LDLRAD4作为微小残留病标志物在预测成人B-ALL患者预后中的应用

ldlrad4作为微小残留病标志物在预测成人b-all患者预后中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及ldlrad4作为微小残留病标志物在预测成人b-all患者预后中的应用。


背景技术：

2.尽管新药及异基因造血干细胞移植等明显提高了成人b系急性淋巴细胞白血病(b-cell acute lymphoblastic leukemia,b-all)的完全缓解率(complete remission,cr)和长期存活率，但仍有相当一部分患者最终出现复发，其5年的无病生存率(disease-free survival,dfs)仅为30％～40％。根据2021年nccn指南[相关文献：brown pa,shah b,advani a,et al.acute lymphoblastic leukemia,version 2.2021,nccn clinical practice guidelines in oncology.j natl compr canc netw.2021；19(9):1079-1109.]，患者年龄、初诊时白细胞计数、免疫表型、细胞遗传学、微小残留病(minimal residual disease,mrd)等是对其进行预后评估的重要指标。b-all相关的染色体易位造成的融合基因，如bcr-abl1、mll重排等，已为人们所认知并在临床诊疗中发挥重要作用[相关文献：yeung dto,osborn mp,white dl.b-cell acute lymphoblastic leukaemia:recent discoveries in molecular pathology,their prognostic significance,and a review of the current classification.br j haematol.2022；197(1):13-27.]。此外，诱导治疗后和巩固治疗期间mrd的监测是预示疾病复发的重要指标之一。多参数流式细胞术(muti-parameter flow cytometry,mfc)是实验室监测mrd的主要方法之一，但文献报道mfc-mrd阴性患者的复发率高于预期，基于流式细胞术监测mrd存在假阴性的结果[cheng s,inghirami g,cheng s,tam w.simple deep sequencing-based post-remission mrd surveillance predicts clinical relapse in b-all.j hematol oncol.2018；11(1):105.]及现存的分子标记物并不能将所有高危患者甄别出来，因此临床上亟需探索新的、灵敏度和特异度更高的mrd的标志物，完善和补充mrd的监测体系。
[0003]
低密度脂蛋白受体a家族结构域4(low density lipoprotein receptor class a domain containing 4，ldlrad4)基因，也称为18号染色体开放阅读框1抗体(chromosome 18open reading frame 1，c18orf1)，定位于染色体18p11.2。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是如何预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的预后和/或如何预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的风险和/或如何以ldlrad4分子作为新的微小残留病变(mrd)监测指标预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的复发风险或预后。
[0005]
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了预测或辅助预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后的装置。所述装置可包括如下模块：
[0006]
b1)数据获取模块：用于获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的表达量和作为内参基因的abl1基因的表达量；
[0007]
b2)数据处理模块：用于将所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值转换为预后的风险值，比值小于7.73％的风险值为1，比值大于等于7.73％的风险值为0；
[0008]
b3)数据输出模块：用于根据所述风险值输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后的预测结果：所述风险值为1的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的预后差于所述风险值为0的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后。
[0009]
所述预后差为无白血病生存时间短和/或累积复发率高；所述预后好为无白血病生存时间长和/或累积复发率低。
[0010]
所述预后可为无白血病生存时间和/或累积复发率。
[0011]
所述非仅接受化疗可为接受巩固化疗2-4疗程后进行异基因造血干细胞移植。
[0012]
上述装置中，所述比值可通过包括如下步骤的方法实现：
[0013]
b1-1)通过荧光定量pcr获得abl1和ldlrad4的扩增曲线；
[0014]
b1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；
[0015]
b1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；
[0016]
b1-4)通过式i获取所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值：
