一种乙酰氧肟酸的鉴别方法与流程

1.本发明涉及检测技术领域，更具体的说是涉及一种乙酰氧肟酸的鉴别方法。


背景技术：

2.乙酰氧肟酸作为药物、饲料添加剂和金属选矿剂，在医药、畜牧业和冶金行业广泛使用，但非食品原料，国家明令禁止面粉或面粉处理剂中使用非食品原料，但是目前缺少乙酰氧肟酸在食品领域的鉴定检测研究。
3.现有关于乙酰氧肟酸的文献报道比较少，腾娇琴在酸性条件下，利用乙酰氧肟酸与三价铁离子形成红色络合物，在420nm波长下，用紫外分光光度法进行饲料中乙酰氧肟酸的定量测定；黄淑玲采用乙酰氧肟酸与三氯化铁盐酸溶液显色，在502nm波长下，用紫外分光光度法测定了醋羟胺酸胶囊剂中乙酰氧肟酸的含量；隽英华采用酸性条件下，乙酰氧肟酸与三价铁离子形成红色化合物，利用分光光度法，在420nm对土壤中乙酰氧肟酸进行测定；上述这些文献均是乙酰氧肟酸在非食品领域的方法研究，前处理复杂，引入其他试剂多，干扰大，灵敏度低，专属性差，假阳性率高，不能适用于食品的鉴别和痕量检测。
4.因此，如何提供一种乙酰氧肟酸的鉴别方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种乙酰氧肟酸的鉴别方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种乙酰氧肟酸的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.(1)样品前处理：称取样品，加入溶剂，提取后离心，取上清液稀释过滤，得处理后样品；
9.(2)将步骤(1)处理后样品经液相色谱-质谱检测鉴别；
10.液相色谱条件：
11.色谱柱：t3色谱柱3.0
×
100mm，2.7μm；流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：甲醇；流速0.25ml/min，进样体积：5μl；柱温35℃；梯度洗脱程序如表1：
12.表1梯度洗脱程序
[0013][0014]
质谱条件：
[0015]
离子源：大气压化学电离源apci+；扫描方式：多反应监测；离子放电电流：4μa；鞘
气温度：350℃；离子传输管温度：325℃；雾化气流速：45arb；辅助气流速：5arb；气帘气流速：1arb；
[0016]
质谱参数及保留时间表2：
[0017]
表2质谱参数及保留时间
[0018][0019]
优选的：步骤(1)溶剂为甲醇；样品和溶剂的质量体积比为2.5g：10ml。
[0020]
优选的：步骤(1)提取：涡旋10min，超声提取10min。
[0021]
优选的：步骤(1)离心：10000r/min离心5min。
[0022]
优选的：步骤(1)稀释：离心后混匀取上清液，上清液和稀释后的溶液体积比为2：5。
[0023]
优选的：步骤(1)过滤：0.22μm滤膜过滤。
[0024]
本发明提供了上述任一方法在食品检测中的应用。
[0025]
优选的：检测对象为面粉或面粉处理剂。
[0026]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种乙酰氧肟酸的鉴别方法，取得的技术效果为前处理简单，引入干扰小，灵敏度高，专属性强，准确度高，适用于面粉及面粉处理剂中乙酰氧肟酸掺杂的鉴别和检测，具有良好的实际应用价值。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0028]
图1附图为本发明提供的乙酰氧肟酸总离子流图。
[0029]
图2附图为本发明提供的同一溶剂反复提取时的提取效率对比图。
[0030]
图3附图为本发明提供的不同称量质量对提取效率的影响图。
[0031]
图4附图为本发明提供的不同提取方式和提取时间对提取效率的影响图。
[0032]
图5附图为本发明提供的乙酰氧肟酸的分子结构图。
[0033]
图6附图为本发明提供的乙酰氧肟酸的子离子扫描图。
[0034]
图7附图为本发明提供的面粉处理剂中乙酰氧肟酸的总离子流图。
具体实施方式
[0035]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
本发明实施例公开了一种乙酰氧肟酸的鉴别方法。
[0037]
实施例中，所需原料、设备均为市售原料，未提及的方法为常规实验方法，例如：
