治疗病毒感染的联合方法
专利名称：治疗病毒感染的联合方法
技术领域：
本发明涉及治疗病毒感染，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的联合疗法和方法。
背景技术：
毫无疑问获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致因物HIV引起全球性健康危机，虽然近年来在药物治疗方面的进展成功证明AIDS的进程，但是仍然存在对发现一种更安全更便宜的控制这种病毒的方法的需求。
HIV感染是通过病毒与靶细胞膜接触通过与细胞受体CD4和第二趋化因子辅助受体分子的相互作用而开始的。其通过被感染细胞通过血液和其它组织的复制和传播而发展。有各种各样的趋化因子，但是对于亲巨噬细胞HIV，相信作为感染早期体内复制的关键病原毒株，HIV进入细胞所需要的主要趋化因子受体是CCR5。还有人报道过CCR5基因在抵抗HIV感染中起作用，因为具有CCR5基因同型缺失的个体对HIV感染的抵抗力非常强。因此，干扰病毒受体CCR5和HIV之间的相互作用可以阻断病毒进入细胞而没有任何显著的副作用。
人们还注意到HIV-1包膜蛋白，例如，gp160，gp120和gp41，它们是AIDS患者体内存在的抗-HIV抗体的主要抗原。美国专利No.5,464,933和6,020,459和国际专利公开WO 96/40191描述了H1Vgp41蛋白质的一部分(已知为DP-178，T-20，和pentafuside)，它是病毒获许进入CD4+细胞所必需的。该蛋白质片段可以阻止HIV获许进入宿主CD4+细胞，并且还防治病毒的细胞与细胞间传递。
有人将T-20以连续输液或者一天两次(bid)皮下给药，一般剂量是100毫克/天。这使得接受这种肽治疗的患者生活大大不方便，因为接受这种抗-HIV治疗的患者必须一天两次到医生那里接受肽注射。
Vandamme等[抗病毒化学和化疗(Antiviral Chemistry&Chemotherapy)9187-203(1998)]公开了当前对人HIV-1感染的临床治疗方法，包括至少三种药物联合或者称为高活性抗逆转录病毒疗法(″HART″)；HAART包括核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和HIV蛋白酶抑制剂的各种组合。适用于单纯药物的患者，HAART在降低死亡率和HIV-1发展成AIDS中是有效的。但是，这些多种药物治疗方案不会消除HIV-1，并且长期治疗通常导致广谱抗药性。此外，NIV疗法昂贵，每年花费上万美元。提供通过不同的机理阻断HIV融合并进入CD4+细胞之中，有更方便的给药方案，并且与已知的治疗方法相比抗HIV更有效，花费更低的抗-HIV治疗方法是有益的。因此，保持优先的是开发提供更好的HIV-1治疗的新的药物疗法。
发明概述本发明提供改进的治疗病毒感染特别是HIV感染的方法。提供新的药物联合治疗法，包括有效量的第一种抗病毒剂，它是一种结构式I或II的哌啶衍生物或者其药学可接受盐，和有效量的第二种抗病毒剂，它是一种DP-178多肽或者其药学可接受衍生物。应用适合抑制病毒活性，病毒表达，病毒传播，或者减少病毒负载的剂量和给药方案对感染病毒优选HIV的个体施用本发明的组合。本发明的联合疗法优选提供与其它已知的抗-HIV联合疗法或者只含有本发明组合中存在的抗病毒剂中的一种的疗法相比具有改进的功效的疗法。更优选地，本发明的联合疗法是一种协同组合。
本发明的一个优点是本发明的联合治疗使得临床医生减少DP-178多肽给药频率(即，比每天两次少)，并且，如果期望，如下所述与一种或多种另外的治疗化合物联合给药。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗HIV感染的方法，包括联合给与治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐，和治疗有效量的DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗HIV感染的方法，包括施用下面结构式的CCR5拮抗剂 或者其药学可接受盐，和T-20，其中以25-400毫克/天的日剂量每天1-2次给与CCR5拮抗剂，并且以3-200毫克的剂量或者以将受感染个体的病毒负载量减小1或2个对数的其倍数每隔一天一次(qd)或者每周一次(qd)两次，三次或四次给与T-20。
另一方面，本发明提供用于联合治疗HIV感染的单一包装药物组合物的试剂盒，其包括在第一容器中含有在药学可接受载体中含有CCR5拮抗剂或其药学可接受盐的药物组合物，每周1-3次或隔天一次给药的口服剂量是25-600毫克，和在第二容器中含有药学可接受载体中含有DP-178多肽或其药学可接受衍生物的药物组合物，以3-200毫克的皮下剂量，或将病毒载量减小1或2个对数的其倍数。
本发明的详细描述使用术语″病毒感染″来描述一种疾病状态，其可能是潜伏的，病毒侵入细胞，利用细胞的复制机器繁殖或复制，最终溶解细胞引起细胞死亡，并且产生后代病毒颗粒，接着通过繁殖进一步感染其它细胞。
与病毒感染相关使用的术语″治疗″或″预防″意思是抑制病毒活性，表达，病毒的复制或传播，或者防止病毒在宿主细胞中自我繁殖，这些导致病毒感染引起的疾病综合症的改善或减轻。如果有病毒载量的减少或死亡率或发病率降低，则认为处理或疗法是治疗性的。
DP-178多肽或CCR5拮抗剂化合物，或者它们的衍生物的“治疗有效量”是根据合适的给药方案足以治疗或预防病毒感染的量，即，量和给药方案表现出抗病毒活性，从而将受感染个体血清中HIV RNA血浆水平降低至每毫升血清少于500个拷贝，优选至每毫升血清少于200个拷贝，更优选至每毫升血清少于50个拷贝，最优选拷贝数是根据定量多循环逆转录酶PCR方法测定检测不到的。优选使用Amplicor-1Monitor 1.5(从Roche Diagnsotics获得)或Nuclisens HIV-1 QT-1方法测定HIV RNA。
术语″联合疗法″指治疗病毒感染优选HIV感染的疗法，其包括施用有效量的CCR5拮抗剂和DP-178多肽。本发明的联合疗法可以包括一种或多种抗病毒剂，例如，HAART。另外，本发明的联合疗法可以被用作以前未感染个体在可能严重接触HIV病毒之后的预防措施。肽的这种预防性应用的例子包括但不限于预防病毒从母体传播给婴儿和存在HIV传播可能的其它环境，象，例如，工作人员暴露给含有HIV的血产品下健康护理环境中的偶发事件。
术语″协同″指比任何两种或多种单一物质的加和效果更有效的组合。″协同作用″指在治疗或预防病毒感染的单一疗法中使用更低量或剂量的抗病毒剂的能力。更低剂量一般导致毒性降低而功效不降低。另外，协同作用能够提高功效，例如，提高的抗病毒活性，或者避免或降低抵抗抗病毒剂的任何病毒抗性的程度。用常规的抗病毒测试方法，例如如下所述，能够测定DP-178多肽或者其药学可接受衍生物，和CCR5拮抗剂或者其药学可接受盐之间的协同作用。利用获得联合系数(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55)和使用计算机软件的剂量效果分析(Chou和Chou，1987，Software andManual.p19-64.Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)的Chou和Talalay联合方法能够分析测试的结果。联合系数值小于1表明协同作用，大于1表明拮抗作用，等于1表明加和作用。利用Pritchard和Shipman的方法(Pritchard和Shipman，1990，抗病毒研究(Antiviral Research)14181206)也能分析这些测试的结果。
