一株与大豆或花生共生结瘤的耐酸耐重金属日本慢生根瘤菌及其发酵工艺与应用的制作方法

本发明属于微生物肥料领域，涉及到一株日本慢生根瘤菌在大豆和花生栽培时的应用及其发酵生产工艺，尤其涉及能使大豆和花生在中国南方酸性重金属污染土壤栽培时高效结瘤并达到高产的根瘤菌。

背景技术：

1、地球大气层的氮气含量大概1015吨，每年参与氮循环的约3×109吨氮气，从固氮方式来说，10％是闪电，25％是肥料工业合成氮肥，60％是生物固氮，而由豆科植物-根瘤菌共生体系固定的氮素占全部生物固氮量的2/3以上。随着化学合成氮肥的广泛使用，以当前的氮合成技术和氮肥的利用率水平，无论从经济成本还是生态成本，未来化学合成氮肥终将逐步减少。这使得生物固氮大有可为。100多年来生物固氮一直受到科学家的关键并持续不断地开展研究、开发产品，目前已在全球多个国家和地区的农业生产中广泛应用。

2、但是，盐碱地、不适ph值、重金属、营养缺陷、矿物质毒性、极端温度、旱情或涝害等环境条件，会降低甚至完全抑制生物固氮的效率。特别是酸性土壤(ph<5.5)，全球面积达适耕地的50％。中国酸性土壤占国土总面积的22.7％，主要分布在南方高温多雨的红壤地区，遍及14个省(自治区、直辖市)，是主要的粮食生产区。全球范围内，仅5.4％的酸性土壤被用作种植农作物，种植农作物的酸性土壤面积仅占世界农作物总面积的12％，酸性土壤中蕴藏着农业发展的最大潜力。大量氮肥施用和酸沉降被认为是导致土壤酸化加速的主要原因，因此，耐酸性固氮根瘤菌不仅能减少氮肥的使用从而减少温室气体排放，而且能延缓土壤酸化、提高农业生产产量，促进农业可持续发展。

3、我国现有的固氮根瘤菌产品多由北方地区选育和应用，适用我国南方红壤地区豆科作物大豆、花生栽培的固氮根瘤菌株尚未见报导，也无产品供应。少量在南方地区销售的根瘤菌剂也来自北方，在南方酸性土壤的适应性未见报导。本发明考察了个别市售花生根瘤菌的田间试验情况，虽然有一定的固氮促生长作用，但对花生和大豆的增产效果不及本发明所述。而且，酸性土壤及其重金属污染对花生和大豆的负面影响也是需要面对的问题。因此，寻找一种既适应酸性土壤环境，又对重金属有一定抗性的菌株是当务之急。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株日本慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)1081cm010001保藏编号为：cgmcc no.27463。

2、该菌株能使大豆、花生在酸性和重金属污染土壤高效结瘤并达到高产，减少氮肥使用量，节约成本，更加环保。

3、该菌株分类命名：日本慢生根瘤菌bradyrhizobium japonicum。

4、保藏时间：2023年5月25日。

5、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称cgmcc)。

6、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

7、保藏编号：cgmcc no.27463。

8、菌株的鉴定：该菌株采取自郴州资兴区花生根瘤，经分离纯化后获得。细胞杆状、不直，革兰氏染色阴性，菌体大小为0.4-0.6μm.在酵母膏-甘露醇-无机盐琼脂(ym)培养基上，培养7天：菌落圆形，凸起，半透明，乳白色，直径1-2mm。好氧生长，在btb培养基上产碱。16s rdna序列和gyrb基因序列分析：从菌体提取基因组dna，采用通用引物进行扩增，pcr产物测序。所测序列经校对、拼接后与genbank数据库中相关种属的序列进行blast比较，结果表明，该菌株的16s rdna序列和gyrb基因序列与日本慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)序列的同源性分别为100％和99％。

9、本发明所述的日本慢生根瘤菌，具有以下特性：

10、1)耐酸性能，在ph 5.4的培养平板上培养，能生长菌落；

11、2)具有固氮能力，能够在花生和大豆上共生结瘤，适合应用于酸性土壤花生和大豆栽培；

12、3)对重金属具有耐受性。

13、所述的重金属包括：cr、cd、zn、mn、cu、pb、co中的至少一种。

14、所述的重金属cr、cd、zn、mn、cu、pb、co对菌株1081cm010001的最低抑制浓度分别为：0.4、0.3、50、20、0.5、0.5、0.6mmol·l-1。

15、本发明还提供了所述的日本慢生根瘤菌的应用，用于在含重金属的酸性土壤中固氮。

16、尤其是在花生和大豆上共生结瘤，减少氮肥使用量。

17、本发明还提供了所述的日本慢生根瘤菌的发酵工艺，

18、(1)培养基将甘油作为单一碳源，甘油含量3-12g/l，酵母浸粉含量1-5g/l，mgso4·7h2o含量0.12-0.3g/l，k2hpo4含量0.12-0.3g/l，kh2po4含量0.12-0.3g/l，自然ph值；

19、(2)培养温度26-30℃，搅拌转速140-180r/min，培养周期100-160h。

20、上述发酵工艺发酵后菌浓度可稳定达到1.45×1010/ml。

21、本发明的优点

22、1.本发明通过活性筛选，发现了一株具有良好耐酸性耐重金属的日本慢生根瘤菌，丰富了豆科植物共生根瘤菌菌种资源，在生物固氮方面具有重要的潜在应用价值。

23、2.本发明首次应用甘油作为根瘤菌发酵培养基的单一碳源，成本大幅降低，且市场供应充足，采购便利。

技术特征：

1.一株日本慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)，保藏号：cgmcc no.27463。

2.根据权利要求1所述的日本慢生根瘤菌，其特征在于，具有以下特性：

3.根据权利要求1所述的日本慢生根瘤菌，其特征在于，所述的重金属包括：cr、cd、zn、mn、cu、pb、co中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的日本慢生根瘤菌，其特征在于，所述的重金属cr、cd、zn、mn、cu、pb、co对菌株1081cm010001的最低抑制浓度分别为：0.4、0.3、50、20、0.5、0.5、0.6mmol·l-1。

5.权利要求1-4任一项所述的日本慢生根瘤菌的应用，其特征在于，用于在含重金属的酸性土壤中固氮。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在花生和大豆上共生结瘤，减少氮肥使用量。

7.权利要求1-4任一项所述的日本慢生根瘤菌的发酵工艺，其特征在于，

技术总结
本发明公开了一株与大豆或花生共生结瘤的耐酸耐重金属日本慢生根瘤菌及其发酵工艺与应用。本发明的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，保藏号：CGMCC No.27463。该菌株具有较强的耐酸性，能提高花生和大豆的有效根瘤结瘤数，大豆和花生产量均有显著提高。而且该菌株具有多种重金属抗性，对常见的重金属镉、铬、铅、铜、锰、锌、钴等均具有一定的耐受性，使得该菌株在重金属污染的酸性土壤中均具有较强的适应和繁殖能力。本发明还公开了该菌株的发酵影响因子和发酵工艺参数，该配方采用甘油作为单一碳源，发酵液有效活菌数达到1.45×10<supgt;10</supgt;/mL，具备规模化生产水平。

技术研发人员：刘宇波,刘欢,陈海荣,伍善东,杜东霞,曾艳,莫云,江珍凤,欧阳薇,欧阳登封,单世平
受保护的技术使用者：湖南省微生物研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23