一种调控木质素生物合成的毛竹miRNA序列及应用的制作方法

植物基因工程，具体涉及一种调控木质素生物合成的毛竹mirna序列及应用。

背景技术：

1、毛竹（ phyllostachys edulis）是我国种植面积最大的笋材两用竹种，具有良好的经济和社会效益，是木材的理想替代选择。

2、微小rnas（micrornas，mirnas）是一类内源性单链非编码rna（noncoding rna），在各物种间展现出高度的保守性，但在植物的不同发育阶段及组织内却呈现出显著的差异性表达，预示着mirna在植物生长发育过程中可能扮演着至关重要的基因表达调控角色。

3、其中木质素是植物细胞壁的主要组成成分，是影响材性的重要因子。在竹材中，大多数轴向细胞含有木质素，这一特性赋予了竹材出色的拉伸强度，而这是普通木材所不具备的。阿魏酸5-羟化酶（f5h）是木质素单体合成的关键酶，f5h基因的表达水平直接影响木质素的合成及其在细胞壁中的沉积。mirna可以通过影响与木质素生物合成相关的基因来调节细胞壁中木质素的含量和组成。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与细胞壁木质素生物合成相关的新型mirna。

2、为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种与细胞壁木质素生物合成相关的 novel_mir276，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明中获得并验证 novel_mir276的方法包括：

4、（1）以培养至3个月的毛竹叶片为材料提取总rna和dna。总rna进行茎环反转录为cdna。本发明中，毛竹总rna和dna的提取采用本领域常用的提取植物组织总rna和dna的方法即可，本发明的实施例中总rna采用trizol法，dna采用ctab法。

5、（2）在提取得到毛竹总rna和dna后，将所述总rna进行基因组dna去除并反转录合成cdna。在本发明中，cdna的合成采用茎环反转录法，需预先设 计novel_mir276的茎环引物；本发明的实施例中具体可采用诺唯赞公司的cdna合成试剂盒进行cdna的合成。

6、（3）在得到cdna和dna之后，进行 novel_mir276的pcr扩增验证。本发明中， novel_ mir276pcr扩增的体系优选为20 µl体系，包括2 × rapid taq master mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，dna模板3 μl，ddh2o 5 μl。pcr扩增反应程序为95℃ 3 min；95℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 8 s，32个循环；72℃ 5 min。4℃ 保存。

7、（4）纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段无缝克隆连接到pcambiasuper1300-gfp载体，转化至大肠杆菌trans5α感受态细胞中，经菌落pcr验证为阳性克隆后进行测序。

8、第二方面，本发明提供了含有上述新型mirna的生物材料，所述生物材料包括：重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

9、第三方面，本发明提供了上述新型mirna或上述的生物材料在实现以下任一项或多项中的应用：

10、1）调控植物细胞壁木质素生物合成；

11、2）制备材性优良植物；

12、3）制备植物细胞壁木质素生物合成调控物质。

13、在本发明所提供的应用中，所述新型mirna调控细胞壁中木质素的合成，提升植物抗逆能力。

14、在本发明所提供的应用中，利用所述新型mirna或所述生物材料制备转基因植物；优选地，所述转基因植物包括：转基因水稻或转基因毛竹。

15、第四方面，本发明提供一种调控植物细胞壁木质素生物合成的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中增加 novel_mir276的表达量，降低植物细胞壁木质素生物合成能力；

16、或在植物中降低 novel_mir276的表达量，增加植物细胞壁木质素生物合成能力；

17、优选地，所述植物包括：水稻或毛竹。

18、在本发明提供的调控植物细胞壁木质素生物合成的方法中，所述过表达的方式选自以下1）~5），或1）~5）任选的组合：

19、1）通过导入具有 novel_mir276的质粒；

20、2）通过增加植物染色体上 novel_mir276的拷贝数；

21、3）通过改变植物染色体上 novel_mir276的启动子序列；

22、4）通过将强启动子与 novel_mir276可操作地连接；

23、5）通过导入增强子。

24、在本发明提供的调控植物细胞壁木质素生物合成的方法中，采用农杆菌介导法将 novel_mir276转入到水稻植株中，获得 novel_mir276过表达的转基因水稻植株；