术语″药学可接受载体″指不干扰活性成分的生物活性的效力，是化学惰性的并且一般对受体无毒的载体介质。
术语″药学可接受衍生物″指表现出抗病毒活性并且一般是无毒的多肽的截短物，类似物或其它修饰。
术语″抗病毒活性″指HIV向未感染CD4+细胞传递的抑制作用，HIV复制的抑制作用，防止HIV在宿主中自我繁殖，或者改善或减轻HIV感染引起的疾病症状。通过下文所述测试中病毒载量的减少或死亡率和/或发病率的降低能证实这些作用。抗病毒剂，或抗-HIV-1药物，具有抗病毒活性，并且用于治疗单纯HIV-1感染，或者作为多种药物联合治疗例如，HAART三联和四联联合治疗的部分。
″治疗剂″是改善对病毒感染或者病毒感染引起的疾病的治疗的任何分子，化合物或疗法。优选地，所述治疗剂具有抗病毒活性。
其传播可以被本发明联合疗法的抗病毒活性抑制的病毒包括，例如人逆转录病毒，特别是HIV-1和HIV-2和人T-淋巴细胞病毒(HTLV-I和II)；非人逆转录病毒，包括牛造白血病组织增生病毒，猫科动物病毒和白血病病毒，和羊进行性肺炎病毒；非逆转录病毒，包括人呼吸合胞体病毒，犬科温热兽病病毒，新城疫病毒，人副流感病毒，流感病毒，麻疹病毒，埃-巴二氏病毒，乙肝病毒，和猿Mason-Pfizer病毒；和没有包膜病毒，包括细小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒，甲肝病毒，肠道病毒，艾可病毒和柯萨奇病毒，乳多空病毒例如乳头状瘤病毒，细小病毒，腺病毒和呼肠病毒。
哌啶衍生物CCR5拮抗剂化合物具有下面结构式I和II的化合物，和其药学可接受盐，这里通称为″CCR5拮抗剂″。这些化合物对抗CC5趋化因子受体，并且描述于美国专利申请顺序号Nos.09/562,815和09/562,814和WO 00/66559和WO 00/11632中，这些专利文献在此分别全文引作参考。
在一个实施方案中，本发明的联合疗法包括结构式I的化合物，或者其药学可接受盐 其中R6，X和R2如表1中定义表1 在一个具体的实施方案中，本发明的联合疗法包括下面结构式的化合物 或者其药学可接受盐。
在另一个实施方案中，本发明的联合疗法中使用的CCR5拮抗剂化合物具有结构式II，或者其药学可接受盐 其中R，R3，R6和R2如表2中定义表2 在一个具体的实施方案中，本发明的联合疗法包括下面结构式的化合物 或者其药学可接受盐。
本发明中使用的一些CCR5拮抗剂化合物可以以不同的异构体形式存在，例如，对映异构体，非对映异构体和阻转异构体。本发明包括纯形式和混合物的所有这样的异构体，包括外消旋混合物。
一些化合物在自然状态下是酸性的，例如，带有羧基或酚羟基的化合物。这些化合物可以形成药学可接受盐。这样的盐的例子包括钠盐，钾盐，钙盐，铝盐，金盐和银盐。还包括与药学可接受胺例如氨，烷基胺，羟基烷基胺，N-甲基葡糖胺等形成的盐。
一些碱性化合物也形成药学可接受盐，例如，酸加成盐。例如，吡啶并-氮原子可以和强酸形成盐，而带有碱性取代基例如氨基的化合物也和弱酸形成盐。用于生成盐的合适的酸的例子是盐酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，苹果酸，富马酸，琥珀酸，抗坏血酸，马来酸，甲磺酸和本领域技术人员公知的其它无机酸和羧酸。通过使游离碱形式以常规方式接触足够量的期望的酸产生盐来制备盐。通过用合适的碱稀水溶液例如NaOH，碳酸钾，氨和碳酸氢钠稀水溶液处理盐可以再生游离碱形式。游离碱形式与它们的各种盐在一些物质性质上多少有些不同，例如在极性溶剂中的溶解度，另外，就本发明目的来说，酸和碱盐等价于它们各自的游离碱形式。
所有的这样的酸和碱盐是本发明范围内的药学可接受盐，并且认为所有的酸和碱盐就本发明目的来说等价于相应化合物的游离形式。
根据本领域公知的方法能够制备本发明中使用的CCR5拮抗剂化合物，例如，应用USP 5,883,096，USP 6,037,352，USP 5,889,006，USP5,952,349，和USP 5,977,138中描述的方法，这些专利文献在此全文引作参考。美国专利申请No.09/562,815和09/562,814和WO00/66559和WO 00/11632提供了制备在本发明中使用的CCR5拮抗剂的具体方法。
DP-178多肽DP-178多肽(即，全长DP-178和其药学可接受衍生物)描述于USP5,464,933，USP 6,020,459和WO 96/40191，这些专利文献各自在此全文引作参考。通过和病毒与靶细胞融合所必需的gp41上的远侧区(可能是DP-107)形成复合体，病毒gp41的DP-178区可以介导HIV和靶细胞膜的融合。本发明中使用的DP-178多肽表现出抗融合活性，(抑制病毒与宿主细胞膜融合)抗病毒活性，和/或调节涉及螺旋肽结构的胞内进程的能力，并且被USP 6,020,459中描述的ALLMOTI5，107X178X4和PLZIP检索主题鉴定或识别。
全长DP-178多肽以分离的来自HIV-1LAI的跨膜蛋白gp41的跨越残基638-673的36个氨基酸残基为基础，并且具有氨基酸序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(T-20；SEQ ID NO1)。
本发明中使用的DP-178多肽的类似物在全长DP-178多肽中包含一个或多个氨基酸取代(保守的或不保守的)，插入和/或缺失。来自其它病毒分离物或物种，或者来自其它生物体的DP-178类似物也是DP-178的类似物。除了全长DP-178多肽(SEQ ID NO1)之外，本发明中使用的DP-178多肽包括包括3-35个连续的氨基酸残基的全长DP-178的截短物。DP-178类似物也可以是截短的。USP 5,464,933，USP6,020,459，和WO 96/40191中描述了DP-178的截短物和类似物。
本发明中使用的DP-178多肽中氨基酸取代作用可以是保守的或不保守的取代作用。保守的氨基酸取代作用置换DP-178多肽序列中的一个或多个氨基酸，所述氨基酸有相似电荷，大小，和/或疏水性特征，象，例如，谷氨酸(E)与天冬氨酸(D)。非保守取代作用置换DP-178多肽序列中的一个或多个氨基酸，所述氨基酸有不同的电荷，大小，和/或疏水性特征，象，例如，谷氨酸(E)与缬氨酸(V)。
HIV-1和HIV-2包膜蛋白结构上不同，但是HIV-1和HIV-2的DP178-相应区中存在惊人的氨基酸保守性。氨基酸保守性是一种周期性性质，提示结构和/或功能的某些保守性。因此，一类氨基酸取代作用包括预计稳定本发明DP-178肽的结构的氨基酸改变。利用这里描述的和USP 6,020,459中描述的DP-178全长和DP178类似物序列，本领域技术人员能容易地确定DP-178共有序列，并且确定代表优选的氨基酸取代作用的保守氨基酸残基。
本发明中使用的DP-178多肽中氨基酸插入包括一个或多个单个氨基酸残基或一段残基插入DP178多肽中。DP-178多肽的氨基或羧基末端或者在多肽的中间位置可以有一处或多处插入。优选地，内部插入长度是2-15个氨基酸。优选地，氨基或羧基末端插入是大约2至大约50个氨基酸并且相应于是全长DP-178氨基酸序列的氨基或羧基的gp41的多肽序列。
本发明中使用的DP-178多肽可以包含一处或多处缺失。DP-178多肽中的缺失可以是去除一个或多个单一的氨基酸残基或一个或多个连续的氨基酸段，和它们的组合。包含缺失的DP-178多肽有至少4-6个氨基酸。
