基于MassArray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测引物组和试剂盒
本发明涉及高胆红素血症诊断，具体为基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测引物组和试剂盒。
背景技术：
1、胆红素是哺乳动物红细胞中血红素分解代谢的最终产物，胆红素具有神经毒性，血清胆红素水平显著升高可使胆红素通过血脑屏障，引起不可逆的脑损伤-核黄疸。此外胆红素还表现出各种细胞类型的细胞毒性，血清胆红素水平升高往往提示存在急慢性肝病。作为人体内一种非常重要的内源性物质，胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标和肝损害的重要生物标志物。
2、高胆红素血症是临床常见的药物不良反应之一，严重的高胆红素血症可导致药物治疗中断或更改，是影响患者治疗效果或预后的重要因素。胆红素生成过度，摄取、结合或排泄受损，或从损伤的肝细胞、胆管逆流入血是使血清胆红素浓度升高的主要原因。
3、胆红素在肝脏的代谢需要有ugt1a1酶、摄取转运体,外排转运体及调控因子的共同参与，所以其中任何环节发生障碍都可能导致胆红素代谢异常。基因多态性可能直接或间接抑制胆红素摄入肝细胞(影响摄取转运体),抑制其代谢(影响肝细胞内代谢酶)或降低胆红素的排泄(影响外排转运体)导致高胆红素血症。
4、目前检测手段众多且各具特色，以pcr为基础的检测手段，诸如arms-pcr，荧光定量pcr、数字pcr等，操作简便，快速，数据分析简单，但是由于通量的限制，无法满足临床对多个基因、多位点检测的需求。而高通量基因检测技术，如高通量测序技术等，解决了通量的局限，但其成本高、检测周期长，且对实验操作及数据分析人员的技术要求门槛高，因此尚未得到普及性地应用于临床检测。
5、综上，亟需一种经济、快速、易操作的检测方法，针对不同个体个性化地评估个体对胆红素的代谢能力及高胆红素血症风险，从而帮助明确病因以及降低高胆红素血症风险，减少药物不良反应。
技术实现思路
1、本发明提供了基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测引物组和试剂盒，用于低成本、快速便捷地实现检测，以便于评估个体胆红素的代谢能力，帮助明确病因以及降低高胆红素血症风险，减少药物不良反应。
2、有鉴于此，本发明的方案为：
3、本发明的第一个方面，提出遗传性高胆红素血症检测引物组，检测rs3064744、rs4148323、rs34993780、rs35350960、rs34946978、rs72551343、rs4124874、rs2296651的引物组；具体包括核苷酸序列如seq id no：1-17所示的pcr扩增引物组。
4、进一步地，所述引物组还包括核苷酸序列如seq id no：18-25所示的单碱基延伸引物组。
5、本发明的第二个方面，提出第一个方面所述引物组在制备遗传性高胆红素血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
6、本发明的第三个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测试剂盒，所述检测试剂盒包括核苷酸序列如seq id no：1-17所示的pcr扩增引物组，及核苷酸序列如seq id no：18-25所示的单碱基延伸引物组。
7、进一步地，所述试剂盒还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
8、优选地，多重pcr反应试剂包括pcr反应缓冲液、mg2+、dntps、dna聚合酶、水中的一种或几种；sap反应为虾碱性磷酸酶消化反应，试剂包括sap反应缓冲液、sap酶、水中的一种或几种；单碱基碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种。
9、本发明的第四个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测反应体系，所述反应体系包括pcr扩增反应体系及单碱基延伸反应体系；所述pcr扩增反应体系中含有pcr扩增引物组，所述pcr扩增引物组的核苷酸序列如seq id no：1-17所示；所述单碱基延伸反应体系中含有单碱基延伸引物组，所述单碱基延伸引物组的核苷酸序列如seq id no：18-25所示。
10、进一步地，所述反应体系还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
11、优选地，多重pcr反应试剂包括pcr反应缓冲液、mg2+、dntps、dna聚合酶、水中的一种或几种；sap反应为虾碱性磷酸酶消化反应，试剂包括sap反应缓冲液、sap酶、水中的一种或几种；单碱基碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种。
12、进一步地，所述pcr扩增反应体系中，核苷酸序列如seq id no：1-17所示的各pcr扩增引物浓度均为0.5μm。
13、进一步地，核苷酸序列如seq id no：18-25所示的各单碱基延伸引物浓度依次分别为6.75μm、5.89μm、6.54μm、8.25μm、7.63μm、8.13μm、8.28μm、14.25μm。
14、本发明第五个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测系统，其特征在于，包括第四个方面所述的所述反应体系，及脱盐树脂及点样芯片。
