制造寡核苷酸的方法与流程
本发明涉及制造寡核苷酸的方法。
背景技术：
1、在dna寡核苷酸、rna寡核苷酸等核酸的化学合成中，广泛使用亚磷酰胺法。在亚磷酰胺法中，典型地，寡核苷酸是通过在合适的活化剂的存在下向核苷、核苷酸或寡核苷酸依次加成核苷亚磷酰胺而合成的。
2、在亚磷酰胺法中，通常核苷亚磷酰胺以相对于理论量为1.5～10.0倍的量使用。核苷亚磷酰胺在合成原料中也是昂贵的，因此如果能够削减核苷亚磷酰胺的用量，则可期待生产成本的大幅削减。
3、然而，迄今为止尚未知有在削减核苷亚磷酰胺的用量的同时以良好的纯度得到寡核苷酸的方法。
4、关于寡核苷酸的合成反应，专利文献1中记载了各反应温度在约0℃～约27℃下进行，专利文献2中记载了反应温度优选为0～100℃，更优选为20～50℃，特别优选为20～30℃，但没有记载在抑制合成工序中的核苷亚磷酰胺的反应容器内残留量、削减核苷亚磷酰胺的用量的同时以良好的纯度得到寡核苷酸的方法。
5、现有技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：日本特开昭60-67494号
8、专利文献2：国际公开第2017/111137号
技术实现思路
1、发明所要解决的课题
2、本发明的目的在于，提供一种在制造寡核苷酸的方法中抑制核苷亚磷酰胺的反应容器内残留量、削减核苷亚磷酰胺的用量的方法。
3、用于解决课题的手段
4、本发明者们对制造寡核苷酸的方法进行了深入研究，其中发现，通过使寡核苷酸的制造工序中的溶液的温度为低温，能够抑制合成工序中的核苷亚磷酰胺的反应容器内残留量，能够削减核苷亚磷酰胺的用量。进而基于该见解进一步继续研究，结果完成了本发明。
5、即，本发明涉及以下。
6、[1]一种制造寡核苷酸的方法，其包含下述工序：
7、(a)使保护基从直接或间接负载于载体、在3’位或5’位的羟基、巯基或氨基键合有所述保护基的保护核苷脱离的工序，
8、(b)使核苷亚磷酰胺在活化剂的存在下与保护基脱离的、直接或间接负载于载体的核苷的3’位或5’位的羟基、巯基或氨基键合的工序，
9、(c)对通过工序(b)形成的键进行硫化或氧化的工序，以及
10、(d)对直接或间接负载于载体的核苷中的未键合的3’位或5’位的羟基、巯基或氨基进行封端(capping)的工序；
11、其中，(a)～(d)中的任一工序中的溶液的温度为0～20℃。
12、[2]根据[1]所述的方法，其中，所述工序(b)中使用的所述核苷亚磷酰胺的量为所述负载的核苷的1.0～2.0倍当量。
13、[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，(a)～(d)中的任一工序中的溶液的温度为5～15℃。
14、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述活化剂选自4,5-二氰基咪唑、5-(乙硫基)-1h-四唑、5-(苄硫基)-1h-四唑和邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑。
15、发明效果
16、通过使寡核苷酸的制造中的各工序中的溶液的温度为低温，能够抑制合成工序中的核苷亚磷酰胺的反应容器内残留量，能够在削减作为昂贵材料的核苷亚磷酰胺的用量的同时，以良好的纯度得到寡核苷酸。
17、虽然不希望被特定的理论约束，但认为核苷亚磷酰胺在反应容器内的残留是由于核苷亚磷酰胺在偶联工序中与通过寡核苷酸的磷酸部位的2-氰基乙基(cnet)保护基非期望地脱离而形成的羟基键合而发生的，变得无法参与链长伸长反应(与直接或间接负载于载体的核苷的5’或3’末端羟基的反应)，其结果通过使溶液的温度为低温，与由于cnet保护基的脱离而形成的寡核苷酸的羟基键合而消耗的核苷亚磷酰胺量减少，实现了核苷亚磷酰胺的用量削减。
技术特征：
1.一种制造寡核苷酸的方法，其包含下述工序：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工序(b)中使用的所述核苷亚磷酰胺的量为所述负载的核苷的1.0～2.0倍当量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，(a)～(d)中的任一工序中的溶液的温度为5～15℃。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述活化剂选自4,5-二氰基咪唑、5-(乙硫基)-1h-四唑、5-(苄硫基)-1h-四唑和邻磺酰苯甲酰亚胺1-甲基咪唑。
技术总结
本发明的目的在于提供一种在制造寡核苷酸的方法中抑制合成工序中的核苷亚磷酰胺的反应容器内残留量、削减核苷亚磷酰胺的用量的方法。一种制造寡核苷酸的方法，其包含下述工序：(a)使保护基从直接或间接负载于载体、在3’位或5’位的羟基、巯基或氨基键合有所述保护基的保护核苷脱离的工序，(b)使核苷亚磷酰胺在活化剂的存在下与保护基脱离的、直接或间接负载于载体的核苷的3’位或5’位的羟基、巯基或氨基键合的工序，(c)对通过工序(b)形成的键进行硫化或氧化的工序，以及(d)对直接或间接负载于载体的核苷中的未键合的3’位或5’位的羟基、巯基或氨基进行封端(capping)的工序；其中，(a)～(d)中的任一工序中的溶液的温度为0～20℃。通过所述方法等，解决了上述课题。
技术研发人员：吉田敬,饭田智祥,岩本正史,前田惠里,松並淳
受保护的技术使用者：日东电工株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23