基于分子标记鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的方法及引物对
本技术涉及远缘新种质的鉴定，具体涉及基于分子标记技术鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体。
背景技术：
1、随着人口的不断增长和经济的快速发展，农业生产的需求也日益多样化。这些需求例如包括更好的味道、更高的产量、更优的抗病、抗虫害、抗胁迫能力等。为了满足不断增长的需求，培育杂交新种质成为了农业领域中一项至关重要的技术。如何精确鉴定杂交后代真实性是创制之后面临的又一重要问题。
2、大白菜和芝麻菜是常见的农作物，具有重要的经济价值。对于大白菜和芝麻菜远缘杂交种的鉴定，通常采用的是形态学和细胞学鉴定，形态学鉴定具有操作简单等优点，但是易受环境和人为因素影响，鉴定结果不够可靠。虽然亦有利用分子标记进行鉴定，但其设计较难且有时需要两对或更多对引物来鉴定，操作相对复杂。
3、分子标记具有共显性、标记稳定以及存在广泛等优点。目前，利用分子标记在大白菜与芝麻菜远缘杂交种的鉴定中应用较少。
4、因此，在远缘杂交新种质领域，存在提供能够方便、准确鉴定新种质的强烈需求。
技术实现思路
1、有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种基于分子标记技术的鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体的方法，包括：
2、获取待鉴定的样本，所述样本是以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜‘astro’为父本进行属间杂交，经胚胎挽救和染色体加倍后获得的材料；
3、以所述材料的基因组dna为模板，利用以下引物对进行扩增：
4、正向引物5’-3’：ccatatggtgcgccgtctat，
5、反向引物5’-3’：actcggacaaagacacggac；
6、对扩增后的产物进行凝胶电泳；以及
7、观察电泳条带确定异源四倍体的真实性。
8、在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括利用所述特异引物对对母本和父本进行扩增。
9、在一些实施方式中，观察条带包括当样本同时出现母本和父本的条带，则证实获得了异源四倍体。
10、在优选的实施方式中，所述获取的步骤包括：以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜自交系‘astro’为父本，蕾期杂交授粉，取授粉后7天后子房，无菌条件下进行胚拯救，并进行加倍处理。示例性的，蕾期采用浓度为62.3mg/l的mgcl2.6h2o溶液喷施柱头，15-20分钟后，采用涂抹的方式进行杂交授粉。
11、本发明的特异引物对针对的基因序列为：
12、ctctctctctctctctctctctctctctctctctcaaactgtaaccaaaacagaagaagctttaagga
13、gaagagaagagtctgagatcacagcaatggagattgatctaaatgattatactgttattaaggaagg
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22、tggttgatcttgatccatatggtgcgccgtctatcttccttgattcagctgttcaatcagttgcagatg
23、gtggcttgctgatgtgtacagcaactgacatggcagtgttatgtggtgctaatggcgaggtttgctat
24、tccaaatatggttcctatccacttaaagggaagtattgtcatgagatggctttgcgtatcctcctcgcc
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40、aattttagatttttgttttgcaaaagaatttacccttttttattattattttcaaacatttgtcatagtat
41、gttctacgtttttgatccaag
42、在第二方面，本发明提供了一种用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体特异引物对，所述引物对由正向引物5’-3’：ccatatggtgcgccgtctat，和反向引物5’-3’：actcggacaaagacacggac组成。
43、在第三方面，本发明提供了一种鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所定义的分子标记引物对。
44、在一些实施方式中，本发明的试剂盒进一步包括大白菜‘72049’的基因组dna和芝麻菜‘astro’基因组dna。
45、在第四方面，本发明提供了第二方面所定义的特异引物对用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。
46、在第五方面，本发明提供了第三方面所定义的试剂盒用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。
47、在获得‘大白菜72049×芝麻菜astro’中间材料后，如何准确、便捷地对杂交种进行鉴定是面临的又一难题，发明人克服了传统形态学鉴定易受环境和人为因素影响且鉴定结果不够可靠的缺陷；同时克服了分子标记进行大白菜和芝麻菜远缘杂交种的鉴定的研究较少、设计难度大、操作较复杂的现状，成功筛选出用于鉴定引物对，该引物对用于鉴定大白菜72049×芝麻菜astro的异源四倍体时操作简便且结果准确。
技术特征：
1.一种基于分子标记技术的鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体的方法，包括：
2.权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括利用所述特异引物对对母本和父本进行扩增。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述观察的步骤包括当样本同时出现母本和父本的条带，则证实获得了异源四倍体。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述特异引物对针对的序列如seq id no:3所示的基因。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述获取的步骤包括：以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜自交系‘astro’为父本，蕾期杂交授粉，取授粉后7天后子房，无菌条件下进行胚拯救，并进行加倍处理。
6.一种用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体特异引物对，所述引物对由正向引物5’-3’：ccatatggtgcgccgtctat，和反向引物5’-3’：actcggacaaagacacggac组成。
7.一种鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求7所述特异引物对。
8.权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括大白菜‘72049’的基因组dna和芝麻菜‘astro’基因组dna。
9.权利要求6所述的特异引物对用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。
10.权利要求7或8所述的试剂盒用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。
技术总结
本申请涉及一种基于分子标记技术的鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体的方法及引物对。该方法包括获取待鉴定的样本，所述样本是以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜‘ASTRO’为父本进行属间杂交，经胚胎挽救和染色体加倍后获得的材料；以所述材料的基因组DNA为模板，利用特异引物对进行扩增；对扩增后的产物进行凝胶电泳；以及观察电泳条带确定异源四倍体的真实性。
技术研发人员：张晓伟,原玉香,魏小春,赵艳艳,段巧红,熊思宇,王志勇,杨双娟,苏贺楠,张文静,李林
受保护的技术使用者：河南省农业科学院蔬菜研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23