[0038]
thermo scientific
tm
tsq altis
tm
三重四极杆质谱仪(配大气压化学电离源apci)、fa2204n电子天平(上海精密仪器表有限公司)；multi-tube vortexer vx
‑ⅲ
型多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；kq-500tdb超声清洗仪(上海沪粤明科学仪器有限公司)；mili-q超纯水机(美国millipore公司)。
[0039]
乙酰氧肟酸(购于中国坛墨质检科技股份有限公司)；甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)，面粉及面粉处理剂购买于本地市场。
[0040]
在此不再赘述。
[0041]
实施例1
[0042]
标准工作溶液配制
[0043]
准确称取乙酰氧肟酸标准品，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1mg/ml的标准储备液，于-4℃避光保存。准确移取乙酰氧肟酸标准储备液，用甲醇稀释配制成浓度为10μg/ml的混合标准中间液。然后用甲醇稀释配制成浓度为0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.50μg/ml、1.00μg/ml、2.00μg/ml、5.00μg/ml的系列标准工作溶液。
[0044]
样品前处理
[0045]
面粉前处理：准确称取试样2.5g(精确至0.001g)，置于50ml具塞离心管中，准确加入10ml甲醇(最终提取溶剂)，涡旋10min，超声提取10min，10000r/min离心5min，混匀，取上清液2ml，至5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
[0046]
面粉处理剂前处理：准确称取试样2.5g(精确至0.001g)，置于50ml具塞离心管中，准确加入10ml甲醇(最终提取溶剂)，涡旋10min，超声提取10min，10000r/min离心5min，取上清液2ml，至5ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
[0047]
仪器分析条件
[0048]
液相色谱
[0049]
色谱条件为：色谱柱：t3色谱柱3.0
×
100mm，2.7μm；流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：甲醇；流速0.25ml/min，进样体积：5μl；柱温35℃；梯度洗脱程序具体如表1：
[0050]
表1梯度洗脱程序
[0051][0052]
质谱条件
[0053]
离子源：大气压化学电离源apci+；扫描方式：多反应监测；离子放电电流：4μa；鞘气温度：350℃；离子传输管温度：325℃；雾化气流速：45arb；辅助气流速：5arb；气帘气流速：1arb；
[0054]
质谱参数及保留时间表2：
[0055]
表2质谱参数及保留时间
[0056][0057]
*：定量离子。
[0058]
对比实验1
[0059]
处理条件的优化
[0060]
溶剂的选择
[0061]
由于乙酰氧肟酸为强极性弱酸化合物，易溶于水、甲醇、乙醇。根据相似相溶原理，实验比较了水、甲醇、乙醇、甲醇/水(5：5，v：v)、乙腈/水(8：2，v：v)五种提取溶剂的提取效率，由于面粉处理剂中多含有淀粉，提取溶剂中如加水，导致面粉处理剂呈现粘稠、糊化，无法获得澄清滤液；甲醇作为提取溶剂，样品提取液均澄清，而且以甲醇为提取溶剂时，提取效率最佳。
[0062]
故选择甲醇为最终提取溶剂。
[0063]
对比实验2
[0064]
直接将甲醇提取后的样品溶液注入液相色谱-质谱仪测试时，存在严重的溶剂效应，色谱峰形差，严重拖尾，实验考察了甲醇提取液和水的比例为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9的不同比例时的色谱峰形，显示在水的比例大于60％时可以完全消除溶剂效应改善峰形。因此考虑用甲醇提取，提取后溶液量取2ml，加水稀释至5ml，摇匀过滤后再上机测定，见图1。
[0065]
对比实验3