[0017]
ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i。
[0018]
所述治疗可为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
[0019]
所述治疗方式还可为接受异基因造血干细胞移植。
[0020]
为了解决上述技术问题，本发明还提供了预测或辅助预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的装置。所述装置可包括如下模块：
[0021]
a1)数据获取模块：用于获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的独立危险因素结果，包括：待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的治疗方式、治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的相对表达量和治疗后骨髓单个核细胞中csrp2基因的相对表达量，以及内参基因的表达量；
[0022]
a2)数据处理模块：用于将所述独立危险因素结果转换为所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的风险值：所述治疗方式为仅接受化疗患者的所述复发的风险值为1，治疗方式为非仅接受化疗患者的复发的风险值为0；所述ldlrad4基因的相对表达量低的所述复发的风险值为1，否则为0；所述csrp2基因的相对表达量高的所述复发的风险值为1，否则为0；
[0023]
a3)数据输出模块：用于根据所述风险值的总和，输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的预测结果：所述风险值的总和高的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的累积复发率高于所述风险值的总和低的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者；
[0024]
所述ldlrad4基因的相对表达量可为所述ldlrad4基因的表达量与所述内参基因的表达量的比值。所述csrp2基因的相对表达量可为所述csrp2基因的表达量与所述内参基
因的表达量的比值。
[0025]
上述装置中，所述治疗可为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
[0026]
上述装置中，所述ldlrad4基因的相对表达量的获取可通过包括如下步骤的方法实现：
[0027]
a1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和ldlrad4的扩增曲线；
[0028]
a1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；
[0029]
a1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；
[0030]
a1-4)通过式i获取所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述ldlrad4基因的相对表达量：
[0031]
ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i。
[0032]
所述csrp2基因的相对表达量的获取可通过包括如下步骤的方法实现：
[0033]
d1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和csrp2的扩增曲线；
[0034]
d1-2)通过所述abl1和csrp2的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及csrp2的ct值；
[0035]
d1-3)使用所述abl1的ct值及csrp2的ct值根据abl1的标准曲线获得所述csrp2的拷贝数和所述abl1的拷贝数；
[0036]
d1-4)通过式ⅱ获取所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述csrp2基因的相对表达量：
[0037]
csrp2的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式ⅱ。
[0038]
所述治疗方式还可为接受异基因造血干细胞移植。
[0039]
上述装置中，所述ldlrad4基因的相对表达量低为所述ldlrad4基因的相对表达量可为小于7.73％。所述csrp2基因的相对表达量高为所述csrp2基因的相对表达量大于等于0.93％。
[0040]
上文所述拷贝数的计算公式可为：基因拷贝数＝10^((37.4288-ct值)/3.13))。
[0041]
检测成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后ldlrad4基因的表达量的物质在制备预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0042]
所述治疗可为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
[0043]
所述预后可为无白血病生存时间。
[0044]
成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后ldlrad4基因的表达量作为生物标志物在制备预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0045]
所述治疗可为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
[0046]
所述预后可为无白血病生存时间。
[0047]
为了解决上述技术问题，本发明还提供了存储有计算机程序的计算机可读存储介质。所述计算机程序可使计算机执行如下步骤：