本发明中使用的DP-178多肽类似物是来自除HIV-1LAI之外的来源例如其它HIV-1和HIV-2分离物，非-HIV-1LAI有包膜病毒，没有包膜病毒和非病毒生物体的全长或截短DP-178。DP-178类似物也能包含如上所述的一个或多个缺失，插入或取代。DP-178类似物可以包括，例如，有包膜病毒的跨膜蛋白中存在的肽序列或者没有包膜病毒和非病毒生物体中存在的多肽序列。USP 5,464,933，USP 6,020,459，和WO 96/40191中描述了DP-178类似物，并且包括YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(DP-185；SEQ ID NO3)；YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF(SEQ ID NO4)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO5)；和LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL(SEQ ID NO6)，它们分别从HIV-1SF2，HIV-1RF，HIV-1MN，和HIV-2NIHZ分离物衍生。
本发明中使用的DP-178多肽可以存在对氨基和/或羧基末端的修饰作用，提供，例如，提高的生物可利用率，稳定性，或者降低的宿主免疫识别。例如，末端NH2基团可以被疏水性基团，羧苄基，丹酰，或叔丁氧羰基，乙酰基，或者9-芴基甲氧-羰基(FMOC)置换。大分子基团，例如，脂质-脂肪酸偶合物，聚乙二醇，碳水化合物或肽基，能够与NH2或者与修饰物共价连接。例如酰氨基，叔丁氧羰基，或共价连接的大分子基团，例如，脂质-脂肪酸偶合物，聚乙二醇，碳水化合物或另外一个多肽基团可以置换末端COOH基团。大分子基团可以与COOH或修饰物连接。
下表提供了可以在本发明中使用的DP-178多肽的例子表3YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO1)；YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(DP-185；SEQ ID NO3)；YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF(SEQ ID NO4)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO5)；LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL(SEQ ID NO6)；CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO7)；WMEWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO8)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWLIKFI(SEQ IDNO9)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF(SEQ ID NO10)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANWF(SEQ ID NO11)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO12)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF(SEQ ID NO13)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF(SEQ ID NO14)；YTSLIHSLQEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO15)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO16)；YTSLIHSLIEQSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO17)；YTSLIHSLIQESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO18)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO19)；YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO20)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF(SEQ ID NO21)；YTSLIHSLIEESQNLQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO22)；YTSLIHSLIEESQNQQEKLEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO23)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEFDKWASLWNWF(SEQ ID NO24)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASPWNWF(SEQ ID NO25)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNSF(SEQ ID NO26)；NKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKASLWNW F(SEQ ID NO27)；SLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO28)；LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQE(SEQ ID NO29)；EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO30)；QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN(SEQ ID NO31)；IWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE(SEQ ID NO32)；WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ(SEQ ID NO33)；NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE(SEQ ID NO34)；NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL(SEQ ID NO35)；MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ IDNO36)；TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO37)；WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL(SEQ ID