一氧化氮的吸入的制作方法
专利名称：一氧化氮的吸入的制作方法
技术领域：
本发明属于药物领域，用来治疗哺乳动物特别是人类的肺部血管收缩或是呼吸道收缩。更加具体，本发明针对治疗那些对吸入一氧化氮后根本没有或有很微弱反应的个体，或者那些由于终止吸入一氧化氮而引起反弹反应的个体。
背景技术：
一氧化氮可以舒缓肺部血管，特别是当肺部血管由于各种疾病而收缩的时候，这些疾病将在下面的叙述中举例说明。一氧化氮也可以舒缓呼吸道平滑肌(Belvisi MG，Stretton CD，Barnes PJ.Eur.J.Pharmacol.1992，第210卷，第221-222页)。实验室动物实验和人体实验表明，吸入气态一氧化氮可以削弱由各种因素引发的呼吸道收缩(Dupuy PM，Shore SA，Drazen JM，Frostell C，Hill WA，Zapol WM.J.Clin.Invest.1992，第90卷，第421-428页；Hgman M，Frostell C，Arnberg H，Hedenstierna G.Eur.Respir.J.1993，第6卷，第177-180页；Hgman M，Frostell CG，Hedenstrom H，Hedenstierna Am.Rev.Respir.Dis1993，第148卷，第1474-1478页)。因而，例如在EP560928，US5485827，5873359，和WO92/10228中公开了一氧化氮来治疗支气管痉挛和肺部血管收缩的用途。尽管如此，我们发现这种治疗的方法表现出很大的个体间相互差异和个体内在的差异。此外，尽管一氧化氮吸入(INO)可以作为一种有效的手段来治疗患有肺动脉高压的患者，大约1/3的患者对于INO表现出低反应或者没有反应。除此之外，当撤消INO的时候，我们可以观察到肺动脉高压和氧合作用的双重恶化，这被定义为反弹效应(rebound response)。由于间断吸入一氧化氮而引起威胁生命的血管动力学的不稳定和死亡也曾经被报道过。逐步减少NO的使用剂量将延长NO的治疗时间但是仍旧不能消除反弹效应。
造成NO使用过程中的低反应性和反弹效应的机制还没有被完全阐明。有一种假说认为吸入的NO通过负反馈机制抑制体内NO的合成。在一项研究中开发使用了一种动物模型，该动物模型通过注射内毒素至少3小时对间断吸入NO产生反弹效应。这项研究奠定了本发明的基础。此外，实验结果表明反弹效应不仅是由于内源NO合成的负调控，而且可能更为重要的是因为血管收缩因子1(ET-1)的活性增强。另一项观测报告指出在对INO的反应和反弹程度之间存在负关联。因此，INO的效果越差则反弹的效应越强。Davidson及其合作者在新生儿呼吸困难的病例中发现INO的低反应、无反应和反弹之间的相似的关联。(D.Davidson，MD，Pediatries.1999，第104(2)卷，第231-236页)在我们的模型中，内毒素的注入导致了肺动脉血压的增加和PaO2的降低两个阶段。最初，在内毒素注入后15-30分钟后，肺动脉高压严重增强，并同时伴有血管收缩血栓烷A2(TXA2)或者其他环加氧酶(COX)产物浓度的增加。然后，在内毒素注入以后的2.5小时后出现了第二次稳定的肺动脉高压和组织缺氧，同时伴有ET-1的增加。
许多研究报道INO不能够逆转由于血栓烷类似物引发的肺部血管收缩。(Welte M等，Acta Physiol Scand.，1995，7月，第154(3)卷，第395-405页)。Ikeda S等(Ikeda S.，Shirai M.，Shimouchi A.，Min KY.，Ohsawa N.，Ninomiya I.，J.Physiology.，1999，2月，第49(1)卷，第89-98页)报道INO联合静脉给药的环前列腺素可以产生提高的血管舒张效应。
此外，可以抑制由白细胞三烯或者花生四烯酸引发的支气管紧张症状的具体取代的苯链烯酸和酯类可以分别从专利US4536515和US4537906中得知。
最后，Lippton H.L.等人在”Influence of cyclooxygenase blockadeon a response to isoproterenol，bradykinin and nitroglycerin in thefeline pulmonary vascular bed”(Prostaglandins，1984，第28(2)卷，第253-270页)一文中公开了环加氧酶的产物，如PGI2，不能介导由位于肺血管床的对异丙(去甲)肾上腺素，血管舒缓激肽和硝化甘油的血管舒张反应。
基于上述，非常令人惊奇的是，一种有效治疗肺部血管收缩或呼吸道收缩的联合治疗方法可以根据本发明而获得，该方法可以去除或至少广泛减弱上述提及的INO的负效应。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供适当的化合物，用来缓解对于使用气态NO或NO供体治疗低反应或无反应个体的呼吸道或者肺部血管。
本发明的另一个目的是提供适当的化合物，用来抵消由于单独使用NO造成的缓解减弱甚至威胁生命的效应，优选用于抵消或者消除由于间断吸入NO而产生的反弹效应。
发明的另一个目的是实现一种纯的可吸入药物的用途。
本发明的其他目的应该对于阅读过以下描述的本领域技术人员显而易见。
上述目的和本发明的其他目的，能够被阅读过以下描述的本领域技术人员所领会，在由所附权力要求所限定的使用、方法和药物制备中得到实现。
更具体地说，本发明首先提供了一种可吸入的NO和环加氧酶(COX)抑制剂联合的用途，用以制造治疗哺乳动物特别是人类的肺部血管收缩或是呼吸道收缩的药物，以抵消在仅使用气态NO和NO供体治疗时的低反应或无反应，和/或抵消在撤消使用气态NO和NO供体治疗时表现出的反弹效应。这种联合使用应在治疗的有效计量下才能达到上述抵消效果。
因而，根据本发明，我们非常惊奇地发现，降低的外源NO的缓解效果或甚至当间断吸入NO时所产生的威胁生命的效果，至少部分源于环加氧酶产物。
更具体地说，我们发现当联合使用环加氧酶抑制剂和NO时，可加强NO的缓解效果，或者延长NO的缓解效力，或者逆转单独使用NO时减少的效果，或者减小甚至消除由于间断使用NO吸入时所产生的反弹效应。
发明详述根据本发明，气体NO和COX抑制剂的联合可被用于制造治疗呼吸道和肺部血管中所有类型的收缩疾病(constriction challenge)的药物。
这些收缩疾病可能由于如下各种原因造成外伤性损害，肺部脂肪栓塞，酸中毒，成人呼吸窘迫综合症，急性高山病，心血管外和肺部术后急性的肺动脉高压，新生儿持续性肺动脉高压，围产期吸入综合症，透明膜病，急性肺部血栓栓塞，急性肺部水肿，肝素-鱼精蛋白反应，低氧和支气管哮喘(例如状况哮喘(Status asthmaticus))。
本发明中的一方面表现为生产可以治疗对只吸入气体NO完全不敏感或者低敏感的哺乳动物的药物。这方面有十分重要的临床治疗意义，因为在用NO吸入治疗不同患者群体时，通常很大一部分患者对NO吸入完全不敏感或者低敏感。
本发明中的另一方面表现为生产治疗间断NO吸入时所产生的反弹效应的药物。
本发明更优选的实现方案生产治疗支气管收缩症状的药物，例如支气管哮喘并发的支气管收缩症，特别是急性支气管哮喘或者状况哮喘。
根据本发明，NO优选以气态，可吸入的状态应用。例如，相较于应用非气态的NO供体，在治疗中吸入气态的NO具有很大优势，因为气态NO不含有需要分布并运输到呼吸系统的颗粒或液滴。气体有很长的自由扩散的途径，比颗粒和液滴更容易通过障碍物(例如抽缩的呼吸道)，并可以在不造成嵌入支气管痉挛而直接溶解于组织。吸入气体NO后很快就可以观察到NO气体对肺部血管和呼吸道平滑肌群等十分有利的效果，这样可以使得NO作为一种十分有用的第一屏障来抵御支气管痉挛和随后伴发的肺部血管收缩。如果需要，可以吸入作用时间更长的制剂。