[0048]
c1)获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的独立危险因素结果，包括：待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的治疗方式、治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的相对表达量和治疗后骨髓单个核细胞中csrp2基因的相对表达量；
[0049]
c2)将所述独立危险因素结果转换为所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的风险值：所述治疗方式为仅接受化疗的所述复发的风险值为1，治疗方式为非仅接受化疗患者的所述复发的风险值为0；所述ldlrad4基因的相对表达量低的所述复发的风险值为1，否则为0；所述csrp2基因的相对表达量高的所述复发的风险值为1，否则为0；
[0050]
c3)根据所述风险值的总和，输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的预测结果：所述风险值的总和高的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的累积复发率高于所述风险值的总和低的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者。
[0051]
上述计算机可读存储介质中，所述ldlrad4基因的相对表达量的获取可通过包括如下步骤的方法实现：
[0052]
a1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和ldlrad4的扩增曲线；
[0053]
a1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；
[0054]
a1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；
[0055]
a1-4)通过式i获取所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述ldlrad4基因的相对表达量：
[0056]
ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i。
[0057]
所述csrp2基因的相对表达量的获取可通过包括如下步骤的方法实现：
[0058]
d1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和csrp2的扩增曲线；
[0059]
d1-2)通过所述abl1和csrp2的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及csrp2的ct值；
[0060]
d1-3)使用所述abl1的ct值及csrp2的ct值根据abl1的标准曲线获得所述csrp2的拷贝数和所述abl1的拷贝数；
[0061]
d1-4)通过式ⅱ获取所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述csrp2基因的相对表达量：
[0062]
csrp2的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式ⅱ。
[0063]
所述治疗可为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
[0064]
所述治疗方式还可为接受异基因造血干细胞移植。
[0065]
本发明的实施例中单因素分析结果表明ldlrad4低表达是成人b-all患者lfs[hr 0.53,95％ ci(0.33-0.86)；p＝0.01]的不良预后因素；竞争风险模型单因素分析结果显示两轮巩固化疗结束时ldlrad4低表达是成人b-all复发的独立危险因素，ldlrad4低、中、高表达组成人b-all患者5年cir分别为74.86％、41.14％、22.00％(p＝0.01)，5年nrm分别为0.00％、9.20％、5.30％(p＝0.45)。纳入初诊时wbc(≥vs.《11.99
×
109/l)、初诊时bcr/abl1、治疗方式(仅接受化疗或接受异基因造血干细胞移植)、两轮巩固化疗结束时csrp2转
lymphoblastic leukemia.j natl compr canc netw.2012；10(7):858-914.]。
[0074]
本发明实施例中的治疗方案如下：
[0075]
所有患者接受诱导化疗，若患者达完全缓解，给予巩固治疗2疗程；2疗程巩固化疗后，部分患者再进行0-2疗程巩固化疗后行造血干细胞移植；未移植的患者继续接受巩固治疗1到1.5年，后继续进行维持化疗至少1年。诱导化疗方案包括codpl(环磷酰胺800mg/m2/d，d1和d15即在治疗第1和15天各给予1次；长春新碱1.5mg/m2/d，d1,8,15,22；柔红霉素45mg/m2/d，d1-3和d15-17；泼尼松60mg/m2/d，d1-19；左旋门冬酰胺酶10,000u/m2/d，d19-28)和codp(不含左旋门冬酰胺酶，其他与codpl相同)。达到cr1的患者无论血细胞浓度如何均接受巩固治疗。巩固治疗方案包括hyper-cvad(b)(甲氨蝶呤1g/m2/d,d1；和阿糖胞苷6g/m2/d，d2-7)；hyper-cvad(a)(环磷酰胺600mg/m2/d，d1-3；柔红霉素50mg/m2/d，d4-5；长春新碱2mg/m2/d，d4；地塞米松40mg/d，d1-4和d11-14)；甲氨蝶呤和左旋门冬酰胺酶(甲氨蝶呤1g/m2/d，d1；左旋门冬酰胺酶10,000u/m2/d，d2-8)或cam(环磷酰胺800mg/m2/d，d1；阿糖胞苷100/m2/d，d1-7；6-巯基嘌呤75mg/m2/d口服，d1-7)，交替应用。维持治疗包括6-巯基嘌呤50mg/m2/d口服，每天1次和甲氨蝶呤20mg/m2/d口服，每周1次。