NO38)；WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO39)；MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD(SEQ ID NO40)；EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK(SEQ ID NO41)；WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW(SEQ ID NO42)；DREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA(SEQ ID NO43)；REINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS(SEQ ID NO44)；EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL(SEQ ID NO45)；INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW(SEQ ID NO46)；NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO47)；TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN(SEQ ID NO48)；SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI(SEQ ID NO49)；LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT(SEQ ID NO50)；TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO51)；LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO52)；ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO53)；NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO54)；EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO55)；LRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAV(SEQ ID NO56)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO57)；NNLLRAIEAQQGLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO58)；NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQGGC(SEQ ID NO59)；NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQGGC(SEQ ID NO60)；CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYKDQGGC(SEQ ID NO61)；和LSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV(SEQ ID NO62)。
DP-107肽任意地，DP-178多肽可以和DP-107多肽使用，这描述于USP6,020,459和WO 96/40191。因为跨膜蛋白gp41的DP-107和DP178部分形成正常病毒感染所必需的非共价的蛋白质-蛋白质相互作用，DP178和DP-107肽的化合可以与病毒gp41形成复合体，并且干扰融合过程。因此，可以预期在本发明的联合疗法中使用DP-107多肽。
全长DP-107多肽是相应于HIV-1LAI跨膜gp41蛋白的558-595残基的38个氨基酸，如下所示NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO2)。
本发明中使用的DP-107多肽包括全长DP-107多肽的截短物，并且包含3-38个连续的氨基酸残基。DP-107截短物的实施例描述于USP 6,020,459和WO 96/40191。
本发明中使用的DP-107多肽包括全长的和截短的DP-107的类似物，这些类似物包含如上文对于DP-178所述的一个或多个氨基酸取代(保守的或不保守的)，插入和/或缺失。DP-107的类似物描述于USP6,020,459和WO 96/40191。DP107多肽还可以在氨基末端或羧基末端包含修饰作用以提供例如提高的生物可利用率，稳定性，或降低的宿主免疫识别，如上文对于DP-178和USP 6,020,459和WO 96/40191中所述。来自其它病毒分离物或物种的或者来自其它生物体的DP-107类似物也是DP-107类似物，并且描述于USP 6,020,459和WO96/40191。
本发明中使用的DP-107多肽，不管是全长的，截短的，类似物(即，包含DP-107的插入，缺失，取代，或类似物)，或者另外修饰的，都表现出抗病毒活性，抗融合活性，或调节涉及螺旋肽结构的胞内进程的能力，并且具有与DP-107类似的结构和/或氨基酸基序，并且能够被USP 6,020,459中详细描述的ALLMOTI5，107X178X4和PLZIP检索基序鉴定或识别。多肽的制备通过本领域公知的技术能够合成或制备本发明中使用的多肽。参见，例如，Creighton，1983，蛋白质结构和分子原理(ProteinsStructures and Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，NY。例如，在固相载体上或者在溶液中可以合成短肽。较长的肽可以利用重组DNA技术制备。根据本领域公知的技术可以合成，和/或克隆，和表达编码本发明的肽的核苷酸序列。参见，例如，Sambrook，等，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Vols.1-3，冷泉港出版社，NY。
如上所述，用连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键的方式能够合成本发明中使用的多肽。通过本领域公知的常规反应，例如通过亚氨基，酯，酰肼，氨基脲，和偶氮键，能够形成非肽键。还可以合成氨基末端和/或羧基末端有另外的化学基团(即如上所述的修饰作用)的在本发明中使用的肽，以提高根据常规方法的多肽的稳定性，生物可利用度，和/或抑制活性。
用改变的空间构型也能合成本发明中使用的多肽，例如，使用多肽的氨基酸残基的一个或多个的D-异构体对L-异构体。如果期望，本发明中使用的多肽的一个或多个氨基酸残基能够被非天然存在的氨基酸残基取代。象这样的改变可以用来提高本发明肽的稳定性，生物可利用度和/或抑制作用。