然而，根据本发明的另一个实施方案，NO以NO供体的形式使用，例如，该供体可以为释放NO的化合物。已知的在本发明实际应用中能够释放NO的化合物有亚硝基或者亚硝酰基化合物，例如S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基-L-半胱氨酸和亚硝酰胍，他们的特性在于在如肺部能够获得的生理条件下由化合物释放或者转化成的NO部分。另一些化合物中NO作为过度金属复合物的一个配基，并能够在一定生理条件下由化合物释放NO或者转化成为NO，例如，硝普盐，NO-铁氧化还原蛋白，或者是NO-亚铁血红素复合物。更加适合的含氮化合物是那些由酶代谢而来的化合物，它们是呼吸系统或者血管系统内源的产物并可以生成NO自由基，例如，精氨酸，甘油三硝酸酯，异戊亚硝酸盐，无机亚硝酸盐，叠氮化物和羟胺。这些种类的NO释放化合物和合成它们的方法在本领域众所周知。优选NO供体是一种可以释放NO而使得只有呼吸道和肺部血管受影响的化合物。
本发明所用的NO供体可以以粉末(例如，细微分割的固体，可以纯净状态提供或同生物相容性的载体粉末，或同一或多种附加治疗性的化合物混合)或以液体(例如，溶解或悬浮于生物可相容性的液体载体中，可选混合有一或多种附加治疗性的化合物)使用，并且可以方便的以喷雾的形式被患者吸入(优选包括直径低于10um的颗粒或者液滴)。适合吸入的粉末或者液体载体在传统的哮喘吸入疗法中普遍使用，所以广为本领域知晓。技术人员可依据常规的程序得知适当的吸入最佳剂量范围。
本实验所使用的环加氧酶抑制剂可以是任何被认为适用于哺乳动物特别是人体的化合物，其可以方便地给药。进行的与本发明相关的实验使用非选择性的COX-抑制剂。阻断COX-2酶表现出增加并且延长INO的效力。阻断COX-1和COX-2酶均可以钝化反弹效应。使用非选择性的COX抑制剂因此应该是有效的，但是使用更具选择性的COX抑制剂则可以提供更加有利的效力。
一些可以符合本发明的COX抑制剂的例子如下双氯酚酸钠(diclofenac)；醛氯芬酸；萘丁美酮；meloxicam；甲氯芬那；nimesulide；扑热息痛；rofecoxib；celecoxib；DuP 697(5-溴-2-(4-氟苯基)-3-[4-(甲磺酰)-苯基]噻吩)；GR 32191(((IR-α(Z)，2β，3β，5α))-(+)-7-5(((1.1’-二苯基)-4-基)-甲氧基)-3-羟基-2-(1-哌啶)-环戊基)-4-庚烯酸)；flosulide(或cGP 28238)；NS 398(N-(2-环己基氧-4-硝基苯基)-甲磺酰胺(methansulfonamide)；L-745，337(N-[6-[(2，4-二氟苯基)硫]-2，3-二氢-1-氧-1H-茚-5-基]甲磺酰胺)；DFU((5，5-二甲基-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲磺酰氯)苯基-2(5H)-呋喃酮)；HN-56249((3-2，4-二氯噻吩)-4-甲磺酰氨-苯磺酰胺)；JTE-522((4-(4-环己基-2-甲基唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺)；阿斯匹林；吲哚美辛；和布洛芬。
在这些特殊的化合物中，阿斯匹林、吲哚美辛和布洛芬相对于COX-1抑制表现出更高的选择性，而其他的化合物(至少大部分)相对于COX-1和COX-2抑制表现出更高的选择性或者与相对于COX-2抑制表现出相似程度的选择性。其酸加成盐例如盐酸盐也可用。
根据本发明所用的试剂可以用商品呼吸装置进行给药。压缩的NO气体可从商家获得，典型的是200-2000ppm NO在纯N2气体中的混合气体。上述的NO-N2混合气体可以1-100000nmol/min的量输入吸入气体中，也可以与空气、氧气或者其他适宜的载体气体或者混合气体相混合，所述混合气体浓度一般是1-180ppm。为在延长期吸入，通常使用的气体压力范围为1-40ppm，但在短时期内可使用1-80ppm或者1-180ppm的气体，这时可以获得短暂的强效应。在最后提及的情况中特别优选的压力范围分别是20-80ppm(例如40-80ppm)或40-180ppm。关于NO吸入的更多细节请参见现有技术，例如EP560928 B1，其所公开的技术在此列为本发明的参考。
NO和环加氧酶抑制剂可以任何顺序给药，或者它们能被同时给药，在后一种情况中，或者有各自来源的二者在同一时间或一起给药，或者以由上述NO和环加氧酶抑制剂构成的混合物的形式给药。
环加氧酶抑制剂既可以采用与NO相同的方式进行给药，例如通过吸入过程，也可以通过药学常用给药途径来给药。在这些途径中，可以参照舌下、经口腔和直肠的给药，表皮施用，和皮下、肌内、静脉内或者腹膜内注射过程。然而，优选通过吸入过程对环加氧酶抑制物进行给药。因此，环加氧酶抑制物可以粉末(例如，细微分割的固体，纯态，或与具有生物相容性的载体粉末相混合，或与一或多种附加的治疗性化合物相混合)或可以液体(例如，溶解于或悬浮于具有生物相容性的液体载体中，可择与一或多种附加治疗性化合物相混合)来进行给药，但是以喷雾形式可以更为方便地被患者吸入(优选包括直径低于10μm的颗粒或者液滴)。适宜作吸入载体的液体载体和粉末普遍用于传统的哮喘吸入疗法，因而在本领域中众所周知。
按照治疗有效剂量使用环加氧酶抑制剂，本领域技术人员可轻易确立这种有效剂量，其取决于所用化合物的类型和给药的途径以及其他一些因素。正如对于本领域的技术人员应该显而易见的是，在本方面和通用于说明书和权力要求中，术语“治疗性”包括预防性治疗和对确定病症的治疗。此外，“治疗有效”用其在本领域内的通用意义，就如同上述提及的专利申请EP 560 928 B1所定义的，通常在这个具体情况中，当环加氧酶抑制剂逆转了由单独使用气态NO所引发的负面效果时，它就是治疗有效的。作为本方面的指导，可附加说明的是，当化合物双氯酚酸钠以总剂量50-150mg/天，以口服药片、栓剂、肌内注射或静脉注射等方式施用于成年人时，其一般是有效的。这相当于约0.1-5mg/kg体重的剂量，例如0.15-3mg/kg体重当以气雾剂形式使用时。然而，有时候较低剂量就可以起到效果，而有时候则需要较高的剂量。对于其它的化合物，这可以用来作为建立合适剂量的基础。
根据本发明的第二方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物特别是人类肺部血管收缩或者呼吸道收缩的方法，它的目的在于抵消在使用气态NO和NO供体治疗时患者的低反应或无反应，和/或抵消在仅使用气态NO和NO供体时撤消治疗患者表现出的反弹效应。上述方法包括对需要这种治疗的哺乳动物进行吸入过程给药，使用以气态NO或者NO供体为形式的NO，并且联合使用环加氧酶抑制剂。上述联合应该使用治疗有效剂量以达到上述的抵消效果。
上述方法的具体的和优选的实施方案可参考那些与本发明的用途相关的、已被描述了的具体的和优选的实施方案。
最后，根据本发明的第三方面，提供治疗哺乳动物特别是人类肺部血管收缩或者呼吸道收缩的药物制剂，它的目的在于抵消仅使用气态NO和NO供体治疗时患者的低反应或无反应，和/或抵消在撤消仅使用气态NO和NO供体的治疗时患者表现出的反弹效应。本发明使用以气态NO或者NO供体为形式的NO，并联合使用环加氧酶抑制剂。上述气态NO和上述环加氧酶抑制剂应在上述治疗的治疗有效剂量才能达到上述抵消效果。