中枢神经系统白血病预防：患者在诱导和巩固化疗期间接受8～10次三联药物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松)鞘内注射[相关文献：yan ch,jiang q,wang j,xu lp,liu dh,jiang h,chen h,zhang xh,liu ky,huang xj.superior survival of unmanipulated haploidentical hematopoietic stem cell transplantation compared with chemotherapy alone used as post-remission therapy in adults with standard-risk acute lymphoblastic leukemia in first complete remission.biol blood marrow transplant.2014sep；20(9):1314-21.]。62例(78.48％)患者接受异基因造血干细胞移植，19例(30.65％)hla全相合，43例(69.35％)hla半相合。hla全合移植患者，预处理方案包括：阿糖胞苷、环磷酰胺、白舒菲以及甲环己亚硝脲。对hla不合/单倍体移植患者，预处理方案加用抗人胸腺球蛋白。所有供者均接受rhg-csf 5μg/(kg
·
d)，连续皮下注射5～6天。第4天采集骨髓，有核细胞要求达3～4
×
108/kg；第5～6天应用cobe血细胞分离机采集外周血干细胞，循环总量约10l，总单个核细胞达3～4
×
108/kg；所有采集物根据供受者abo血型相合程度进行必要的去红和/或去浆处理后立即回输给患者。移植物抗宿主病预防采用环孢素、骁悉和短程环磷酰胺联合方案[相关文献：huang xj,liu dh,liu ky,xu lp,chen h,han w,chen yh,zhang xh,lu dp.treatment of acute leukemia with unmanipulated hla-mismatched/haploidentical blood and bone marrow transplantation.biol blood marrow transplant.2009feb；15(2):257-65.]。
[0076]
本发明实施例中的评价终点如下：
[0077]
总生存(overall survival,os)定义为从收治开始至死亡或观察截止的时间。无白血病生存(leukemia-free survival,lfs)定义为从cr1开始至第1次复发或死亡的时间。累积复发(cumulative incidence of relapse,cir)定义为从cr1开始至第1次复发的时间，非复发死亡(nonrelapse mortality,nrm)定义为从cr1开始至死亡的时间，期间未发生疾病进展或者复发。观察截止时间为2021年6月1日。
[0078]
本发明实施例中的统计学分析方法如下：
[0079]
采用graphad prism 5.0、r软件4.0.3统计软件进行数据分析。计数资料以百分比
表示，组间比较采用χ2检验或fisher确切概率法。计量资料以中位数(范围)表示，非正态分布资料比较应用mann-whitney非参数检验。运用kaplan-meier法计算生存率，log-rank检验进行生存分析，建立cox比例风险回归模型和竞争风险模型分别对ldlrad4基因表达水平及其他可能影响预后的因素(包括初诊时白细胞(white blood cells,wbc)计数、初诊时bcr/abl1、治疗方式(仅接受化疗或接受异基因造血干细胞移植)、第二轮巩固化疗结束时半胱氨酸富含蛋白2(cysteine rich protein 2，csrp2)转录水平)进行多因素分析，研究ldlrad4表达水平对os、lfs、nrm、cir等预后指标的影响。p》0.1变量从模型中去除，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0080]
本发明实施例中的试剂和材料来源如下：
[0081]
dnazol试剂盒：美国invitrogen公司。2
×
universal pcr mastermix：北京天根生物技术有限公司。荧光分子量标准(gene scantmsize standard v2.0)：美国abi公司。高纯度甲酰胺(hi-ditm formamide)：美国abi公司。fast reaction tubes：美国abi公司。nh4cl、nh4hco3粉末：美国sigma公司。
[0082]
本发明实施例中的主要仪器来源如下：
[0083]
超低温冰箱：日本sanyo公司。超净工作台：北京半导体设备厂。低温高速离心机：gs-15r型，美国beckman公司。低速离心机：bfx5-320型，白洋离心机厂。移液器：德国eppendorf公司。nd-1000分光光度计：美国nanodrop公司。分析天平：上海天平仪器厂。abi 3500基因分析仪：美国abi公司。pcr扩增仪：geneamp pcr system 9700型，美国abi公司。定量pcr仪：abl7500fast，美国perkin elmer cetus公司。
[0084]
本发明实施例中的基因组dna提取方法如下：
[0085]
参照dnazol试剂盒(invitrogen公司)说明书在无菌条件下提取基因组dna，方法为：抽取2-3ml骨髓液，置于乙二胺四乙酸(edta)抗凝管中抗凝，骨髓标本应用红细胞裂解液分离单个核细胞。
[0086]
用生理盐水洗涤分离出的单个核细胞2次。加入600μl dnazol试剂，震荡15秒后室温放置5分钟。加入600μl无水乙醇，充分混匀，12000rpm 4℃离心15分钟后，去上清。加入600μl 80％的冷乙醇洗涤一次，室温干燥。加适量的水溶解所提取dna。经nd-1000分光光度计(nanodrop科技有限责任公司)检测浓度后(a260:a280比值均》1.8)。置于-80℃保存。
[0087]
实施例1、ldlrad4表达水平对b-all患者的预后及复发的影响分析
[0088]
1.标本采集
[0089]