[0066]
提取体积的选择
[0067]
称取2.5g样品，加入标准溶液，用5ml甲醇，振荡提取10min，超声提取10min，4℃8000r/min离心5min，取出全部上清液，量取2ml，加水稀释至5ml，摇匀过滤后再上机测定。
[0068]
向剩余残渣中继续加入5ml甲醇，重复上述操作后的溶液均上机测定。通过3次加入5ml同一溶剂反复提取进行对提取溶剂体积用量的考察，结果见图2。
[0069]
结果表明，第一次5ml溶剂提取时，回收率达到68.24％～73.52％，第二次5ml溶剂提取时，回收率在20.86％～27.21％，第三次5ml溶剂提取时，回收率在3.06％～4.90％。第一次和第二次提取的回收率之和达到90.16％～96.80％，且第三次的提取回收率均不足5％，因此前两次提取已经基本提取完全，为了节约溶剂，最终选择提取体积为10ml。
[0070]
对比实验4
[0071]
称量质量的确定
[0072]
分别称取样品0.5g、1.0g、2.0g、2.5g、5.0g，分别加入标准溶液，模拟阳性样品，用10ml甲醇，振荡提取10min，超声提取10min，4℃8000r/min离心5min，取上清液2ml，加水稀释至5ml，摇匀过滤后再上机测定，结果见图3。结果显示，称样量对回收率的影响不大，两种样品加标回收率在81.18％～108.17％之间，均能满足实验要求。考虑到检出限和节约样品量，最终采用的称样量为2.5g。
[0073]
对比实验5
[0074]
提取方式和提取时间的优化
[0075]
称取2.5g样品，向空白基质样品中加入一定量的乙酰氧肟酸标准品，用10ml甲醇，根据涡旋振荡时间和超声提取时间的不同来考察最佳提取方式和提取时间，提取溶液在4℃下8000r/min离心5min，量取2ml，加水稀释至5ml，摇匀过滤后再上机测定，结果见图4。结果表明，对于加标样品，提取方式和提取时间对回收率影响不明显。而阳性样品中，在涡旋振荡10min的基础上，继续超声10min、20min、30min对提取效果影响不明显(81.6％～90.0％)，但是不进行超声提取则面条阳性样中目标物回收率明显降低(26.3％～28.2％)，小麦粉处理剂阳性样中目标物回收率略微有所降低(77.1％～79.5％)。而固定超声时间为10min，而振荡时间分别为10min、20min、30min时，对提取效果的影响不明显(82.9％～91.9％)，不振荡时两种基质阳性样回收率均有所降低(59.4％～69.2％)。综合考虑提取效率和时间成本，最终选择涡旋振荡10min，超声提取10min，作为最优的提取方式和时间。
[0076]
实施例2
[0077]
采用蠕动泵直接注入乙酰氧肟酸标准溶液(1μg/ml)优化各参数。乙酰氧肟酸分子结构见图5，分子量为75.07，采用大气压化学电离源进行离子化，在q1全扫描模式下得到氢生成母离子[m+h]+；然后采用production模式，通过改变碰撞能，对子离子进行扫描，图6为碰撞能为10ev下，乙酰氧肟酸的子离子扫描图，从图中可看出乙酰氧肟酸碎片信息很丰富，主要为34.14、57.97、43.07的碎片离子。然后将q1ms模式下找到的母离子[m+h]+及production模式找到的所有碎片离子导入mrm扫描模式的列表中，对碰撞能等参数进行系统优化，发现所有碎片离子中34.14、43.07的丰度最高，而且在实际样品的测定中信号稳定且无干扰的离子，因此优选34.14、43.07的碎片作为监测子离子。
[0078]
线性范围、检出限、定量限、回收率和精密度
[0079]
将配制的基质标准工作曲线溶液(空白基质溶液配的标准工作曲线溶液，消除基质效应)注入液相色谱-大气压化学电离源-串联质谱仪进行检测，以标准工作溶液峰面积(y)为纵坐标，以标准工作溶液的浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，结果表明该法在浓度为0.025～5.0μg/ml范围内，相关系数r大于0.9990，线性良好。
[0080]
对比实验6
[0081]
采用在空白样品基质中添加目标化合物的方法，确定方法的检出限与定量限。以对应色谱峰响应值3倍信噪比的质量浓度作为方法检出限，以能够准确定量的曲线浓度最低点作为方法的定量限。
[0082]