上述制剂的具体的和优选的实施方案也可参考上述那些根据本发明用途的具体的和优选的实施方案。
本发明将由下述非限制性的实施例说明。
实施例施行实验以研究环加氧酶抑制剂-双氯酚酸钠-与NO吸入的关系，更为具体地研究其在终止上述吸入所引起的反弹效应中的效果。
材料和方法动物准备Uppsala大学的动物研究道德委员会批准了本研究。重24-29Kg的26头瑞典猪被用于研究。在从农场的运输前，用神经镇静药，azaperonum(STRESNIL，Janssen，比利时)，40mg肌内注射给猪。用阿托品(0.04mg/Kg)，噻环乙胺(tiletamin)/唑氟氮(ZOLETIL，Virbac实验室)(6mg/Kg)和xylzry(ROMPUN，B ayer AG，德国)(2.2mg/Kg)诱导麻醉。在诱导后，将一根套管插入耳部静脉并注射入阿片样物质(5μg/Kg)(FENTANYL，抗原医药有限公司，Roscrea，爱尔兰)。用帕乌龙(PAVULON，Organon Technika AB，Gteborg，瑞典)(0.2μg/Kg)松弛肌肉。持续注入安眠药(chlomethiazole，HEMINEVRIN，Astra，Sdertlje，瑞典)(400mg/hour)、帕乌龙(2mg/hour)和芬太尼(150μg/hour)以维持麻醉状态。如需要，重复静脉注射0.2-0.5mg芬太尼。当皮切口不会引起心跳和血压的任何变化时，麻醉的程度就足够了。加入预热(38℃)的等渗盐500ml/hour以供水合作用。在余下的研究中，将动物安置于仰卧状态(背侧横卧)。
麻醉后施行气管切开术，插入一个带套囊的气管导管(cuffedtracheal tube)(内径为6mm)。用一个容量给药的换气机(西门子900c)提供机械换气。用换气机内的变换器记录呼吸道的压力和准确的换气。将呼吸频率维持在每分钟20次，调整潮汐的容积(tidal volume)使潮落时的CO2(PetCO2)压力维持在36-41mmHg(4.8-5.4kpa)。吸气时间是25％；在吸气末尾施加一个持续时间为整个呼吸循环5％的停顿，同时施加5-cm H2O的呼吸压(PEEP)。吸入的氧气(FIO2)比例为0.5。
导管插入和血液测量将一个带橡皮头的三联腔导管(Swan Ganz no.7F)经右侧外部颈静脉插入肺动脉中以采取血样和记录压力，将一个大口径的导管插入对测颈部静脉用以注入之用，并将它的头部放入上部的腔静脉。将导管插入右侧颈动脉用以采取血样和记录动脉压力。
将动脉、中央静脉及肺动脉的导管被连接到适应的压力变换器(Sorenson Transpac变换器，Abbott紧急治疗系统，伊利诺伊州，美国)，用Marquette 7010监视器(Marquette电子公司，威斯康星州，美国)纪录压力。纪录动脉压力的平均值(MAP)、肺动脉压力的平均值(MPAP)、心率(HR)，中央静脉压力(CVP)，肺部毛细血管楔压(PCWP)及心输出量(Qt)。用换气机纪录呼吸道的压力。血管压力取自整个呼吸循环中的平均值，以中央胸廓为零参考值。
用热稀释法来测量Qt将10ml冰预冷的等渗盐以大剂量注射入，并计算出Qt(心输出量计算机Marquette 7010，Marquette电子公司，威斯康星州，美国)。在每次测量中至少注射三次，然后计算出平均值。注射均匀分布于整个呼吸循环中。在每次测量中记录呼气的准确体积。收集混合的静脉和动脉血样以作血液气体分析(ABL 3，辐射计，哥本哈根，丹麦)，同时收集氧饱合和血红蛋白浓度(OSM 3，辐射计，哥本哈根，丹麦)和5ml动脉血，分离血浆以作生化分析之用(见下)。
肺部损害静脉注入25μg/Kg/小时的内毒素连续三小时，诱导急性肺部损害，然后在剩余实验阶段用10μg/Kg/小时的内毒素维持肺部损害。
实验步骤手术后30分钟，对血液动力学进行基线测量，采取血样，并收集血液用以后续生化分析。静脉注入25μg/Kg/小时的内毒素(LPS，大肠杆菌0111B4，Sigma化学药品，圣路易斯，密苏里州，美国)连续三小时，诱导急性肺部损害。在开始注入内毒素后30，60，120，150分钟测量反应。然后将猪分为3组“环加氧酶(COX)阻滞组”，“非阻滞组”，和“对照组”，以分析环加氧酶抑制剂可能的INO-推进效果。
1.在环加氧酶阻滞组，在开始吸入30ppm的INO之前，持续注入内毒素3小时。在开始吸入INO之前，静脉注射入非选择性的环加氧酶抑制剂-双氯酚酸钠(Sigma D6899)的盐溶液(300/kg)。30分钟后，当终止吸入NO前，测量血液动力学和气体交换，并采取血样以用作生化分析。当撤除NO后5，10，15，30分钟，进行测量以检测是否有反弹反应。然后再进行30分钟的NO吸入(也就是在开始注入内毒素后4小时)，并再次终止NO，在如前述相同的时间点测量结果。目的是检测对INO的反应是否保持不变或是发生变化，检测是否有任何反弹效应变强或是在第一次以后发生。
2.在非阻滞组，不加入环加氧酶抑制剂。除此而外，其他步骤与环加氧酶阻滞组相同。在本研究中，经胸骨切开术在4个时机(在NO吸入之前，期间以及以后)取5头猪的肺组织样品。
3.在对照组，同样注入内毒素，但是不加INO或环加氧酶抑制剂。对对照组猪进行基线水平研究，并在与2次INO作用的开始和结束一致的时间点，及在实验结束时，开始注入内毒素后5小时，对对照猪进行研究。
在注入内毒素开始后的研究周期为300分钟(5小时)，总的研究时间，包括麻醉，准备和内毒素注入前的基线测量，大约为7小时。
NO给药和呼吸气中的NO记录N2中1000ppm NO，再与混合气O2/N2相混合，然后连接至换气机的低流入口。吸入的气体通过含碱石灰的滤罐以吸收所有的NO2。在换气管的吸入分支处，用化学发光法(9841 NOx，Lear SieglerMeasurement Controls Corporation，Englewood哥伦比亚，美国)测量吸入的NO和NO2的浓度。将吸入的NO的压力设定在30ppm，将吸入的NO2的压力设定在低于0.5ppm。
通过Western印迹验证COX-1和COX-2的表达用4℃的PBS润洗肺组织块。在5倍体积的冰预冷的0.05M Tris缓冲液(pH7.4)中，其含0.5mM的苯基甲基磺酰基氟化物以抑制蛋白质水解，用匀浆法(Ultra-Turrax，Jenke and Kunkel，IKALabortechnik，Staufen，德国)进行肺组织的总蛋白提取。收集上清液并将其贮藏于-80℃直至分析所用。用Lowry法确定上清液中总蛋白的浓度。用十二烷基硫酸纳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，然后将分离后的蛋白电转移至硝化纤维膜。在4℃的5％BSA的TBS溶液中封闭印迹过夜，然后和含有1％BSA的抗-COX-1(1∶2500，CaymanChemical，MI，USA，Ca 160108)，COX-2(1∶1500，Cayman Chemical，MI，USA，Ca 160108)的TBS溶液中孵育过夜。用TBS溶液洗涤五次。将印迹与偶联羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)的辣根过氧化物酶(1∶2500稀释，Vector实验室，Burlingame，USA)进行孵育。用TBS溶液洗印迹五次，用增强化学发光的试剂(Ameraham，Arlington Heights，IL，USA)，在感光胶片上检测抗原抗体复合物。所有实验重复三次，用(美国)全国卫生研究所(NIH)的程序Image 1.6C对每次实验的结果进行分析。
