cas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法及试剂盒。
2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测橘小实蝇的sgrna，所述sgrna的序列为：5'-gucuaaaggacagauuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugaacuucaagcgaaguggcaccuaacagaccgaaacuuaaa -3'（seq id no:4）。
3、第二方面，本发明提供一种橘小实蝇检测反应体系，包括rpa扩增反应体系和cas12b检测反应体系；所述cas12b检测反应体系包括如seq id no:4所示的sgrna。
4、进一步地，所述rpa扩增反应体系包括序列如seq id no:2-3所示的rpa引物对。
5、第三方面，本发明提供一种基于rpa和cas12b的可视化检测橘小实蝇的试剂盒，包括如seq id no:4所示的sgrna和如seq id no:2-3所示的rpa引物对。
6、进一步地，所述试剂盒还包括cas12b酶蛋白、ssdna报告分子。
7、优选地，所述ssdna为fam-ttttttt-bhq1。
8、第四方面，本发明提供所述试剂盒在橘小实蝇检测中的应用。
9、第五方面，本发明提供一种基于rpa和crispr/cas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法，包括以下步骤：
10、s1. 提取待测样本基因组dna；
11、s2. 以步骤s1的总dna为模板，利用seq id no:2-3所示的rpa引物对进行rpa等温扩增反应，得到rpa扩增产物；
12、s3. 以步骤s2所得rpa扩增产物为模板，加入cas12b检测反应体系进行crispr反应；
13、所述cas12b检测反应体系包括如seq id no:4所示的sgrna、cas12b酶蛋白和ssdna报告分子；
14、优选地，所述ssdna为fam-ttttttt-bhq1；
15、s4. crispr反应结束后，直接裸眼观察反应体系的颜色变化即可判断待测样本是否含有橘小实蝇。
16、进一步地，步骤s2使用的rpa等温扩增反应体系中，正向引物和反向引物浓度均为10μm。
17、扩增反应条件为：37℃-43℃，10-30 min。优选43℃，10 min。
18、进一步地，步骤s3使用的crispr反应体系中，sgrna、cas12b酶蛋白和ssdna报告分子的浓度分别为250ng/μl、50ng/μl和100μm.。
19、crispr反应条件为：37℃-60℃，20-60 min。优选43℃，20 min。
20、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
21、（一）本发明成功解决了橘小实蝇幼虫难以快速（实时）鉴别的问题，用快速分子检测结合可视化方法，可以在35min内获得检测结果。采用实蝇样本基因快速提取方法，可以在30s-200s内成功提取实蝇dna。免开盖的可视化检测方法可以有效避免气溶胶污染，能够准确显色。无需昂贵的仪器设备，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，不像普通pcr方法需要进行凝胶电泳观察结果，不用观察荧光曲线，也不用放入蓝光下观察，直接裸眼观察反应体系颜色变化即可，是一种适合现场、基层的快速检测方法。
22、（二）本发明提供的方法、rpa引物组以及crispr特异性sgrna能够在果实蝇属的物种中精确检测橘小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验，具有巨大的应用推广价值。
技术特征：
1.用于检测橘小实蝇的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列为：5'-gucuaaaggacagauuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugaacuucaagcgaaguggcaccuaacagaccgaaacuuaaa -3'。
2.橘小实蝇检测反应体系，其特征在于，包括rpa扩增反应体系和cas12b检测反应体系；所述cas12b检测反应体系包括权利要求1所述的sgrna。
3.根据权利要求2所述的体系，其特征在于，所述rpa扩增反应体系包括序列如seq idno:2-3所示的rpa引物对。
4.可视化检测橘小实蝇的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgrna和如seqid no:2-3所示的rpa引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas12b酶蛋白、ssdna报告分子；
6.权利要求4或5所述试剂盒在橘小实蝇检测中的应用。
7.一种基于rpa和crispr/cas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s2使用的rpa等温扩增反应体系中，正向引物和反向引物浓度均为10μm；
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤s3使用的crispr反应体系中，sgrna、cas12b酶蛋白和ssdna报告分子的浓度分别为250ng/μl、50ng/μl和100μm.；
10.权利要求7-9任一项所述方法在生物检疫中的应用；
技术总结
本发明提供一种基于RPA和CRISPR/Cas12b的橘小实蝇实时可视化检测方法及试剂盒。以橘小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性的RPA引物以及与CRISPR/Cas12b结合的特异性sgRNA序列；利用RPA引物，以待测样本基因组DNA为模板进行RPA反应；利用特异性的sgRNA，以RPA扩增产物为底物进行CRISPR反应；反应结束后，直接裸眼观察反应体系的颜色变化即可判断待测样本是否含橘小实蝇。本发明提供相应的RPA引物序列和sgRNA序列及应用。本方法能够在12个果实蝇属的物种中精确检测橘小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。
技术研发人员：刘波,张凤月,葛春霞,吕晨瑜,任荔荔,杨鑫怡
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23