USP 6,015,881中描述了本发明中使用的DP-178或DP-107多肽的具体合成方法，其利用固相和液相合成方法合成并化合具体的多肽片段基团，得到感兴趣的肽。一般情况下，这些方法包括在固相上合成具体的侧链被保护的肽片段中间体，在溶液中偶联被保护的片段，生成被保护的肽，接着将侧链去保护，得到最终多肽。另外的治疗物质的应用本发明的联合疗法进一步包括一种或多种，优选一种至三种另外的在抗-HIV治疗中使用的抗病毒剂。作用于病毒复制中涉及的不同的靶分子的，作用于病毒传播中涉及的不同的靶分子的，防止或减少病毒抗性发生的，并且作用于相同分子的不同位置的抗病毒剂可以和本发明的联合疗法一起使用。这类物质包括引起病毒逆转录酶的抑制作用，病毒mRNA封闭反应的抑制作用，HIV蛋白酶的抑制作用，蛋白糖基化作用的抑制作用，病毒融合的抑制作用的那些(例如，如上所述的DP-107)，和其它抗病毒药物，其中的一些在这里讨论，不局限在上述活性内。本领域技术人员能确定使用表现出这些活性模式之一的抗病毒剂的各种各样的抗病毒疗法。特别地，可以与本发明的组合一起使用已知为HAART的组合。优选地，在本发明的联合疗法中使用较低剂量的抗病毒剂，这样减小与那种物质相关的毒性，而不降低抗病毒活性，同时减小或避免病毒抗性。
这里使用的术语″核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂″(″NRTIs″)意思是抑制HIV-1逆转录酶的活性，催化病毒基因组向病毒原HIV-1 DNA转化的核苷和核苷酸和其类似物。核苷衍生物包括但不限于2′，3′-双脱氧腺苷(ddA)；2′，3′-双脱氧鸟苷(ddG)；2′，3′-双脱氧肌苷(dd1)；2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)；2′，3′-双脱氧胸苷(ddT)；2′，3′-双脱氧-双脱氧胸苷(d4T)和3′-叠氮基-2′，3′-双脱氧胸苷(AZT)。
或者，可以使用卤化核苷衍生物，优选2′，3′-双脱氧-2′-氟代核苷，例如，2′，3′-双脱氧-2′-氟代腺苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代肌苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代胸苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代胞苷；和2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢-2′-氟代核苷，包括但不限于2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢-2′-氟代胸苷(Fd4T)。优选地，本发明的2′，3′-双脱氧-2′-氟代核苷是其中氟键是β构型的那些，例如，2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代腺苷(F-ddA)，2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代肌苷(F-dd1)，和2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代胞苷(F-ddC)。
典型的合适的NRTIs包括从Glaxo-Wellcome Inc.，(ResearchTriangle，NC)购得的商品名是RETROVIR的叠氮胸苷(AZT)；从Bristol-Myers Squibb Co.(Princeton，NJ)购得的商品名是VIDEX的2′，3′-双脱氧肌苷(dd1)；从Roche Pharmaceuticals，(Nutley，NJ)购得的商品名是HIVID的2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)；从Bristol-MyersSquibb Co.购得的商品名是ZERIT的双脱氧胸苷(d4T)；从Glaxo-Wellcome购得的商品名是EPIVIR的lamivudine(3TC)；WO 96/30025中公开的以商品名ZIAGEN购得的abacavir(1592U89)；从GileadSciences(Foster City，CA)购得的商品名是PREVON的adefovirdipivoxil[bis(POM)-PMEA]；lobucavir(BMS-180194)，EP-0358154和EP-0736533中公开的Bristol-Myers Squibb，(Princeton，NJ)开发的一种核苷逆转录酶抑制剂；BCH-10652，Biochem Pharma，(Laval，魁北克，加拿大)开发的一种逆转录酶抑制剂(BCH-10618和BCH-10619外消旋混合物形式)；EmoryUniversity’s美国专利No.5,814,639许可并且由TrianglePharmaceuticals，(Durham，NC)开发的emitricitabine[(-)-FTC]；耶鲁大学对Vion Pharmaceutical，(New Haven CT)许可的β-L-FD4(也称为β-L-D4C并且名称是β-L-2′，3′-双脱氧-5-氟代胞苷)；DAPD，嘌呤核苷，EP 0656778公开的并且由Emory University和University of Georgia对Triangle Pharmaceutical许可的(-)-β-D-2，6-二氨基-嘌呤二氧戊环；和lodenosine(FddA)，9-(2，3-双脱氧-2-氟-b-D-苏-呋喃戊糖苷)腺嘌呤，NIH发现并且由U.S.Bioscience Inc.，(West Conshohoken，PA)开发的酸稳定性嘌呤为基础的逆转录酶抑制剂。
这里使用的术语″非-核苷逆转录酶抑制剂″(″NNRTI″s)意思是抑制HIV-1逆转录酶活性的非-核苷。典型的合适的NNRTIs包括从Roxane Laboratories(Columbus OH)生产商Boehringer Ingelheim购得的商品名是VIRAMUNE的nevirapine(BI-RG-587)；从Pharmacia& Upjohn Co.(Bridgewater NJ)购得的商品名是RESCRIPTOR的delaviradine(BHAP，U-90152)；WO94/03440公开的从DuPontPharmaceutical Co.(Wilmington DE)获得的商品名是SUSTIVA的efavirenz(DMP-266)，一种苯并嗪-2-酮；PNU142721，Pharmacia& Upjohn Co.开发的呋喃吡啶-硫代-嘧啶；AG-1549(以前称为Shionogi & num；S-1153)；WO 96/10019中公开的并且由AgouronPharmaceuticals，Inc.(LaJolla CA)临床开发的5-(3，5-二氯苯基)-硫代-4-异丙基-1-(4-吡啶基)甲基-1H-咪唑-2-基甲基碳酸酯；Mitsubishi Chemical Co.发现的并且由Triangle Pharmaceuticals开发的MKC-442(1-(乙氧基-甲基)-5-(1-甲基乙基)-6-(苯基甲基)-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)；和美国专利No.5,489,697公开的对Med Chem Research许可的(+)-calanolide A(NSC-675451)和B，香豆素衍生物，Vita-Invest将(+)calanolide A共同开发为口服给药产品。
术语″蛋白酶抑制剂″描述抑制HIV-1蛋白酶的抗病毒剂，而HIV-1蛋白酶是病毒多蛋白母体(例如，病毒GAG和GAG Pol多蛋白)蛋白水解裂解成感染HIV-1中发现的各种功能蛋白所必需的。Pis主要可以在病毒装配(即病毒发育)期间或之后工作，来抑制病毒体熟化成成熟感染状态。HIV蛋白酶抑制剂包括具有模拟肽结构，高分子量(7600道尔顿)和实际上肽特征的化合物，例如，CRIXIVAN(从Merck获得)和非肽蛋白酶抑制剂，例如，VIRACEPT(从Agouron获得)。