TXB2血浆将血液收集在预冷的装有EDTA(10mM，终浓度)的试管中，离心(10min，40C)。用市售的酶联免疫测定试剂盒(Thromboxane B2 EIAkit Cayman Chemical，MI，USA，Ca 519031)测定TXB2的浓度。从每只试管中收集血清，贮藏于-70℃直至进行TXB2浓度测定。为确保所有的样品不含有机溶剂，在将血清加入测试孔前对其进行纯化。根据Cayman Chemical Introduction对TXB2进行纯化，首先向每一份样品中加入10,000cpm的氚标记的TXB2(3H-TXB2)，然后加入2ml乙醇，在4℃振荡处理5分钟，然后在1500g离心10分钟，以去除沉淀的蛋白。收集上清液并将其与超纯水混合。将样品通C-18的反相柱。取流出液的10％作闪烁计数。
重复两次酶联免疫测定，在微量板上将50μl纯化后的样品与50μl示踪化合物和50μl抗血清相混合。温育18小时后，加入200μl Ellmans试剂开始酶反应，30分钟后用微量板光度测定器(Thermo Max，Molecular Devices)测量每个小瓶在405nm的吸收值。对8个已知浓度范围在7.5至1000pg/ml的TXB2的吸收值进行非线性回归而得到标准曲线，而后从中估计样品中TXB2的浓度。测试间和测试内的差异系数小于10％。更多的细节请参见TXB2 Enzyme immunoassayKit 519031 Cayman化学手册。
统计分析在所有研究条件下计算所有变量的平均值和平均值的标准偏差。用变量分析(ANOVA)对于重复测量进行比较；对多重比较进行校正。P＜0.05水平的差异被认为显著。
结果内毒素诱导的肺部损害基线水平血液动力学和动脉氧化相同于先前实验中健康猪的测量结果(Freden F等，Br J Anaesth，1996第77(3)卷，第413-418页)。在这三个组之间不存在差异。
内毒素注入在所有组中在注入150分钟后引起MPAP增加两倍。PaO2被显著降低，至基线水平的一半。此外，心率增高而心输出量降低。在UN-COX组，在开始注入内毒素后3小时和4小时，测量结果没有显著不同。在对照组，在开始注入内毒素后3小时和4小时和5小时，测量结果没有显著不同。
No的吸入和终止在非阻滞实验组，在开始注入内毒素后3小时，吸入30ppm的NO导致MPAP水平降低28％和PaO2水平增加54％。30分钟后，当终止吸入NO时，MPAP水平快速增高(在5分钟内)，至高于NO吸入前水平的23％(9mmHg)，从而产生了反弹效应。PaO2水平快速降低至NO吸入前水平，但并没有表现出反弹现象。
注射内毒素4小时后，当重复吸入NO时，MPAP水平的下降和PaO2水平的增加很微弱，较之一小时前的实验，PaO2的水平变化不再显著。当终止吸入NO五分钟后，MPAP的水平再一次显著的增加并高于NO前的水平(+26％)，PaO2的水平下降到低于NO前的水平。因此，可以观察到明显的反弹的血氧不足。
在NO吸入中PaO2水平的增加和对终止NO吸入的反弹效应的程度之间存在着反比关系。因此，对吸入NO的反应越弱，当终止吸入NO时PaO2下降的水平越大。对MPAP未观察到此类关系。
在COX-阻滞组中，预先用双氟酚酸钠处理降低了MPAP的水平。INO显著的降低了MPAP的水平并增加了PaO2的水平。然而，当INO终止时，MPAP和PaO2均未显示出反弹效应。MPAP减少的程度并没有因联合使用INO和双氯酚酸钠而增加。尽管如此，比之非阻滞组，阻滞组延长了吸入NO的作用时间。此外，与在非阻滞组中对NO的反应削弱相反，第二次NO吸入实验和一小时前的第一次实验一样，INO使得MPAP和PaO2增加相同的水平。当INO终止时，没有再次记录到反弹效应。在内毒素输入期间，呼吸阻力(resistance)增加了。单独使用INO不会预防或者削弱这种增长趋势。然而，在COX阻滞组中，阻力的增加显著减低(P＜0.01)，并且在整个INO期间，阻力并没有增加。
在对照组中，在两个小时中，MPAP和PaO2的水平始终保持稳定，与实验组中INO的作用相应。因此，INO组和对照组之间的比较更清楚的揭示了2次受INO作用下对MPAP和PaO2的改进，INO终止的反弹效应和COX抑制剂的功效。
NO的吸入和终止并不影响COX-1的表达，不论是INO实验3小时还是5小时。在无阻滞组中，COX-2的表达在内毒素注射后3小时显著增加，在5小时增加到了几乎通常基线水平(p＜0.01)的10倍。不论在3小时还是5小时吸入实验，30分钟的INO并不影响表达的状况。同样的，COX-2的表达在INO时期后保持增加。
血浆TXE-2因子的浓度在3个实验组的基线水平并没有显著差异。血浆TEX-2的水平在内毒素开始注射后半个小时剧烈增加(6000-8000pg/ml)，而在注射后3小时降低到基线的2倍，且这种变化在3个实验组的中没有差别。在非阻滞组中，血浆TXE-2的水平在NO吸入过程中并不变化，但在减少NO后5分钟时增加并且在INO后15分钟达到峰值(p＜0.05)。当30分钟后第二次INO实验开始后，血浆TXE-2的水平继续保持升高(20000-40000pg/ml)，并且当第二次INO终止时再次进一步增加。在COX阻滞组中，血浆TXE-2的水平在第一次INO作用和终止时并不增加。当第二次INO实验时血浆TXE-2的水平下降并且当INO终止时NO时并不增加。
权利要求
1.可吸入的一氧化氮(NO)的用途，其为气态NO或者NO供体形式，与环加氧酶抑制剂联合用于生产治疗哺乳动物特别是人的肺部血管收缩和呼吸道收缩的药物，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应和/或抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，上述的联合使用在治疗有效量实现上述的抵消作用。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的肺部血管收缩和呼吸道收缩与临床症状相关，这些症状选自外伤性损伤，肺部脂肪栓塞，酸中毒，成人呼吸窘迫综合症，急性高山病，心血管和肺部术后急性肺动脉高压，新生儿持续肺动脉高压，围产期吸入综合症，透明膜病，急性肺部血栓栓塞，急性肺部水肿，肝素鱼精蛋白反应，缺氧和支气管哮喘。
3.根据权利要求2的用途，其中所述的呼吸道收缩与支气管哮喘相关。
4.根据权利要求3的用途，其中所述的呼吸道收缩与急性支气管哮喘和状况哮喘相关。
5.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的药物是可吸入药物。
6.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的生产涉及适于按照任何顺序施用所述的NO和所述的COX抑制剂的药物。
7.根据权利要求1-5任一项的用途，其中所述的药物形式为含上述的NO和环加氧酶抑制剂的组合物，实现其同时给药。
8.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的环加氧酶抑制剂选自双氯酚酸钠；醋氯芬酸；萘丁美酮；meloxicam；甲氯芬那；nimesulide；扑热息痛；rofecoxib；celecoixb；DuP 697；GR 32191；flosulide；NS 398；L-745,337；DFU；HN-56249；JTE-552；阿司匹林；吲哚美辛；和布洛芬；或其酸加成盐.