15、与现有技术相比，本发明至少具备以下有益效果：
16、本发明提供的检测引物组可以单孔内检测胆红素代谢能力相关的ugt1a1及slc10a1基因的8个突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，针对不同个体个性化地评估个体对胆红素的代谢能力及高胆红素血症风险，从而帮助明确病因以及降低高胆红素血症风险，减少药物不良反应。
17、本发明提供的引物组是通过更改优化，包括了引物靶向区段的适当调整、延伸引物方向调整、引物序列的优化调整以及引物分孔优化调整等，同时经大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确的分型，同时也能达到质谱检测技术的要求，实现应用massarray系统对待测样品的胆红素代谢能力进行快速有效的检测。
18、本发明提供的用于为胆红素代谢能力提示的产品，包括用于检测snp位点的试剂和/或设备以及本发明提供的引物组，该产品能够对与胆红素代谢能力相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，目前已投放市场，且经市场检验效果显著，获得极大商业上的回报，具有极大临床应用价值及更开阔的市场推广。
19、本发明提供的胆红素代谢能力检测相关snp位点的方法，包括应用上述的引物组检测待测样品基因组中snp位点的核苷酸。该方法应用本发明提供的引物组能够实现对2个基因(ugt1a1、slc10a1)共8个突变位点单孔内检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观等特点。
20、本发明运用核酸质谱平台，实现单孔内对胆红素代谢能力相关基因(ugt1a1、slc10a1)的8个位点进行检测，极大的提高了检测效率，特别适用于批量检测。本发明检测成本低廉，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，仅使用外周血就可以较好的检出；发明适用于所有人群，可以及早发现不同个体对胆红素代谢水平，评估个体对胆红素的代谢能力及高胆红素血症风险，从而帮助明确病因以及降低高胆红素血症风险，减少药物不良反应。
技术特征：
1.遗传性高胆红素血症检测引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no：1-17所示的pcr扩增引物组。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括核苷酸序列如seq id no：18-25所示的单碱基延伸引物组。
3.权利要求1或2所述引物组在制备遗传性高胆红素血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
4.基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no：1-17所示的pcr扩增引物组，及核苷酸序列如seq id no：18-25所示的单碱基延伸引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
6.基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测反应体系，其特征在于，包括pcr扩增反应体系及单碱基延伸反应体系；所述pcr扩增反应体系中含有pcr扩增引物组，所述pcr扩增引物组的核苷酸序列如seq id no：1-17所示；所述单碱基延伸反应体系中含有单碱基延伸引物组，所述单碱基延伸引物组的核苷酸序列如seq id no：18-25所示。
7.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述pcr扩增反应体系中，核苷酸序列如seq id no：1-17所示的各pcr扩增引物浓度均为0.5μm。
9.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述单碱基延伸反应体系中，核苷酸序列如seq id no：18-25所示的各单碱基延伸引物浓度依次分别为6.75μm、5.89μm、6.54μm、8.25μm、7.63μm、8.13μm、8.28μm、14.25μm。
10.基于massarray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测系统，其特征在于，包括权利要求6-9任意一项所述的所述反应体系，及脱盐树脂及点样芯片。
技术总结
本发明公开了基于MassArray核酸质谱平台的遗传性高胆红素血症检测引物组和试剂盒，所述引物组包括如SEQ ID NO：1‑17所示的PCR扩增引物组，及如SEQ ID NO：18‑25所示的单碱基延伸引物组；可以单孔内检测胆红素代谢能力相关的UGT1A1及SLC10A1基因的8个突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，针对不同个体个性化地评估个体对胆红素的代谢能力及高胆红素血症风险，从而帮助明确病因以及降低高胆红素血症风险，减少药物不良反应。
技术研发人员：张玉,周涛,龚卫静,周红,史琛,曾芳,赵雷
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23