典型的合适的PIs包括从Roche Pharmaceuticals购得的商品名是INVIRASE的硬凝胶胶囊和商品名是FORTOVASE的软凝胶胶囊噻喹努佛(Ro 31-8959)；从Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)购得的商品名是NORVIR的ritonavir(ABT-538)；从Merck & Co.，Inc.，(West Point，PA)购得的商品名是CRIXIVAN的indinavir(MK-639)；从Agouron Pharmaceutical，Inc.购得的商品名是VIRACEPT的nelfnavir(AG-1343)；amprenavir(141W94)，商品名AGENERASE，一种Vertex Pharmaceuticals，Inc.，(Cambridge，MA)开发的并且从行使使用权程序的Glaxo-Wellcome获得的非肽蛋白酶抑制剂；从Bristol-Myers Squibb(Novartis发现的(CGP-61755)获得的lasinavir(BMS-234475)；DMP-450，一种Dupont发现的并且由Triangle Pharmaceuticals开发的环状脲；BMS-2322623，Bristol-Myers Squibb开发的作为第二代HIV-1PI的氮杂肽；Abbott开发的ABT-378；和AG-1549，Shionogi(Shionogi & num；S-1153)发现的Agouron Pharmaceuticals，Inc.开发的口服活性咪唑氨基甲酸酯。
本发明的联合疗法可以进一步与尿苷磷酸化酶抑制剂组合使用，所述尿苷磷酸化酶抑制剂是例如，无环尿苷(acyclouridine)化合物，包括苄基无环尿苷(BAU)，苄基氧基苄基无环尿苷(BBAU)，氨基甲基苄基无环鸟苷(AMBAU)，氨基甲基苄基氧基苄基无环鸟苷(AMB-BAU)，羟甲基苄基无环鸟苷(HMBAU)，和羟甲基苄基氧基苄基无环鸟苷(HMBBAU)；细胞因子或细胞因子抑制剂，例如，IL-2[PROLEUKIN(aldesleukin)，Chiron Corp.(Emeryville，CA)描述于EP-0142268，EP-0176299，RE 33653，USP 4530787，USP 4569790，USP4604377，USP 4748234，USP 4752585，和USP 4949314]，IL-12(WO96/25171中公开，Roche Pharmaceutical and American HomeProdocts，Madison，NJ)，IFN-α(INTRON-ASchering Plough)IFN-β和IFN-γ及其重组形式，TNF-α抑制剂，和MNX-160；干扰5′-mRNA进程的病毒封闭药物，例如，利巴韦林1-β-D-核糖呋喃糖苷-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺；描述于美国专利No.4,211,771 ICNPharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA；)；有抵抗各种脂质包被的病毒包括HIV活性的抗病毒剂，例如，两性霉素B(AmphotericinB)或者作为具有抗病毒(抗-HIV)活性的脂质结合分子的其甲基酯；糖蛋白处理的抑制剂，例如，粟精胺(Boehringer Mannheim)；羟基脲(Droxia；Bristol-Myers Squibb)，它是核糖核苷三磷酸还原酶的抑制剂，临床前研究表明对2′，3′-双脱氧肌苷有协同作用，并且可以和双脱氧胸苷一起使用；Yissum项目No.11607，它是Yissum ResearchDevelopment Co.(Jerusalem，Israel)临床前开发的以HIV-1Vif蛋白为基础的协同蛋白。
抗真菌剂和抗任意感染的其他药物，包括TB，HBV，EBV，和CMV，可以和本发明的联合疗法一起用于减轻和治疗与HIV-感染的免疫抑制患者相关的疾病。
本发明的联合疗法中使用的优选的另外的治疗剂包括dd1，DP-107，3TC，利巴韦林，和IFN-β。
抗病毒活性测试HIV感染(急性，共培养，和慢性)的不同阶段化合物(抗病毒活性研究的体外测试是本领域公知的，例如，参见Lambert等，抗病毒研究(Antiviral Res.)21327-342，(1993)。利用这些测试来评价本发明的联合疗法，如果期望，还有另外的治疗剂，的效果。利用体外测试，例如如下所述，能测定本发明的联合疗法中使用的抗病毒剂表现出的抗病毒活性，该项测试测定DP-178多肽抑制合胞体syncytia)形成或抑制无细胞病毒感染的能力，和/或测定CCR5抑制活性和本发明中使用的CCR5拮抗剂化合物的拮抗活性。应用这些测试，象肽的相对抗病毒活性这样的参数表现出抗给定病毒株和/或能测定肽的毒株特异性抑制活性。
此外，通过Chou和alalay的多药物分析方法(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55)和使用微机软件的剂量-效果分析(Chou和Chou，1987，Software and Manual.p.19-64Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)能测定本发明联合疗法的效力。通过MacSynergy计算机程序(Pritchard和Shipman，1990，抗病毒研究(Antiviral Research)14181-206)能计算本发明的联合疗法中使用的抗病毒剂之间的药物-药物相互作用分析，包括协同作用和拮抗作用。
本发明的CCR5拮抗剂化合物抑制RANTES(″调节激活作用，正常T细胞表达分泌″，其是CCR5的天然配体)结合，活性(Ki)是大约0.1至2000nM，优选0.1至1000nM，更优选大约0.1至500nM，最优选大约0.1至100nM。
CCR5膜结合测试应用CCR5膜结合测试的高通量筛选鉴定RANTES结合的抑制剂。该项测试使用从表达具有结合RANTES能力的人CCR5趋化因子受体的NIH 3T3细胞制备的膜。使用96-孔平板形式，化合物存在或不存在下膜制剂与125I-RANTES温育1小时。以0.001微克/毫升至1微克/毫升范围系列稀释化合物，并且三次测试。通过玻璃纤维过滤器收集反应混合物，并且充分洗涤。对复制总量取平均值，并且以抑制总125I-RANTES结合的50％所需要的浓度报道数据。在第二个以细胞为基础的HIV-1入侵和重复测试中进一步表征膜结合测试中具有有效活性的化合物。
HIV-1入侵测试通过编码HIV-1的NL4-3毒株的质粒(已经通过包膜基因突变而修饰并且导入荧光素酶报道基因质粒)和编码几种HIV-1包膜基因之一的质粒共转染产生复制缺陷HIV-1报道病毒体，如Connor等，病毒学(Virology)206935-944(1995)所述。通过磷酸钙沉淀转染两种质粒之后，在第三天收集病毒上清液并且测定病毒功能效价。然后使用这些原液感染稳定表达CD4和趋化因子受体CCR5的U87细胞，它与或不与试验化合物预先温育。37℃下进行感染2小时，冲洗细胞并且用含有CCR5拮抗剂化合物的新鲜培养基置换培养基。将细胞温育3天，溶解并且测定荧光素酶活性。以抑制对照培养物中荧光素酶活性的50％所需要的化合物浓度表示结果。