成人b系急性淋巴细胞白血病(b-cell acute lymphoblastic leukemia,b-all)患者在治疗前和治疗后(诱导缓解再接受两轮巩固化疗后)，各采集骨髓4ml，加入edta抗凝，应用密度梯度离心法提取单个核细胞。
[0090]
2.ldlrad4和csrp2的表达量测定
[0091]
将b-all患者治疗后采集的骨髓标本加入ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，梯度离心，分离出单个核细胞。采用美国invitrogen公司trizol提取单个核细胞总rna，nanodrop2000检测总rna的浓度和纯度，已制备的总rna置于-80℃保存备用。使用applied biosystems公司的cdna逆转录试剂盒进行逆转录获得cdna。应用primer express 2.0软件设计ldlrad4和csrp2的引物和探针，如下：
[0092]
ldlrad4-fp：5
’‑
cagctataactgcagctctgagct-3’；
lymphoblastic leukemia.haematologica.2013；98:597
–
601]。具体而言，本发明检测ikzf1缺失与否的方法如下：
[0107]
4.1扩增ikzf1基因突变的引物及探针
[0108]
ikzf1基因缺失具体有如下几种情况：ikzf1基因的编码蛋白缺失第4-7个外显子，或缺失第4-8个外显子，或缺失第2-7个外显子，或缺失第2-8个外显子。其中，所述ikzf1基因的genbank登录号为nc_000007.14的50303453-50405101位。扩增ikzf1基因突变的引物和探针及扩增内参的引物和探针序列具体如表1所示。
[0109]
表1.扩增ikzf1基因突变的引物及探针
[0110][0111]
实时定量pcr利用abi7500fast pcr扩增仪完成。pcr反应体系为10μl包括1
×
taqman universal pcr master mix 5μl，900nm引物，250nm探针，1μl dna。pcr步骤：50℃2分钟；95℃10分钟；45个循环(95℃15秒钟；60℃1分钟)。
[0112]
4.2ikzf1δ4-7突变标准质粒的构建
[0113]
ikzf1扩增体系(50μl)：25μl 2
×
universal pcr master mix(天根生物技术有限公司，北京)，400nm引物(c813-fp：5
’‑
ccacagggcaagtcatccacattttg-3’；c814-rp：5
’‑
cagaccatagagtccctcctaggggaaaaa-3’；测序引物：c815:5
’‑
ttcttagaagtctggagtctgtgaaggtca-3’)和300ng模板dna。
[0114]
pcr反应条件为：95℃5min
→
(95℃40sec
→
58℃40sec
→
72℃60sec)36个循环
→
72℃10min。
[0115]
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。切下目的条带，胶回收，纯化。与pmd18-t质粒载体连接。连接后的重组质粒转化大肠杆菌dh5a感受态。筛选阳性克隆提取质粒并纯化。测序验证片段序列的准确性，得到含目的基因的质粒标准品。
[0116]
4.3标准曲线的制备
[0117]
在紫色分光光度计上测定含有目的基因dna的重组质粒的浓度，根据分子量计算
其拷贝数，用灭菌双蒸注射用水1:10稀释梯度，制备成6个系列稀释的定量标准品：106,105，104，103，102，101(拷贝/μl)。按上述实时定量pcr方法进行扩增，得到定量评估目的拷贝数的标准曲线。
[0118]
4.4定量pcr检测izkf1突变灵敏度测定
[0119]
将8例ikzf1突变的all患者dna标本，用灭菌注射用水1:10稀释梯度，制备成6个系列的稀释样品：10-1
，10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
稀释样本。按上述实时定量pcr方法进行扩增，得到检测all患者骨髓样本中ikzf1基因的灵敏度检测结果。
[0120]
5.流式细胞术和染色体核型分析
[0121]
免疫分型检测如前所述，使用流式细胞术常规检测免疫表型[liu yr,yu h,chang y,chen ss.the application of 4-color fluorescence labeling antibodies and its significance in immunophenotyping for leukemia by flow cytometer.zhong guo shi yan xue ye xue za zhi.2002oct；10(5):423-427.]。细胞遗传学分析应用标准g显带方法进行染色体核型分析[相关文献：zhang y,he q,huang xj,jiang h,yang sm,lu j,qing yz,shi y,dang h,qiu jy,lu dp.[cytogenetic study on eosinophilia.zhong guo shi yan xue ye xue za zhi.2007jun；15(3):454-457.]。
[0122]
6.统计学分析结果
[0123]
6.1统计学方法
[0124]
采用graphad prism 5.0、r软件4.0.3统计软件进行数据分析。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验或fisher确切概率法。计量资料以中位数(范围)表示，非正态分布资料比较应用mann-whitney非参数检验。运用kaplan-meier法计算生存率，log-rank检验进行生存分析，建立cox比例风险回归模型和竞争风险模型分别对ldlrad4基因表达水平及其他可能影响预后的因素进行多因素分析，研究ldlrad4表达水平对os、lfs、nrm、cir等预后指标的影响。p》0.1变量从模型中去除，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0125]
