一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法

本发明属于植物育种和基因工程，具体涉及一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法。

背景技术：

1、农杆菌(agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法、基因枪法和花粉管通道法是植物转化中最常规的方法，尤其是农杆菌介导的遗传转化法备受本领域技术人员喜爱，它的主要优点是整合到植物染色体中的基因大多是低拷贝的，也可以插入相对较大的外源dna片段(大于10kb)以及所得到的转基因植物具有更高的质量性状和繁殖能力，可以获得稳定的遗传后代，因此，在植物的遗传转化中，农杆菌介导的转化法被广泛应用。但传统遗传转化技术一般是在组织培养条件下通过农杆菌共培养转化实现的，存在依赖基因型、受植物材料限制、转化周期长、转化效率低、操作复杂、依赖无菌环境、易污染等缺点。

2、南方常见木本果树(荔枝、龙眼、柑橘、芒果等)由于种子难以保存，导致其在无法获得种子的季节难以通过种子组织培养的方法进行遗传转化。而且，目前为止利用活体枝条构建转基因体系对南方常见果树进行遗传转化的技术尚处于空白阶段。因此，针对南方常见果树遗传转化困难等问题，急需建立快捷、高效、简便的遗传转化方法。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种快捷、高效、简便和具有普适性的果树遗传转化方法，该方法操作难度低、转化效率高、无基因型依赖性、突破了依赖种子进行遗传转化的桎梏，可在一年四季中在实验室或在室外进行操作。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，该方法包括以下步骤：

4、s1、将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌并活化，所述表达载体中还含有报告基因；

5、s2、用农杆菌侵染液重悬含目的基因的发根农杆菌，将od600调节至0.4-0.8，并将ph调至5.6-5.8，得到用于侵染的浸润液，所述农杆菌侵染液由ms、乙酰丁香酮和silwet l-77组成；

6、s3、在果树上选取活体枝条或树干，环割枝条或树干，并清除部分形成层形成环形创面；

7、s4、吸取s2的浸润液侵染s3的创面，然后包裹处理后的伤口遮光培养，直至创面处长出表达报告基因的转基因根。

8、优选地，所述发根农杆菌选自msu440、ar.1193、ar.a4、k599和ar.qual中的一种或多种。

9、更优选地，所述发根农杆菌选自msu440。

10、优选地，所述农杆菌侵染液为：1/4ms+100μm乙酰丁香酮+0.02％silwet l-77，v/v。

11、优选地，s2中，将od600调节至0.6。

12、本发明提供了一种利用发根农杆菌获得果树转基因根的高效诱导方法，以活体枝条或树干为材料，采用特定的方法，利用特殊的发根农杆菌和特殊的侵染液，在特殊浓度下共同发挥作用，可诱导南方常见木本果树(荔枝、龙眼、柑橘、芒果等)遗传转化生成转基因根，且具有较高的转化效率，转化率最高可达96％。同时，本发明不需要在无菌环境下操作，也不依赖种子萌发进行遗传转化，适用于南方常见果树的品种选育及品种改良。

13、优选地，所述报告基因选自ruby，所述ruby由35s启动子引导表达。

14、优选地，所述南方常见果树包括荔枝、龙眼、柑橘、芒果。

15、优选地，s4还包括使用pcr检测转基因根的步骤。

16、更优选地，pcr检测引物如seq id no:3和seq id no:4所示。

17、更优选地，pcr检测的程序为：98℃预变性3min；98℃变性15s，60℃退火15s，72℃延申1min，共32个循环；72℃继续延申2min。

18、优选地，s4中，环形创面的宽度为1-3cm。

19、本发明还提供了上述的果树遗传转化方法在南方常见果树品种选育及品种改良中的应用。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明公开了一种快捷、高效、简便和具有普适性的果树遗传转化方法，首先将含有目的基因和报告基因的表达载体转入发根农杆菌，用农杆菌侵染液重悬后制成用于侵染的浸润液，然后在果树上选取活体枝条或树干，环割形成环形创面后，用浸润液侵染创面，最后包裹处理的伤口遮光培养，直至创面处长出表达报告基因的转基因根。通过本发明的方法可以在荔枝、龙眼、柑橘、芒果等南方常见果树的枝条上实现遗传转化。同时，本发明方法完全不依赖植物组织培养，且突破了依赖种子进行遗传转化的限制。另外，本发明方法操作难度低、转化效率高。本发明方法在果树转基因和基因功能验证方面具有重要的应用价值，为南方常见果树的选育和品种改良提供了重要的研究手段。总体而言，本发明具有以下优点：

22、(1)与普通的模式作物不同，果树存在遗传转化困难或遗传转化率低等问题。为此，本发明提供了一种快捷、高效的果树遗传转化方法，可以用于转化荔枝、龙眼、柑橘、芒果等南方常见果树，诱导生成稳定的转基因根。

23、(2)南方常见果树(例如荔枝、龙眼、柑橘、芒果)普遍存在种子难以保存的特点，本发明方法不依赖于种子进行遗传转化，大大提高了南方果树遗传转化的灵活性。

24、(3)常规果树的遗传转化依赖种子和无菌环境，且本发明可在有菌条件下进行操作，

25、(4)包括模式植物在内的普通植物遗传转化效率低，本发明方法具有较高的转化效率，对荔枝、龙眼、芒果和柑橘的最高转化率分别约为84％、96％、64％和72％。

26、(5)与常规的离体遗传转化不同，本发明直接使用活体枝条进行转化，转化率显著提高。

27、(6)本发明可以直观地通过表型鉴定结果，不需要再利用其他方法鉴定。

28、(7)本发明具有普适性，已证明适用于荔枝、龙眼、柑橘和芒果等南方常见果树的遗传转化。

技术特征：

1.一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌选自msu440、ar.1193、ar.a4、k599和ar.qual中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌选自msu440。

4.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，所述报告基因选自ruby，所述ruby由35s启动子引导表达。

5.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液为：1/4ms+100μm乙酰丁香酮+0.02％silwet l-77，v/v。

6.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，s2中，将od600调节至0.6。

7.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，所述南方常见果树包括荔枝、龙眼、柑橘、芒果。

8.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，s4还包括使用pcr检测转基因根的步骤。

9.根据权利要求7所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，pcr检测引物如seq id no:3和seq id no:4所示。

10.根据权利要求1所述的一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法，其特征在于，s3中，环形创面的宽度为1-3cm。

技术总结
本发明属于植物育种和基因工程技术领域，具体涉及一种高效快捷的南方常见果树遗传转化方法。本发明首先将含有目的基因和报告基因的表达载体转入发根农杆菌，重悬后制成用于侵染的浸润液，然后在果树上选取活体枝条或树干，环割形成环形创面后，用浸润液侵染创面，最后包裹处理的伤口遮光培养，直至创面处长出表达报告基因的转基因根。通过本发明的方法可以在荔枝、龙眼、柑橘、芒果等南方常见果树的枝条上实现遗传转化。同时，本发明方法完全不依赖植物组织培养，且突破了依赖种子进行遗传转化的限制。另外，本发明方法操作难度低、转化效率高，为南方常见果树的选育和品种改良提供了重要的研究手段。

技术研发人员：刘海伦,尹茂,黄华,严倩,姜永华,文英杰,史发超
受保护的技术使用者：广东省农业科学院果树研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23