9.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的NO以1-100nmol/min的量存在于所述药物中。
10.根据前述任一项权利要求的用途，其中所吸入的NO的浓度应在1-180ppm范围内，优选1-80ppm，特别是1-40ppm。所述的NO存在于载体气体中或气体混合物中。
11.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的NO供体选自S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基半胱氨酸，硝普盐，亚硝基胍，甘油三硝酸酯，异戊亚硝酸盐，无机亚硝酸盐，叠氮化物和羟胺
12.治疗哺乳动物特别是人的肺部的血管收缩和呼吸道收缩的方法，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应或者抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，其包括对需要此种治疗的动物以吸入方式施用一氧化氮，其形式为气态可吸入的NO或者NO供体与环加氧酶抑制剂，该联合使用在治疗有效量实现上述的抵消作用。
13.根据权利要求12的方法，如在权利要求2-11中所定义。
14.用于治疗哺乳动物特别是人的肺部血管收缩和呼吸道收缩的的药物制剂，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应或者抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，该药物制剂包括一氧化氮(NO)，形式为气态NO或者NO供体，联合环加氧酶抑制剂，该一氧化氮和该环加氧酶抑制剂以治疗有效量存在来实现上述的抵消作用。
15.根据权利要求14的药物制剂，用于如在权利要求2-11中定义的用途。
全文摘要
本发明涉及可吸入的气态一氧化氮联合环加氧酶抑制剂用于生产治疗哺乳动物、包括人类的肺部血管收缩或呼吸道收缩的药物中的用途，其目的在于抵消单独使用气态NO或NO供体治疗时患者的低反应或不反应和/或抵消在撤消单独使用气态NO或NO供体的治疗时所产生的反弹效应，所述联合以治疗有效量来实现舒缓所述肺部血管收缩或呼吸道收缩，也涉及使用上述联合治疗肺部血管收缩或呼吸道收缩的方法或药物制剂。
文档编号A61K33/00GK1481256SQ0182089
公开日2004年3月10日 申请日期2001年11月15日 优先权日2000年11月17日
发明者G·赫丹斯逖尔纳, 陈鲁妮, G 赫丹斯逖尔纳 申请人:Aga公司
技术领域：
本发明属于药物领域，用来治疗哺乳动物特别是人类的肺部血管收缩或是呼吸道收缩。更加具体，本发明针对治疗那些对吸入一氧化氮后根本没有或有很微弱反应的个体，或者那些由于终止吸入一氧化氮而引起反弹反应的个体。
背景技术：
一氧化氮可以舒缓肺部血管，特别是当肺部血管由于各种疾病而收缩的时候，这些疾病将在下面的叙述中举例说明。一氧化氮也可以舒缓呼吸道平滑肌(Belvisi MG，Stretton CD，Barnes PJ.Eur.J.Pharmacol.1992，第210卷，第221-222页)。实验室动物实验和人体实验表明，吸入气态一氧化氮可以削弱由各种因素引发的呼吸道收缩(Dupuy PM，Shore SA，Drazen JM，Frostell C，Hill WA，Zapol WM.J.Clin.Invest.1992，第90卷，第421-428页；Hgman M，Frostell C，Arnberg H，Hedenstierna G.Eur.Respir.J.1993，第6卷，第177-180页；Hgman M，Frostell CG，Hedenstrom H，Hedenstierna Am.Rev.Respir.Dis1993，第148卷，第1474-1478页)。因而，例如在EP560928，US5485827，5873359，和WO92/10228中公开了一氧化氮来治疗支气管痉挛和肺部血管收缩的用途。尽管如此，我们发现这种治疗的方法表现出很大的个体间相互差异和个体内在的差异。此外，尽管一氧化氮吸入(INO)可以作为一种有效的手段来治疗患有肺动脉高压的患者，大约1/3的患者对于INO表现出低反应或者没有反应。除此之外，当撤消INO的时候，我们可以观察到肺动脉高压和氧合作用的双重恶化，这被定义为反弹效应(rebound response)。由于间断吸入一氧化氮而引起威胁生命的血管动力学的不稳定和死亡也曾经被报道过。逐步减少NO的使用剂量将延长NO的治疗时间但是仍旧不能消除反弹效应。
造成NO使用过程中的低反应性和反弹效应的机制还没有被完全阐明。有一种假说认为吸入的NO通过负反馈机制抑制体内NO的合成。在一项研究中开发使用了一种动物模型，该动物模型通过注射内毒素至少3小时对间断吸入NO产生反弹效应。这项研究奠定了本发明的基础。此外，实验结果表明反弹效应不仅是由于内源NO合成的负调控，而且可能更为重要的是因为血管收缩因子1(ET-1)的活性增强。另一项观测报告指出在对INO的反应和反弹程度之间存在负关联。因此，INO的效果越差则反弹的效应越强。Davidson及其合作者在新生儿呼吸困难的病例中发现INO的低反应、无反应和反弹之间的相似的关联。(D.Davidson，MD，Pediatries.1999，第104(2)卷，第231-236页)在我们的模型中，内毒素的注入导致了肺动脉血压的增加和PaO2的降低两个阶段。最初，在内毒素注入后15-30分钟后，肺动脉高压严重增强，并同时伴有血管收缩血栓烷A2(TXA2)或者其他环加氧酶(COX)产物浓度的增加。然后，在内毒素注入以后的2.5小时后出现了第二次稳定的肺动脉高压和组织缺氧，同时伴有ET-1的增加。
许多研究报道INO不能够逆转由于血栓烷类似物引发的肺部血管收缩。(Welte M等，Acta Physiol Scand.，1995，7月，第154(3)卷，第395-405页)。Ikeda S等(Ikeda S.，Shirai M.，Shimouchi A.，Min KY.，Ohsawa N.，Ninomiya I.，J.Physiology.，1999，2月，第49(1)卷，第89-98页)报道INO联合静脉给药的环前列腺素可以产生提高的血管舒张效应。
此外，可以抑制由白细胞三烯或者花生四烯酸引发的支气管紧张症状的具体取代的苯链烯酸和酯类可以分别从专利US4536515和US4537906中得知。
最后，Lippton H.L.等人在”Influence of cyclooxygenase blockadeon a response to isoproterenol，bradykinin and nitroglycerin in thefeline pulmonary vascular bed”(Prostaglandins，1984，第28(2)卷，第253-270页)一文中公开了环加氧酶的产物，如PGI2，不能介导由位于肺血管床的对异丙(去甲)肾上腺素，血管舒缓激肽和硝化甘油的血管舒张反应。
基于上述，非常令人惊奇的是，一种有效治疗肺部血管收缩或呼吸道收缩的联合治疗方法可以根据本发明而获得，该方法可以去除或至少广泛减弱上述提及的INO的负效应。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供适当的化合物，用来缓解对于使用气态NO或NO供体治疗低反应或无反应个体的呼吸道或者肺部血管。
本发明的另一个目的是提供适当的化合物，用来抵消由于单独使用NO造成的缓解减弱甚至威胁生命的效应，优选用于抵消或者消除由于间断吸入NO而产生的反弹效应。
发明的另一个目的是实现一种纯的可吸入药物的用途。
本发明的其他目的应该对于阅读过以下描述的本领域技术人员显而易见。
上述目的和本发明的其他目的，能够被阅读过以下描述的本领域技术人员所领会，在由所附权力要求所限定的使用、方法和药物制备中得到实现。
更具体地说，本发明首先提供了一种可吸入的NO和环加氧酶(COX)抑制剂联合的用途，用以制造治疗哺乳动物特别是人类的肺部血管收缩或是呼吸道收缩的药物，以抵消在仅使用气态NO和NO供体治疗时的低反应或无反应，和/或抵消在撤消使用气态NO和NO供体治疗时表现出的反弹效应。这种联合使用应在治疗的有效计量下才能达到上述抵消效果。
因而，根据本发明，我们非常惊奇地发现，降低的外源NO的缓解效果或甚至当间断吸入NO时所产生的威胁生命的效果，至少部分源于环加氧酶产物。
更具体地说，我们发现当联合使用环加氧酶抑制剂和NO时，可加强NO的缓解效果，或者延长NO的缓解效力，或者逆转单独使用NO时减少的效果，或者减小甚至消除由于间断使用NO吸入时所产生的反弹效应。