采用在空白面粉和面粉处理剂中添加定量限、2倍定量限、10倍定量限的乙酰氧肟酸进行加标回收试验，验证方法准确度和精密度。每个浓度水平平行测定6次取平均值，计算回收率和精密度，见表3。
[0083]
表3乙酰氧肟酸的检出限、定量限、线性范围、加标回收率和精密度
[0084][0085]
实施例3
[0086]
样品测定
[0087]
对市售的和稽查获得的20批次面粉及20批次面粉处理剂的样品，按照本发明进行样品中的乙酰氧肟酸测定，方法适用性好，发现1个面粉处理剂阳性样品，检出含量为26.1mg/kg，见图7。
[0088]
综上，本发明建立了面粉和面粉处理剂中乙酰氧肟酸的液相色谱-质谱鉴别流程。目标化合物经甲醇提取，水稀释后直接上机测定，前处理操作简单。优化后的液相色谱-质谱方法溶剂效应低，采用基质标准曲线外标法进行定量测定，简化了实验步骤。方法操作简单、灵敏度高、准确度好、稳定可靠，适用于面粉和面粉处理剂中乙酰氧肟酸的测定，同时为建立相关标准及监管部门风险监控提供技术支持。
[0089]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0090]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种乙酰氧肟酸的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：称取样品，加入溶剂，提取后离心，取上清液稀释过滤，得处理后样品；(2)将步骤(1)处理后样品经液相色谱-质谱检测鉴别；所述液相色谱条件：色谱柱：t3色谱柱3.0
×
100mm，2.7μm；流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：甲醇；流速0.25ml/min，进样体积：5μl；柱温35℃；梯度洗脱程序如表1：表1梯度洗脱程序质谱条件：离子源：大气压化学电离源apci+；扫描方式：多反应监测；离子放电电流：4μa；鞘气温度：350℃；离子传输管温度：325℃；雾化气流速：45arb；辅助气流速：5arb；气帘气流速：1arb；质谱参数及保留时间表2：表2质谱参数及保留时间2.如权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述溶剂为甲醇；所述样品和溶剂的质量体积比为2.5g：10ml。3.如权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述提取：涡旋10min，超声提取10min。4.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述离心：10000r/min离心5min。5.如权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述稀释：离心后混匀取上清液，所述上清液和稀释后的溶液体积比为2：5。6.如权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述过滤：0.22μm滤膜过滤。7.权利要求1～6任一所述方法在食品检测中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，检测对象为面粉或面粉处理剂。

技术总结
本发明公开了一种乙酰氧肟酸的鉴别方法。涉及检测技术领域。包括：样品前处理：称取样品，加入溶剂，提取后离心，取上清液稀释过滤，得处理后样品；液相色谱-质谱检测鉴别。本发明建立了面粉和面粉处理剂中乙酰氧肟酸的液相色谱-质谱鉴别流程。目标化合物经甲醇提取，水稀释后直接上机测定，前处理操作简单。优化后的液相色谱-质谱方法溶剂效应低，采用基质标准曲线外标法进行定量测定，简化了实验步骤。方法操作简单、灵敏度高、准确度好、稳定可靠，适用于面粉和面粉处理剂中乙酰氧肟酸的测定，同时为建立相关标准及监管部门风险监控提供技术支持。技术支持。技术支持。


技术研发人员：袁利杰 张培毅 李彤辉 凡猛 武文凯 陈纯 袁阳蕾 石璐 陈家旭 宁亚萍 谷瑞丽
受保护的技术使用者：河南省食品检验研究院
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/1/6