人MTHFD1L蛋白的原核表达载体、构建方法及应用
本发明属于分子生物学，具体涉及人mthfd1l蛋白的原核表达载体、构建方法及应用。
背景技术：
1、四氢叶酸合成酶mthfd1l参与细胞内线粒体叶酸介导的一碳单位代谢途径，mthfd1l在线粒体中催化甲酸合成的最后一步反应，将10-cho-thf转化为甲酸和四氢叶酸thf，并合成atp，对维持生物体内叶酸循环有重要作用。叶酸作为一碳单位的载体，参与体内核苷酸、氨基酸和甲基合成等多个生化过程，在细胞的生长和繁殖中具有重要作用。叶酸在线粒体内代谢为甲酸后，从线粒体运输到细胞质，进一步参与细胞质中嘌呤核苷酸、dtmp和甲硫氨酸的生物合成，这些代谢途径在细胞分化和迁移中起着重要作用。
2、研究发现肿瘤细胞的侵袭与迁移具有代谢重编程的特点。叶酸代谢途径对肿瘤细胞的生长、分化起着至关重要的作用。mthfd1l在结直肠癌、舌鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌等多种实体癌中过度表达，对于癌细胞的增殖具有重要作用，因此有可能成为肿瘤治疗的新靶点。
3、但是，目前尚未有mthfd1l蛋白表达和纯化的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，一方面，一些实施例公开了人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，包括步骤：
2、s1、以表达mthfd1l蛋白的基因序列为模板，通过pcr扩增获得mthfd1l基因片段；其中，pcr扩增的引物对为mthfd1l-f/mthfd1l-r，mthfd1l-f的序列如seq id：2所列；mthfd1l-r的序列如seq id：3所列；
3、s2、将得到的mthfd1l基因片段连接到原核表达载体上得到重组质粒；所述原核表达载体为pethissumo；
4、s3、将重组质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中复制扩增，得到大量mthfd1l蛋白融合表达载体。
5、进一步，一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，步骤s2具体包括：
6、将原核表达载体pethissumo采用限制性内切酶sspi消化，然后无缝连接pcr产物，得到mthfd1l重组质粒；将mthfd1l重组质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄抗性的平板上筛选阳性克隆，挑取单菌落接种至含氨苄青霉素lb液体培养基，37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，收获菌体，提取质粒。
7、一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，步骤s3还包括对mthfd1l蛋白融合表达载体进行测序的步骤。
8、另一方面，一些实施例公开了人mthfd1l蛋白的原核表达载体，由人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法得到。
9、再一方面，一些实施例公开了人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，将人mthfd1l蛋白融合表达载体用于表达人mthfd1l蛋白。
10、进一步，一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，将mthfd1l蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3中进行表达，得到人mthfd1l蛋白。
11、一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，将mthfd1l蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3中表达；其中，大肠杆菌在37℃、200rpm条件下振荡培养，待od600值达到0.4～0.6之间加入iptg诱导，大肠杆菌的培养温度降至18℃。
12、一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，还包括对得到的人mthfd1l蛋白进行纯化。
13、一些实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，对人mthfd1l蛋白进行纯化的过程包括：
14、将bl21-de3/pet-hissumo-mthfd1l重组菌株进行扩大体系培养，收集菌体沉淀，破碎离心，收集上清，上清液经ni柱亲和层析进行初步纯化，经tev酶切掉hissumo标签，再经过ni柱亲和层析及凝胶过滤层析柱以去除hissumo标签以及杂蛋白，即可获得人mthfd1l蛋白。
15、本发明实施例公开的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，通过将高纯度目的基因片段与原核表达载体无缝连接，得到测序正确的mthfd1l蛋白融合表达载体，并将mthfd1l蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株进行蛋白表达，进一步通过对人mthfd1l蛋白的纯化，得到了大量人mthfd1l蛋白，方法简便、快捷、高效，表达量高，成本低，为人mthfd1l蛋白的三维结构解析及其抑制剂筛选奠定了良好基础，具有良好应用前景。
技术特征：
1.人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤s2具体包括：
3.根据权利要求1所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤s3还包括对mthfd1l蛋白融合表达载体进行测序的步骤。
4.人mthfd1l蛋白的原核表达载体，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的构建方法得到。
5.人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，其特征在于，将权利要求4所述的人mthfd1l蛋白融合表达载体用于表达人mthfd1l蛋白。
6.根据权利要求5所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，其特征在于，所述人mthfd1l蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3中进行表达，得到人mthfd1l蛋白。
7.根据权利要求6所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，其特征在于，将所述mthfd1l蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株bl21-de3中表达；其中，大肠杆菌在37℃、200rpm条件下振荡培养，待od600值达到0.4～0.6之间加入iptg诱导，大肠杆菌的培养温度降至18℃。
8.根据权利要求6所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，其特征在于，还包括对得到的人mthfd1l蛋白进行纯化。
9.根据权利要求8所述的人mthfd1l蛋白的原核表达载体的应用，其特征在于，对人mthfd1l蛋白进行纯化的过程包括：
技术总结
本发明实施例公开了人MTHFD1L蛋白的原核表达载体、构建方法及应用；构建方法包括步骤：S1、以表达MTHFD1L蛋白的基因序列为模板，通过PCR扩增获得MTHFD1L基因片段；其中，PCR扩增的引物对为MTHFD1L‑F/MTHFD1L‑R；S2、将得到的MTHFD1L基因片段连接到原核表达载体pETHisSUMO上得到重组质粒；S3、将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中复制扩增，得到大量MTHFD1L蛋白融合表达载体。并将MTHFD1L蛋白融合表达载体转入大肠杆菌表达菌株进行蛋白表达，得到了人MTHFD1L蛋白，进一步通过对人MTHFD1L蛋白的纯化，得到了大量人MTHFD1L蛋白。
技术研发人员：韩聪,胥启霞
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23