发明详述根据本发明，气体NO和COX抑制剂的联合可被用于制造治疗呼吸道和肺部血管中所有类型的收缩疾病(constriction challenge)的药物。
这些收缩疾病可能由于如下各种原因造成外伤性损害，肺部脂肪栓塞，酸中毒，成人呼吸窘迫综合症，急性高山病，心血管外和肺部术后急性的肺动脉高压，新生儿持续性肺动脉高压，围产期吸入综合症，透明膜病，急性肺部血栓栓塞，急性肺部水肿，肝素-鱼精蛋白反应，低氧和支气管哮喘(例如状况哮喘(Status asthmaticus))。
本发明中的一方面表现为生产可以治疗对只吸入气体NO完全不敏感或者低敏感的哺乳动物的药物。这方面有十分重要的临床治疗意义，因为在用NO吸入治疗不同患者群体时，通常很大一部分患者对NO吸入完全不敏感或者低敏感。
本发明中的另一方面表现为生产治疗间断NO吸入时所产生的反弹效应的药物。
本发明更优选的实现方案生产治疗支气管收缩症状的药物，例如支气管哮喘并发的支气管收缩症，特别是急性支气管哮喘或者状况哮喘。
根据本发明，NO优选以气态，可吸入的状态应用。例如，相较于应用非气态的NO供体，在治疗中吸入气态的NO具有很大优势，因为气态NO不含有需要分布并运输到呼吸系统的颗粒或液滴。气体有很长的自由扩散的途径，比颗粒和液滴更容易通过障碍物(例如抽缩的呼吸道)，并可以在不造成嵌入支气管痉挛而直接溶解于组织。吸入气体NO后很快就可以观察到NO气体对肺部血管和呼吸道平滑肌群等十分有利的效果，这样可以使得NO作为一种十分有用的第一屏障来抵御支气管痉挛和随后伴发的肺部血管收缩。如果需要，可以吸入作用时间更长的制剂。
然而，根据本发明的另一个实施方案，NO以NO供体的形式使用，例如，该供体可以为释放NO的化合物。已知的在本发明实际应用中能够释放NO的化合物有亚硝基或者亚硝酰基化合物，例如S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基-L-半胱氨酸和亚硝酰胍，他们的特性在于在如肺部能够获得的生理条件下由化合物释放或者转化成的NO部分。另一些化合物中NO作为过度金属复合物的一个配基，并能够在一定生理条件下由化合物释放NO或者转化成为NO，例如，硝普盐，NO-铁氧化还原蛋白，或者是NO-亚铁血红素复合物。更加适合的含氮化合物是那些由酶代谢而来的化合物，它们是呼吸系统或者血管系统内源的产物并可以生成NO自由基，例如，精氨酸，甘油三硝酸酯，异戊亚硝酸盐，无机亚硝酸盐，叠氮化物和羟胺。这些种类的NO释放化合物和合成它们的方法在本领域众所周知。优选NO供体是一种可以释放NO而使得只有呼吸道和肺部血管受影响的化合物。
本发明所用的NO供体可以以粉末(例如，细微分割的固体，可以纯净状态提供或同生物相容性的载体粉末，或同一或多种附加治疗性的化合物混合)或以液体(例如，溶解或悬浮于生物可相容性的液体载体中，可选混合有一或多种附加治疗性的化合物)使用，并且可以方便的以喷雾的形式被患者吸入(优选包括直径低于10um的颗粒或者液滴)。适合吸入的粉末或者液体载体在传统的哮喘吸入疗法中普遍使用，所以广为本领域知晓。技术人员可依据常规的程序得知适当的吸入最佳剂量范围。
本实验所使用的环加氧酶抑制剂可以是任何被认为适用于哺乳动物特别是人体的化合物，其可以方便地给药。进行的与本发明相关的实验使用非选择性的COX-抑制剂。阻断COX-2酶表现出增加并且延长INO的效力。阻断COX-1和COX-2酶均可以钝化反弹效应。使用非选择性的COX抑制剂因此应该是有效的，但是使用更具选择性的COX抑制剂则可以提供更加有利的效力。
一些可以符合本发明的COX抑制剂的例子如下双氯酚酸钠(diclofenac)；醛氯芬酸；萘丁美酮；meloxicam；甲氯芬那；nimesulide；扑热息痛；rofecoxib；celecoxib；DuP 697(5-溴-2-(4-氟苯基)-3-[4-(甲磺酰)-苯基]噻吩)；GR 32191(((IR-α(Z)，2β，3β，5α))-(+)-7-5(((1.1’-二苯基)-4-基)-甲氧基)-3-羟基-2-(1-哌啶)-环戊基)-4-庚烯酸)；flosulide(或cGP 28238)；NS 398(N-(2-环己基氧-4-硝基苯基)-甲磺酰胺(methansulfonamide)；L-745，337(N-[6-[(2，4-二氟苯基)硫]-2，3-二氢-1-氧-1H-茚-5-基]甲磺酰胺)；DFU((5，5-二甲基-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲磺酰氯)苯基-2(5H)-呋喃酮)；HN-56249((3-2，4-二氯噻吩)-4-甲磺酰氨-苯磺酰胺)；JTE-522((4-(4-环己基-2-甲基唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺)；阿斯匹林；吲哚美辛；和布洛芬。
在这些特殊的化合物中，阿斯匹林、吲哚美辛和布洛芬相对于COX-1抑制表现出更高的选择性，而其他的化合物(至少大部分)相对于COX-1和COX-2抑制表现出更高的选择性或者与相对于COX-2抑制表现出相似程度的选择性。其酸加成盐例如盐酸盐也可用。
根据本发明所用的试剂可以用商品呼吸装置进行给药。压缩的NO气体可从商家获得，典型的是200-2000ppm NO在纯N2气体中的混合气体。上述的NO-N2混合气体可以1-100000nmol/min的量输入吸入气体中，也可以与空气、氧气或者其他适宜的载体气体或者混合气体相混合，所述混合气体浓度一般是1-180ppm。为在延长期吸入，通常使用的气体压力范围为1-40ppm，但在短时期内可使用1-80ppm或者1-180ppm的气体，这时可以获得短暂的强效应。在最后提及的情况中特别优选的压力范围分别是20-80ppm(例如40-80ppm)或40-180ppm。关于NO吸入的更多细节请参见现有技术，例如EP560928 B1，其所公开的技术在此列为本发明的参考。
NO和环加氧酶抑制剂可以任何顺序给药，或者它们能被同时给药，在后一种情况中，或者有各自来源的二者在同一时间或一起给药，或者以由上述NO和环加氧酶抑制剂构成的混合物的形式给药。
环加氧酶抑制剂既可以采用与NO相同的方式进行给药，例如通过吸入过程，也可以通过药学常用给药途径来给药。在这些途径中，可以参照舌下、经口腔和直肠的给药，表皮施用，和皮下、肌内、静脉内或者腹膜内注射过程。然而，优选通过吸入过程对环加氧酶抑制物进行给药。因此，环加氧酶抑制物可以粉末(例如，细微分割的固体，纯态，或与具有生物相容性的载体粉末相混合，或与一或多种附加的治疗性化合物相混合)或可以液体(例如，溶解于或悬浮于具有生物相容性的液体载体中，可择与一或多种附加治疗性化合物相混合)来进行给药，但是以喷雾形式可以更为方便地被患者吸入(优选包括直径低于10μm的颗粒或者液滴)。适宜作吸入载体的液体载体和粉末普遍用于传统的哮喘吸入疗法，因而在本领域中众所周知。
按照治疗有效剂量使用环加氧酶抑制剂，本领域技术人员可轻易确立这种有效剂量，其取决于所用化合物的类型和给药的途径以及其他一些因素。正如对于本领域的技术人员应该显而易见的是，在本方面和通用于说明书和权力要求中，术语“治疗性”包括预防性治疗和对确定病症的治疗。此外，“治疗有效”用其在本领域内的通用意义，就如同上述提及的专利申请EP 560 928 B1所定义的，通常在这个具体情况中，当环加氧酶抑制剂逆转了由单独使用气态NO所引发的负面效果时，它就是治疗有效的。作为本方面的指导，可附加说明的是，当化合物双氯酚酸钠以总剂量50-150mg/天，以口服药片、栓剂、肌内注射或静脉注射等方式施用于成年人时，其一般是有效的。这相当于约0.1-5mg/kg体重的剂量，例如0.15-3mg/kg体重当以气雾剂形式使用时。然而，有时候较低剂量就可以起到效果，而有时候则需要较高的剂量。对于其它的化合物，这可以用来作为建立合适剂量的基础。
根据本发明的第二方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物特别是人类肺部血管收缩或者呼吸道收缩的方法，它的目的在于抵消在使用气态NO和NO供体治疗时患者的低反应或无反应，和/或抵消在仅使用气态NO和NO供体时撤消治疗患者表现出的反弹效应。上述方法包括对需要这种治疗的哺乳动物进行吸入过程给药，使用以气态NO或者NO供体为形式的NO，并且联合使用环加氧酶抑制剂。上述联合应该使用治疗有效剂量以达到上述的抵消效果。
上述方法的具体的和优选的实施方案可参考那些与本发明的用途相关的、已被描述了的具体的和优选的实施方案。
最后，根据本发明的第三方面，提供治疗哺乳动物特别是人类肺部血管收缩或者呼吸道收缩的药物制剂，它的目的在于抵消仅使用气态NO和NO供体治疗时患者的低反应或无反应，和/或抵消在撤消仅使用气态NO和NO供体的治疗时患者表现出的反弹效应。本发明使用以气态NO或者NO供体为形式的NO，并联合使用环加氧酶抑制剂。上述气态NO和上述环加氧酶抑制剂应在上述治疗的治疗有效剂量才能达到上述抵消效果。