HIV-1复制试验该项试验使用原始外周血单核细胞或稳定的U87-CCR5细胞系来测定本发明联合疗法中使用的抗病毒剂阻断原发HIV-1毒株感染的效果。从正常健康供者纯化原始淋巴细胞，并且在感染之前用PHA和IL-2体外刺激三天。使用96-孔平板形式，37℃下用药物将细胞预处理1小时，并且接着用亲-M HIV-1分离物感染。感染之后，洗涤细胞，去除残留的接种物并且在化合物存在下培养4天。收集培养上清液，并且通过测定病毒p24抗原浓度测定病毒复制。
钙流出分析在加入化合物和天然CCR5配体(RANTES)之前对表达HIV辅助受体CCR5的细胞加载钙敏感染料。具有激动性质的化合物将诱导细胞中钙流出信号，而CCR5拮抗剂被鉴定为其本身不诱导信号的化合物，但是天然配体RANTES能阻断信号传导。
GTPγS结合测试(第二膜结合测试)GTPγS结合测试测定CCR5配体的受体激活作用。该项测试测定35S标记的-GTP和与G-蛋白偶联的受体的结合，其发生是合适的配体的受体激活作用的结果。在该项测试中，CCR5配体RANTES与来自CCR5表达细胞的膜温育，并且通过检测结合的35S标记来自测定对受体的结合(或激活作用)。如果化合物通过诱导受体的激活作用而表现出激动性质或者通过测定竞争或非竞争方式中RANTES结合的抑制作用而表现出拮抗剂性质，则该项测试是定量进行的。
趋化性分析趋化性分析是一项功能测试，其表征试验CCR5拮抗剂化合物的激动性质对拮抗性质。该项测试测定没有附着的表达人CCR5(BaF-550)的鼠细胞系响应试验化合物或天然配体(即，RANTES，MIP-1β)迁移过膜的能力。细胞迁移过可渗透膜朝着具有激动活性的化合物。是拮抗剂的化合物不能诱导趋化性但是能抑制响应已知的CCR5配体的细胞迁移。
细胞融合试验用于检测细胞融合作用的试验是本领域公知的，并且能用来测定DP-178多肽和/或CCR5拮抗剂抑制膜融合或病毒-诱导的合胞体。一般通过培养不存在任何处理下一般会经历可观察水平的合胞体形成的细胞体外进行细胞融合分析。例如，在诱导细胞融合的病毒(例如HIV)慢性感染的细胞的存在下或者在要分析的多肽的存在或不存在下，温育未感染的细胞(例如，CD4+细胞，例如Molt或MEM细胞)。温育(例如37℃下温育24小时)之后，用显微镜对细胞培养物检查多核巨细胞的存在，这是细胞融合和合胞体形成的指征。可以使用公知的染料，例如结晶紫染料，以有利于合胞体形成的观察。
药物组合物，剂量和给药方案因为DP-178的作用位点在病毒的表面，并且阻止自由病毒感染宿主细胞以及病毒在细胞和细胞间传播，和阻断宿主细胞受体和HIV的CCR5拮抗剂化合物联合使用DP178，提供能提供加和或协同作用的作用机理的不同的治疗靶物。优选地，用较低浓度的抗病毒剂使用本发明的联合疗法，产生降低的毒性。因此，本发明的联合疗法不仅可以减小抗病毒活性所需要的药物的有效剂量，从而降低其毒性，而且作为通过多种机理攻击病毒的结果，还可以提高绝对抗病毒作用。本发明的联合疗法还提供用于避免或减少产生病毒抗性机会的方法。
“联合”给与DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物，和CCR5拮抗剂化合物，或者其药学可接受盐，包括这样的方法，其中两种药物一起作为混合物给药(单一剂量形式)，还有这样的方法，其中两者药物分开但是同时给药，例如，通过分开的静脉内途径或口服和静脉内给药。
″联合″给药进一步包括分开给药顺序给与DP-178多肽和CCR5拮抗剂化合物，使得首先给与药物的一种，接着给与第二种，例如，作为循环治疗(即，一段时间给与第一种抗病毒化合物，接着一段时间给与第二种抗病毒剂，并且重复这种顺序给药以减少发生对化合物之一的抗药性)。
使用实现它们想要目的的治疗有效量的抗病毒剂和合适的药学载体配制适合在本发明中使用的药物组合物。对于所有的这样的目的，通过临床医生对患者状况的观察能选择精确配方，给药途径和剂量(参见，例如，Fingl等，1975，治疗的药学基础(″The PharmacologicalBasis of Therapeutics″)，第一章)。
配制和给药方法可以参见“Remington’s制药科学”(″Remington’sPharmaceutical Sciences″)，第18版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA。因此根据本发明使用的药物组合物可以以常规方法配制，使用一种或多种生理可接受载体，包括能在药物中使用的有利于将活性化合物加工成制剂的赋形剂和辅助剂。合适的配方取决于选择的给药途径。给药途径包括口服，直肠，透粘膜，肠内，肠胃外，肌内，皮下，髓内，鞘内，直接心室内，静脉内(即，注射或连续输注)，腹膜内，鼻内，吸入，眼内，经皮，局部，阴道等等。
本发明联合疗法中使用的药物制剂优选是单位剂量形式。在这样的形式中，制剂被分为含有合适量的抗病毒剂的合适大小的单位剂量。要给与的本发明肽的有效剂量可以通过本领域技术人员公知的程序确定，寻求象生物半寿期，生物可利用度，和毒性这样的参数。
剂量形式包括但不限于片剂，分散体，粉末剂，悬浮剂，栓剂，溶液，乳状液，胶囊，糖衣药丸，气雾剂，植入物，乳膏，贴剂，小唧筒等。最优选地，静脉内给药DP-178多肽。最优选地，口服给与CCR5拮抗剂化合物。
CCR5拮抗剂或者其衍生物在单位剂量制剂中的量，特别是对于口服给药，可以从大约10毫克至大约500毫克变化。CCR5拮抗剂的实际剂量可以根据象患者的年龄，症状和体重，要治疗的症状的严重程度，HIV分离物的类型而变化，这是本领域技术人员能确定的。根据需要，在给药的一天中，可以将总的日剂量分开并且分次给药。一般推荐的总日剂量给药方案范围是每天给药大约20毫克至大约800毫克，优选25毫克至600毫克，更优选大约50毫克至400毫克，最优选100毫克至200毫克。
在本发明的联合疗法中，可以每天一次或者不到每天一次的频率，例如每周两次至四次或者隔天一次，给与治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其衍生物。剂量也可以分为两剂至四剂，或者可以提供一次剂量。优选地，每天口服，每天两次(bid)口服治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其衍生物。医生可以确定本发明联合疗法的效力使得减少CCR5拮抗剂给药次数，例如一天一次或更少，例如每周1-3次或者隔天一次。
以单位剂量制剂施用的DP-178多肽，或其药学可接受衍生物的量，可以肠胃外给药，例如，作为连续灌注或注射。DP-178多肽的剂量范围是3毫克至200毫克(或者其将病毒载量减小1-2个对数的倍数)，优选7毫克至100毫克，更优选20毫克至35毫克，每天给药。本发明的一个优点在于可以比每天两次(bid)更少地给与多肽，从前对于临床试验中使用T-20有报道。因此，本发明的联合疗法允许每天一次(qid)给与治疗有效量的DP178多肽，优选每周一次(qd)两次至四次，更优选隔天一次(qd)。
根据包装说明中核准的剂量和给药方案或者特定物质记录中提出的核准的剂量和给药方案，考虑患者的年龄，性别和状况，要治疗的症状的严重程度和HIV分离物，临床医生能确定与本发明疗法联合使用的NRTIs，NNRTIs，PIs和其它治疗剂的剂量和给药方案。
典型的合适的多药物联合疗法例如(i)选自两种NRTIs，一种PI，第二种PI，和一种NNRTI的至少三种抗HIV-1药物；和(ii)至少两种选自NNRTts和PIs的抗病毒剂。典型的合适的HAART-多药物联合疗法包括(a)三联联合治疗，例如两种NRTIs和一种PI；或(b)两种NRT1s和一种NNRTI；和(c)四联联合治疗，例如两种NRTIs，一种PI和第二种PI或一种NNRTI。