6.2统计学分析结果
[0126]
两轮巩固化疗结束时79例b-all患者ldlrad4表达量(相对于abl1的表达量)的中位值为12.87％(范围0.002-59.25％)。通过样本内参基因abl1及目的基因ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值(0.082)得到abl1及ldlrad4的ct值，再根据abl1标准曲线(由于ldlrad4与abl1扩增效率相近，为减少实验误差，均参照abl1标准曲线计算)，得到样本abl1及ldlrad4的拷贝数，基因拷贝数＝10^((37.4288-ct值)/3.13))，以ldlrad4的拷贝数除以abl1的拷贝数为样本ldlrad4的相对表达量(ldlrad4基因的表达量与abl1基因的表达量的比值)。为了与临床常规所发报告的形式一致，结果再乘以百分之百，最终以如下式i的形式呈现：
[0127]
ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝样本ldlrad4的相对表达量(ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值)式i。
[0128]
按照两轮巩固化疗结束时ldlrad4表达水平(相对表达量)由低到高的顺序将79例b-all患者进行排列并四等分，将相对表达量最低的1/4患者作为ldlrad4低表达组(《7.73％，20例)，将相对表达量最高的1/4的患者作为ldlrad4高表达组(》17.56％，20例)，其余2/4患者作为ldlrad4中等表达组(7.73％-17.56％，39例)。各组ldlrad4相对表达的中位值分别为：低表达组2.39％，中等表达组12.87％，高表达组22.5％。
[0129]
csrp2的相对表达量(csrp2基因的表达量与abl1基因的表达量的比值)的获得方法与ldlrad4基因相同，通过如下式ⅱ获得：
[0130]
csrp2的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式ⅱ[0131]
ldlrad4低、中、高表达组间性别、年龄、初诊时白细胞计数、血小板计数、血红蛋白计数和骨髓原始细胞数、bcr-abl1、第二轮巩固化疗结束时流式细胞术检测mrd水平(以0.01％为流式细胞术检测的mrd的阳性阈值[相关文献：hong y,zhao x,qin y,zhou s,chang y,wang y,zhang x,xu l,huang x.the prognostic role of e2a-pbx1 expression detected by real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(rq-pcr)in b cell acute lymphoblastic leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.ann hematol.2018sep；97(9):1547-1554.])、治疗方式均无明显差异。与ldlrad4低表达组相比，ldlrad4中、高表达组中ikzf1缺失阳性率相对较高，ikzf1缺失被认为是成人b-all的预后不良因素之一[相关文献：beldjord k,chevret s,asnafi v,et al.oncogenetics and minimal residual disease are independent outcome predictors in adult patients with acute lymphoblastic leukemia.blood.2014；123(24):3739-3749.]，而本发明中，虽然ldlrad4中、高表达组中ikzf1缺失阳性率高，但其总体预后较ldlrad4低表达组好，提示ldlrad4较高表达可能抵消一些传统预后因素的不良影响(表1)。
[0132]
表1.ldlrad4表达与预后危险因素的关系
[0133][0134][0135]
注：t(9；22)表示9号和12号染色体易位，染色体核型分析即可检测；mrd阳性为mrd》＝0.01％。
[0136]
79例b-all患者中位随访时间为45.67月(7.87～60.00月)，第二轮巩固化疗结束时ldlrad4低、中、高表达组中位os分别为30.18月、51.00月、49.85月；ldlrad4低、中、高表达组患者5年os分别为40.50％、70.50％、72.40％(p＝0.18)(图1中a)，5年lfs分别为25.10％、51.20％、73.0％(p＝0.03)(图1中b)，即ldlrad4低表达组患者5年的lfs差于ldlrad4中、高表达组患者5年的lfs。cox多因素回归分析表明ldlrad4低表达(相对表达量低)是lfs[hr 0.53,95％ ci(0.33-0.86)；p＝0.01]的不良预后因素。
[0137]
竞争风险模型单因素分析结果显示两轮巩固化疗后ldlrad4低表达是复发的独立危险因素。ldlrad4低、中、高表达组患者5年cir分别为74.86％、41.14％、21.95％(p＝0.01)，即ldlrad4低表达组患者5年cir高于ldlrad4中、高表达组患者5年cir；5年nrm分别为0.00％、7.69％、5.00％(p＝0.45)(图1中c-d)。
[0138]
纳入初诊时wbc(》vs.≤11.99
×
109/l)、初诊时bcr/abl1、治疗方式(仅接受化疗或接受异基因造血干细胞移植)、两轮巩固化疗结束时半胱氨酸富含蛋白2(cysteine rich protein 2，csrp2)转录水平等预后相关因素，多因素分析结果显示仅接受化疗(hr4.63(2.12-10.15),p《0.001)、巩固化疗第二疗程结束时骨髓单个核细胞中ldlrad4低表达(相对表达量《7.73％，hr 2.28(1.34-3.89),p＝0.002)和csrp2高表达(相对表达量≥0.93％)，hr 2.65(1.14-6.16),p＝0.02)均是复发的独立危险因素(表2)，多因素预测的roc曲线下面积为0.731(图2)，即仅接受化疗、巩固化疗第二疗程结束时骨髓单个核细胞中ldlrad4低表达和csrp2高表达的b-all患者的累积复发率(cir)高于非仅接受化疗、巩固化疗第二疗程结束时骨髓单个核细胞中ldlrad4中、高表达和csrp2低表达的b-all患者的累积复发率(cir)。