25、作为本发明的一个具体实施方式，本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。

26、优选地，将 novel_mir276构建到植物表达载体pcambiasuper1300-gfp上，转化农杆菌，然后侵染转化水稻愈伤组织，筛选转基因水稻植株。

27、在本发明的一个具体实施方式中，以植物过表达载体pcambiasuper1300-gfp为基础载体，进行改造获得pcambiasuper1300-gfp-novel_mir276过表达载体。具体实施方案如下：

28、1、获得 novel_mir276目的片段

29、以毛竹cdna为模板，克隆获得 novel_mir276目的片段，在两端分别引入xbaⅰ、kpnⅰ酶切位点序列，确保经扩增得到的插入片段在其5'和3'端连接上与线性化载体相适应的同源臂。

30、2、线性化表达载体pcambiasuper1300-gfp

31、选择xbaⅰ、kpnⅰ酶切位点对pcambiasuper1300-gfp载体进行酶切。

32、3、重组反应

33、将线性化载体与插入片段按照摩尔比为1:2比例进行重组反应，这些摩尔数对应的dna质量可由以下公式粗略计算获得：

34、最适克隆载体使用量x= [0.02 ×载体碱基数10858 bp ] ng；

35、最适插入片段使用量y= [0.04 ×克隆片段碱基数300 bp ] ng。

36、4、转化大肠杆菌感受态细胞

37、将连接产物全部转化trans5α感受态细胞。37℃过夜培养后挑选单克隆，菌落pcr验证后，扩大培养，提取质粒pcambiasuper1300-gfp-novel_mir276，进行测序和酶切验证。

38、转基因水稻的制备方法如下：

39、将构建的植物表达载体pcambiasuper1300-gfp-novel_mir276转化农杆菌菌株gv3101感受态；选取阳性克隆摇菌，侵染水稻愈伤组织；提取水稻阳性苗叶片基因组dna，利用潮霉素片段引物进行pcr扩增验证。

40、第五方面，本发明提供上述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。所述育种目的是：调控由 novel_mir276参与或主导的毛竹细胞壁木质素生物合成过程。具体地，采用本发明获得的转基因植物进行再次转基因或进行杂交、回交、自交或无性繁殖。

41、本发明的有益效果在于：

42、本发明首次揭示了 novel_mir276的生物学功能，通过构建 novel_mir276表达载体，结合农杆菌介导的遗传转化法，异源转化水稻，考察 novel_mir276对转基因水稻细胞壁木质素生物合成的影响，为毛竹转基因研究提供有力工具，为毛竹材性改良分子育种提供有价值的候选基因。

技术特征：

1.一种与细胞壁木质素生物合成相关的新型mirna，其特征在于，所述新型mirna命名为novel_mir276；所述novel_mir276的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.含有权利要求1所述新型mirna的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括：重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

3.权利要求1所述新型mirna或权利要求2所述的生物材料在实现以下任一项或多项中的应用：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述新型mirna调控细胞壁中木质素的合成，提升植物抗逆能力。

5.根据权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于，利用所述新型mirna或所述生物材料制备转基因植物；

6.一种调控植物细胞壁木质素生物合成的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，在植物中增加novel_mir276表达量，降低植物细胞壁木质素生物合成能力；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过表达的方式选自以下1）~5），或1）~5）任选的组合：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用农杆菌介导法将novel_mir276转入到水稻植株中，获得novel_mir276过表达的转基因水稻植株；

9.权利要求6-8任一项所述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述育种方法包括：转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

技术总结
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控木质素生物合成的毛竹miRNA序列及应用。本发明所提供的miRNA命名为novel_miR276，novel_miR276的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次从毛竹中获得novel_miR276序列并通过在水稻中过表达该序列验证了其生物学功能。novel_miR276具有调控植物细胞壁木质素生物合成的功能，为竹子在细胞壁方面的适应性进化提供了重要的理论依据，也为竹子分子育种提供了候选基因资源。

技术研发人员：李雪平,高圆梦,李英,林小芳,韩莉
受保护的技术使用者：国际竹藤中心
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23