上述制剂的具体的和优选的实施方案也可参考上述那些根据本发明用途的具体的和优选的实施方案。
本发明将由下述非限制性的实施例说明。
实施例施行实验以研究环加氧酶抑制剂-双氯酚酸钠-与NO吸入的关系，更为具体地研究其在终止上述吸入所引起的反弹效应中的效果。
材料和方法动物准备Uppsala大学的动物研究道德委员会批准了本研究。重24-29Kg的26头瑞典猪被用于研究。在从农场的运输前，用神经镇静药，azaperonum(STRESNIL，Janssen，比利时)，40mg肌内注射给猪。用阿托品(0.04mg/Kg)，噻环乙胺(tiletamin)/唑氟氮(ZOLETIL，Virbac实验室)(6mg/Kg)和xylzry(ROMPUN，B ayer AG，德国)(2.2mg/Kg)诱导麻醉。在诱导后，将一根套管插入耳部静脉并注射入阿片样物质(5μg/Kg)(FENTANYL，抗原医药有限公司，Roscrea，爱尔兰)。用帕乌龙(PAVULON，Organon Technika AB，Gteborg，瑞典)(0.2μg/Kg)松弛肌肉。持续注入安眠药(chlomethiazole，HEMINEVRIN，Astra，Sdertlje，瑞典)(400mg/hour)、帕乌龙(2mg/hour)和芬太尼(150μg/hour)以维持麻醉状态。如需要，重复静脉注射0.2-0.5mg芬太尼。当皮切口不会引起心跳和血压的任何变化时，麻醉的程度就足够了。加入预热(38℃)的等渗盐500ml/hour以供水合作用。在余下的研究中，将动物安置于仰卧状态(背侧横卧)。
麻醉后施行气管切开术，插入一个带套囊的气管导管(cuffedtracheal tube)(内径为6mm)。用一个容量给药的换气机(西门子900c)提供机械换气。用换气机内的变换器记录呼吸道的压力和准确的换气。将呼吸频率维持在每分钟20次，调整潮汐的容积(tidal volume)使潮落时的CO2(PetCO2)压力维持在36-41mmHg(4.8-5.4kpa)。吸气时间是25％；在吸气末尾施加一个持续时间为整个呼吸循环5％的停顿，同时施加5-cm H2O的呼吸压(PEEP)。吸入的氧气(FIO2)比例为0.5。
导管插入和血液测量将一个带橡皮头的三联腔导管(Swan Ganz no.7F)经右侧外部颈静脉插入肺动脉中以采取血样和记录压力，将一个大口径的导管插入对测颈部静脉用以注入之用，并将它的头部放入上部的腔静脉。将导管插入右侧颈动脉用以采取血样和记录动脉压力。
将动脉、中央静脉及肺动脉的导管被连接到适应的压力变换器(Sorenson Transpac变换器，Abbott紧急治疗系统，伊利诺伊州，美国)，用Marquette 7010监视器(Marquette电子公司，威斯康星州，美国)纪录压力。纪录动脉压力的平均值(MAP)、肺动脉压力的平均值(MPAP)、心率(HR)，中央静脉压力(CVP)，肺部毛细血管楔压(PCWP)及心输出量(Qt)。用换气机纪录呼吸道的压力。血管压力取自整个呼吸循环中的平均值，以中央胸廓为零参考值。
用热稀释法来测量Qt将10ml冰预冷的等渗盐以大剂量注射入，并计算出Qt(心输出量计算机Marquette 7010，Marquette电子公司，威斯康星州，美国)。在每次测量中至少注射三次，然后计算出平均值。注射均匀分布于整个呼吸循环中。在每次测量中记录呼气的准确体积。收集混合的静脉和动脉血样以作血液气体分析(ABL 3，辐射计，哥本哈根，丹麦)，同时收集氧饱合和血红蛋白浓度(OSM 3，辐射计，哥本哈根，丹麦)和5ml动脉血，分离血浆以作生化分析之用(见下)。
肺部损害静脉注入25μg/Kg/小时的内毒素连续三小时，诱导急性肺部损害，然后在剩余实验阶段用10μg/Kg/小时的内毒素维持肺部损害。
实验步骤手术后30分钟，对血液动力学进行基线测量，采取血样，并收集血液用以后续生化分析。静脉注入25μg/Kg/小时的内毒素(LPS，大肠杆菌0111B4，Sigma化学药品，圣路易斯，密苏里州，美国)连续三小时，诱导急性肺部损害。在开始注入内毒素后30，60，120，150分钟测量反应。然后将猪分为3组“环加氧酶(COX)阻滞组”，“非阻滞组”，和“对照组”，以分析环加氧酶抑制剂可能的INO-推进效果。
1.在环加氧酶阻滞组，在开始吸入30ppm的INO之前，持续注入内毒素3小时。在开始吸入INO之前，静脉注射入非选择性的环加氧酶抑制剂-双氯酚酸钠(Sigma D6899)的盐溶液(300/kg)。30分钟后，当终止吸入NO前，测量血液动力学和气体交换，并采取血样以用作生化分析。当撤除NO后5，10，15，30分钟，进行测量以检测是否有反弹反应。然后再进行30分钟的NO吸入(也就是在开始注入内毒素后4小时)，并再次终止NO，在如前述相同的时间点测量结果。目的是检测对INO的反应是否保持不变或是发生变化，检测是否有任何反弹效应变强或是在第一次以后发生。
2.在非阻滞组，不加入环加氧酶抑制剂。除此而外，其他步骤与环加氧酶阻滞组相同。在本研究中，经胸骨切开术在4个时机(在NO吸入之前，期间以及以后)取5头猪的肺组织样品。
3.在对照组，同样注入内毒素，但是不加INO或环加氧酶抑制剂。对对照组猪进行基线水平研究，并在与2次INO作用的开始和结束一致的时间点，及在实验结束时，开始注入内毒素后5小时，对对照猪进行研究。
在注入内毒素开始后的研究周期为300分钟(5小时)，总的研究时间，包括麻醉，准备和内毒素注入前的基线测量，大约为7小时。
NO给药和呼吸气中的NO记录N2中1000ppm NO，再与混合气O2/N2相混合，然后连接至换气机的低流入口。吸入的气体通过含碱石灰的滤罐以吸收所有的NO2。在换气管的吸入分支处，用化学发光法(9841 NOx，Lear SieglerMeasurement Controls Corporation，Englewood哥伦比亚，美国)测量吸入的NO和NO2的浓度。将吸入的NO的压力设定在30ppm，将吸入的NO2的压力设定在低于0.5ppm。
通过Western印迹验证COX-1和COX-2的表达用4℃的PBS润洗肺组织块。在5倍体积的冰预冷的0.05M Tris缓冲液(pH7.4)中，其含0.5mM的苯基甲基磺酰基氟化物以抑制蛋白质水解，用匀浆法(Ultra-Turrax，Jenke and Kunkel，IKALabortechnik，Staufen，德国)进行肺组织的总蛋白提取。收集上清液并将其贮藏于-80℃直至分析所用。用Lowry法确定上清液中总蛋白的浓度。用十二烷基硫酸纳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，然后将分离后的蛋白电转移至硝化纤维膜。在4℃的5％BSA的TBS溶液中封闭印迹过夜，然后和含有1％BSA的抗-COX-1(1∶2500，CaymanChemical，MI，USA，Ca 160108)，COX-2(1∶1500，Cayman Chemical，MI，USA，Ca 160108)的TBS溶液中孵育过夜。用TBS溶液洗涤五次。将印迹与偶联羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)的辣根过氧化物酶(1∶2500稀释，Vector实验室，Burlingame，USA)进行孵育。用TBS溶液洗印迹五次，用增强化学发光的试剂(Ameraham，Arlington Heights，IL，USA)，在感光胶片上检测抗原抗体复合物。所有实验重复三次，用(美国)全国卫生研究所(NIH)的程序Image 1.6C对每次实验的结果进行分析。
TXB2血浆将血液收集在预冷的装有EDTA(10mM，终浓度)的试管中，离心(10min，40C)。用市售的酶联免疫测定试剂盒(Thromboxane B2 EIAkit Cayman Chemical，MI，USA，Ca 519031)测定TXB2的浓度。从每只试管中收集血清，贮藏于-70℃直至进行TXB2浓度测定。为确保所有的样品不含有机溶剂，在将血清加入测试孔前对其进行纯化。根据Cayman Chemical Introduction对TXB2进行纯化，首先向每一份样品中加入10,000cpm的氚标记的TXB2(3H-TXB2)，然后加入2ml乙醇，在4℃振荡处理5分钟，然后在1500g离心10分钟，以去除沉淀的蛋白。收集上清液并将其与超纯水混合。将样品通C-18的反相柱。取流出液的10％作闪烁计数。
重复两次酶联免疫测定，在微量板上将50μl纯化后的样品与50μl示踪化合物和50μl抗血清相混合。温育18小时后，加入200μl Ellmans试剂开始酶反应，30分钟后用微量板光度测定器(Thermo Max，Molecular Devices)测量每个小瓶在405nm的吸收值。对8个已知浓度范围在7.5至1000pg/ml的TXB2的吸收值进行非线性回归而得到标准曲线，而后从中估计样品中TXB2的浓度。测试间和测试内的差异系数小于10％。更多的细节请参见TXB2 Enzyme immunoassayKit 519031 Cayman化学手册。