[0139]
表2. 79例b-all患者cir的多因素分析
[0140][0141]
本发明的实验结果表明，两轮巩固治疗后低ldlrad4表达水平是成人b-all患者复发的独立危险因素。本发明可能在补充和完善成人b-all微小残留病变(mrd)的监测系统和b-all的复发评估中发挥重要作用。
[0142]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.预测或辅助预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：b1)数据获取模块：用于获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的表达量和作为内参基因的abl1基因的表达量；b2)数据处理模块：用于将所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值转换为预后的风险值，比值小于7.73％的风险值为1，比值大于等于7.73％的风险值为0；b3)数据输出模块：用于根据所述风险值输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后的预测结果：所述风险值为1的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的预后差于所述风险值为0的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后。所述预后差为无白血病生存时间短和/或累积复发率高；所述预后好为无白血病生存时间长和/或累积复发率低。2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述比值通过包括如下步骤的方法实现：b1-1)通过荧光定量pcr获得abl1和ldlrad4的扩增曲线；b1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；b1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；b1-4)通过式i获取所述所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值：ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
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100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i。3.预测或辅助预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的装置，其特征在于：所述装置包括如下模块：a1)数据获取模块：用于获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的独立危险因素，结果包括：待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的治疗方式、治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的相对表达量和治疗后骨髓单个核细胞中csrp2基因的相对表达量，以及内参基因的表达量；a2)数据处理模块：用于将所述独立危险因素结果转换为所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的风险值：所述治疗方式为仅接受化疗的所述复发的风险值为1，治疗方式为非仅接受化疗患者的所述复发的风险值为0；所述ldlrad4基因的相对表达量低的所述复发的风险值为1，否则为0；所述csrp2基因的相对表达量高的所述复发的风险值为1，否则为0；；a3)数据输出模块：用于根据所述风险值的总和，输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的预测结果：所述风险值的总和高的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的累积复发率高于所述风险值的总和低的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者；所述ldlrad4基因的相对表达量为所述ldlrad4基因的表达量与所述内参基因的表达量的比值；所述csrp2基因的相对表达量为所述csrp2基因的表达量与所述内参基因的表达量的比值。4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于：所述治疗为诱导缓解后仅继续接受巩固化疗。
5.根据权利要求3或4所述的装置，其特征在于：所述ldlrad4基因的相对表达量的获取通过包括如下步骤的方法实现：a1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和ldlrad4的扩增曲线；a1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；a1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；a1-4)通过式i获取所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述ldlrad4基因的相对表达量：ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
×
100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i；所述csrp2基因的相对表达量的获取通过包括如下步骤的方法实现：d1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和csrp2的扩增曲线；d1-2)通过所述abl1和csrp2的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及csrp2的ct值；d1-3)使用所述abl1的ct值及csrp2的ct值根据abl1的标准曲线获得所述csrp2的拷贝数和所述abl1的拷贝数；d1-4)通过式ⅱ获取所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述csrp2基因的相对表达量：csrp2的拷贝数/abl1的拷贝数
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100％＝所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式ⅱ。6.根据权利要求3-5中任一权利要求所述的装置，其特征在于：所述ldlrad4基因的表达量低为所述ldlrad4基因的表达量小于7.73％；所述csrp2基因的表达量高为所述csrp2基因的表达量大于等于0.93％。7.检测成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后ldlrad4基因的表达量的物质在制备预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后产品中的应用。8.成人b系急性淋巴细胞白血病患者治疗后ldlrad4基因的表达量作为生物标志物在制备预测成人b系急性淋巴细胞白血病患者预后产品中的应用。9.存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：c1)获取待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的独立危险因素结果，包括：待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的治疗方式、治疗后骨髓单个核细胞中ldlrad4基因的相对表达量和治疗后骨髓单个核细胞中csrp2基因的相对表达量；c2)将所述独立危险因素结果转换为所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的风险值：所述治疗方式为仅接受化疗的所述复发的风险值为1，治疗方式为非仅接受化疗患者的所述复发的风险值为0；所述ldlrad4基因的相对表达量低的所述复发的风险值为1，否则为0；所述csrp2基因的相对表达量高的所述复发的风险值为1，否则为0；c3)根据所述风险值的总和，输出待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者复发的预测结果：所述风险值的总和高的所述待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者的累积复发率高于
所述风险值的总和低的待测成人b系急性淋巴细胞白血病患者。10.根据权利要求9所述的计算机可读存储介质，其特征在于：所述ldlrad4基因的相对表达量的获取通过包括如下步骤的方法实现：a1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和ldlrad4的扩增曲线；a1-2)通过所述abl1和ldlrad4的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及ldlrad4的ct值；a1-3)使用所述abl1的ct值及ldlrad4的ct值根据abl1的标准曲线获得所述ldlrad4的拷贝数和所述abl1的拷贝数；a1-4)通过式i获取所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述ldlrad4基因的相对表达量：ldlrad4的拷贝数/abl1的拷贝数
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100％＝所述ldlrad4基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式i；所述csrp2基因的相对表达量的获取通过包括如下步骤的方法实现：d1-1)通过荧光定量pcr获得内参基因abl1和csrp2的扩增曲线；d1-2)通过所述abl1和csrp2的扩增曲线及设定的阈值得到abl1的ct值及csrp2的ct值；d1-3)使用所述abl1的ct值及csrp2的ct值根据abl1的标准曲线获得所述csrp2的拷贝数和所述abl1的拷贝数；d1-4)通过式ⅱ获取所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值为所述csrp2基因的相对表达量：csrp2的拷贝数/abl1的拷贝数
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100％＝所述csrp2基因的表达量与所述abl1基因的表达量的比值式ⅱ。

技术总结
本发明公开了LDLRAD4作为微小残留病标志物在预测成人B-ALL患者预后中的应用。本发明实施例中Cox多因素分析结果显示LDLRAD4低表达是成人B-ALL患者LFS的不良预后因素；多因素分析结果显示两轮巩固化疗后LDLRAD4低表达是成人B-ALL复发的独立危险因素，通过计算成人B-ALL患者治疗后骨髓单个核细胞中LDLRAD4基因与内参基因表达量的比值可获得成人B-ALL患者预后的风险值，根据所述风险值可预测成人B-ALL患者的无白血病生存时间和累积复发率。本发明可在补充和完善成人B-ALL微小残留病的监测系统和B-ALL的复发风险和预后评估中发挥重要作用。要作用。


技术研发人员：阮国瑞 黄晓军 曹雷茗 赵鸣悦 周亚兰
受保护的技术使用者：北京大学人民医院
技术研发日：2022.10.24
技术公布日：2023/1/6