统计分析在所有研究条件下计算所有变量的平均值和平均值的标准偏差。用变量分析(ANOVA)对于重复测量进行比较；对多重比较进行校正。P＜0.05水平的差异被认为显著。
结果内毒素诱导的肺部损害基线水平血液动力学和动脉氧化相同于先前实验中健康猪的测量结果(Freden F等，Br J Anaesth，1996第77(3)卷，第413-418页)。在这三个组之间不存在差异。
内毒素注入在所有组中在注入150分钟后引起MPAP增加两倍。PaO2被显著降低，至基线水平的一半。此外，心率增高而心输出量降低。在UN-COX组，在开始注入内毒素后3小时和4小时，测量结果没有显著不同。在对照组，在开始注入内毒素后3小时和4小时和5小时，测量结果没有显著不同。
No的吸入和终止在非阻滞实验组，在开始注入内毒素后3小时，吸入30ppm的NO导致MPAP水平降低28％和PaO2水平增加54％。30分钟后，当终止吸入NO时，MPAP水平快速增高(在5分钟内)，至高于NO吸入前水平的23％(9mmHg)，从而产生了反弹效应。PaO2水平快速降低至NO吸入前水平，但并没有表现出反弹现象。
注射内毒素4小时后，当重复吸入NO时，MPAP水平的下降和PaO2水平的增加很微弱，较之一小时前的实验，PaO2的水平变化不再显著。当终止吸入NO五分钟后，MPAP的水平再一次显著的增加并高于NO前的水平(+26％)，PaO2的水平下降到低于NO前的水平。因此，可以观察到明显的反弹的血氧不足。
在NO吸入中PaO2水平的增加和对终止NO吸入的反弹效应的程度之间存在着反比关系。因此，对吸入NO的反应越弱，当终止吸入NO时PaO2下降的水平越大。对MPAP未观察到此类关系。
在COX-阻滞组中，预先用双氟酚酸钠处理降低了MPAP的水平。INO显著的降低了MPAP的水平并增加了PaO2的水平。然而，当INO终止时，MPAP和PaO2均未显示出反弹效应。MPAP减少的程度并没有因联合使用INO和双氯酚酸钠而增加。尽管如此，比之非阻滞组，阻滞组延长了吸入NO的作用时间。此外，与在非阻滞组中对NO的反应削弱相反，第二次NO吸入实验和一小时前的第一次实验一样，INO使得MPAP和PaO2增加相同的水平。当INO终止时，没有再次记录到反弹效应。在内毒素输入期间，呼吸阻力(resistance)增加了。单独使用INO不会预防或者削弱这种增长趋势。然而，在COX阻滞组中，阻力的增加显著减低(P＜0.01)，并且在整个INO期间，阻力并没有增加。
在对照组中，在两个小时中，MPAP和PaO2的水平始终保持稳定，与实验组中INO的作用相应。因此，INO组和对照组之间的比较更清楚的揭示了2次受INO作用下对MPAP和PaO2的改进，INO终止的反弹效应和COX抑制剂的功效。
NO的吸入和终止并不影响COX-1的表达，不论是INO实验3小时还是5小时。在无阻滞组中，COX-2的表达在内毒素注射后3小时显著增加，在5小时增加到了几乎通常基线水平(p＜0.01)的10倍。不论在3小时还是5小时吸入实验，30分钟的INO并不影响表达的状况。同样的，COX-2的表达在INO时期后保持增加。
血浆TXE-2因子的浓度在3个实验组的基线水平并没有显著差异。血浆TEX-2的水平在内毒素开始注射后半个小时剧烈增加(6000-8000pg/ml)，而在注射后3小时降低到基线的2倍，且这种变化在3个实验组的中没有差别。在非阻滞组中，血浆TXE-2的水平在NO吸入过程中并不变化，但在减少NO后5分钟时增加并且在INO后15分钟达到峰值(p＜0.05)。当30分钟后第二次INO实验开始后，血浆TXE-2的水平继续保持升高(20000-40000pg/ml)，并且当第二次INO终止时再次进一步增加。在COX阻滞组中，血浆TXE-2的水平在第一次INO作用和终止时并不增加。当第二次INO实验时血浆TXE-2的水平下降并且当INO终止时NO时并不增加。
权利要求
1.可吸入的一氧化氮(NO)的用途，其为气态NO或者NO供体形式，与环加氧酶抑制剂联合用于生产治疗哺乳动物特别是人的肺部血管收缩和呼吸道收缩的药物，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应和/或抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，上述的联合使用在治疗有效量实现上述的抵消作用。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的肺部血管收缩和呼吸道收缩与临床症状相关，这些症状选自外伤性损伤，肺部脂肪栓塞，酸中毒，成人呼吸窘迫综合症，急性高山病，心血管和肺部术后急性肺动脉高压，新生儿持续肺动脉高压，围产期吸入综合症，透明膜病，急性肺部血栓栓塞，急性肺部水肿，肝素鱼精蛋白反应，缺氧和支气管哮喘。
3.根据权利要求2的用途，其中所述的呼吸道收缩与支气管哮喘相关。
4.根据权利要求3的用途，其中所述的呼吸道收缩与急性支气管哮喘和状况哮喘相关。
5.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的药物是可吸入药物。
6.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的生产涉及适于按照任何顺序施用所述的NO和所述的COX抑制剂的药物。
7.根据权利要求1-5任一项的用途，其中所述的药物形式为含上述的NO和环加氧酶抑制剂的组合物，实现其同时给药。
8.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的环加氧酶抑制剂选自双氯酚酸钠；醋氯芬酸；萘丁美酮；meloxicam；甲氯芬那；nimesulide；扑热息痛；rofecoxib；celecoixb；DuP 697；GR 32191；flosulide；NS 398；L-745,337；DFU；HN-56249；JTE-552；阿司匹林；吲哚美辛；和布洛芬；或其酸加成盐.
9.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的NO以1-100nmol/min的量存在于所述药物中。
10.根据前述任一项权利要求的用途，其中所吸入的NO的浓度应在1-180ppm范围内，优选1-80ppm，特别是1-40ppm。所述的NO存在于载体气体中或气体混合物中。
11.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述的NO供体选自S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，S-亚硝基半胱氨酸，硝普盐，亚硝基胍，甘油三硝酸酯，异戊亚硝酸盐，无机亚硝酸盐，叠氮化物和羟胺
12.治疗哺乳动物特别是人的肺部的血管收缩和呼吸道收缩的方法，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应或者抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，其包括对需要此种治疗的动物以吸入方式施用一氧化氮，其形式为气态可吸入的NO或者NO供体与环加氧酶抑制剂，该联合使用在治疗有效量实现上述的抵消作用。
13.根据权利要求12的方法，如在权利要求2-11中所定义。
14.用于治疗哺乳动物特别是人的肺部血管收缩和呼吸道收缩的的药物制剂，其目的在于抵消单独使用气态NO或者NO供体治疗时患者的低反应或不反应或者抵消在撤消单独使用气态NO或者NO供体的治疗时所产生的反弹效应，该药物制剂包括一氧化氮(NO)，形式为气态NO或者NO供体，联合环加氧酶抑制剂，该一氧化氮和该环加氧酶抑制剂以治疗有效量存在来实现上述的抵消作用。
15.根据权利要求14的药物制剂，用于如在权利要求2-11中定义的用途。
全文摘要
本发明涉及可吸入的气态一氧化氮联合环加氧酶抑制剂用于生产治疗哺乳动物、包括人类的肺部血管收缩或呼吸道收缩的药物中的用途，其目的在于抵消单独使用气态NO或NO供体治疗时患者的低反应或不反应和/或抵消在撤消单独使用气态NO或NO供体的治疗时所产生的反弹效应，所述联合以治疗有效量来实现舒缓所述肺部血管收缩或呼吸道收缩，也涉及使用上述联合治疗肺部血管收缩或呼吸道收缩的方法或药物制剂。
文档编号A61K33/00GK1481256SQ0182089
公开日2004年3月10日 申请日期2001年11月15日 优先权日2000年11月17日
发明者G·赫丹斯逖尔纳, 陈鲁妮, G 赫丹斯逖尔纳 申请人:Aga公司
最新回复(0)