这些多药物联合可以与CCR5拮抗剂和DP-178多肽，或它们的药学可接受盐/衍生物联合使用。
在对单纯性患者的治疗中，优选使用CCR5拮抗剂和DP-178多肽，或它们的药学可接受盐/衍生物的三联多药物联合疗法开始抗-HIV-1治疗；使用两种NRTIs和一种PI是优选的，除非对PIs有不耐药性。药物顺应性是必需的。应该每3-6个月监测CD4+和HIV-1-RNA血浆水平。应该使病毒载量水平趋稳，可以加入另外一种药物，例如，一种PI或一种NNRTI。下表中进一步描述与本发明联合使用的典型的疗法抗病毒多药物联合疗法A.三联联合疗法1.两种NRTIs1+一种PI2，2.两种NRTIs1+一种NNRTI3B.四联联合疗法4两种NRTIs+一种PI+第二种PI或一种NNRTIC.替代方案5两种NRTI1一种NRTI5+一种PI2
两种PIs6+一种NRTI7或NNRTI3一种PI2+一种NRTI7+一种NNRTI3表中脚注1.下面中的一种叠氮胸苷+lamivudine；叠氮胸苷+双脱氧腺苷；stavudine+lamivudine；stavudine+双脱氧腺苷；叠氮胸苷+扎西他宾。
2.Indinavir，nelfinavir，ritonavir或噻喹努佛软凝胶胶囊。
3.Nevirapine或delavirdine。
4.参见Vandamne等，抗病毒化学和化学疗法(Antiviral Chemistry& Chemotherapy)9193-197(1998)。
5.对由于顺应性问题或毒性而不能采用推荐的给药方案的患者，以及对推荐的给药方案失败或复发的那些患者的替代给药方案。两种核苷联合可以导致HIV-抗性，并且对很多患者临床失败。
6.用噻喹努佛和ritonavir(各400mg bid)获得大多数数据。
7.叠氮胸苷，stavudine或双脱氧腺苷。
权利要求
1.一种对需要这样的治疗的个体治疗HIV感染的方法，包括联合施用治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐，和治疗有效量的DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物。
2.权利要求1的方法，其中CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐的剂量是25至600毫克，并且DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物的剂量是3至200毫克，或者将个体病毒载量减小1-2个对数的其倍数。
3.权利要求1的方法，其中给药的每一天给与1或2次CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐。
4.权利要求1的方法，其中每周1-3次或者隔天一次给与CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐。
5.权利要求1的方法，其中每周1-3次或者隔天一次给与DP-178多肽。
6.权利要求1的方法，其中每周3次或者隔天一次给与DP-178多肽。
7.权利要求1的方法，其中口服给与CCR5拮抗剂。
8.权利要求1的方法，其中皮下给与DP-178多肽。
9.权利要求1的方法，其中所述CCR5拮抗剂是选自下面的化合物 和
10.权利要求1的方法，其中所述DP-178多肽由表3中的氨基酸序列组成。
11.权利要求1的方法，进一步包括联合给与用于治疗HIV的一种或多种抗病毒剂或治疗剂。
12.权利要求11的方法，其中所述抗病毒剂选自核苷逆转录酶抑制剂，非-核苷逆转录酶抑制剂，和蛋白酶抑制剂。
13.权利要求11的方法，其中所述抗病毒剂选自DP-107多肽，叠氮胸苷，lamivudine，扎西他宾，双脱氧腺苷，stavudine，abacavir，adefovir dipivoxil，lobucavir，BCH-10652，emitricitabine，β-LFD4，DAPD，lodenosine，奈韦拉平，delaviridine，efavirenz，PNU-142721，AG-1549，MKC-442，(+)-calanolide A和B，噻喹努佛，indinavir，ritonavir，nelfinavir，lasinavir，DMP-450，BMS-2322623，ABT-378，amprenavir，羟基脲，利巴韦林，IL-2，IL-12，Yissum No.11607和AG-1549。
14.一种对需要这样的治疗的个体治疗HIV感染的方法，包括每天一至两次口服施用25至400毫克/天的下面结构式的CCR5拮抗剂， 或者其药学可接受盐，并且每周一次，两次，三次或四次皮下给与3至200毫克，或者将个体病毒载量减小1-2个对数的其倍数的T-20。
15.权利要求14的方法，进一步包括联合给与用于治疗HIV的一种或多种抗病毒剂或治疗剂。
16.权利要求15的方法，其中所述抗病毒剂选自核苷逆转录酶抑制剂，非-核苷逆转录酶抑制剂，和蛋白酶抑制剂。
17.权利要求15的方法，其中所述抗病毒剂选自DP-107多肽，叠氮胸苷，lamivudine，扎西他宾，双脱氧腺苷，stavudine，abacavir，adefovir dipivoxil，lobucavir，BCH-10652，emitricitabine，β-LFD4，DAPD，lodenosine，奈韦拉平，delaviridine，efavirenz，PNU-142721，AG-1549，MKC-442，(+)-calanolide A和B，噻喹努佛，indinavir，ritonavir，nelfinavir，lasinavir，DMP-450，BMS-2322623，ABT-378，amprenavir，羟基脲，利巴韦林，IL-2，IL-12，Yissum No.11607和AG-1549。
18.一种包括用于联合治疗HIV感染的单一包装药物组合物的试剂盒，其包括在第一容器中含有在药学可接受载体中含有CCR5拮抗剂或其药学可接受盐的药物组合物，每周1-3次或隔天一次给药的口服剂量是25-600毫克，和在第二容器中含有药学可接受载体中含有DP-178多肽或其药学可接受衍生物的药物组合物，以3-200毫克的皮下剂量，或将病毒载量减小1或2个对数的其倍数。
19.权利要求18的试剂盒，其包括在附加的容器中含有包括用于治疗HIV的药学可接受载体中的治疗有效量抗病毒剂或治疗剂的一种或多种药物组合物。
全文摘要
本发明提供用于治疗HIV的新的联合疗法，包括CCR5拮抗剂或其药学可接受盐，和DP－178多肽或其药学可接受衍生物。本发明联合疗法通过将DP－178多肽给药频率从每日皮下两次减少至每天一次或者只是每周几次而提供更耐受的治疗方案。
文档编号A61K38/00GK1481251SQ01820919
公开日2004年3月10日 申请日期2001年12月17日 优先权日2000年12月19日
发明者B·M·巴鲁迪, B M 巴鲁迪 申请人:先灵公司
技术领域：
本发明涉及治疗病毒感染，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的联合疗法和方法。
背景技术：
毫无疑问获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致因物HIV引起全球性健康危机，虽然近年来在药物治疗方面的进展成功证明AIDS的进程，但是仍然存在对发现一种更安全更便宜的控制这种病毒的方法的需求。
HIV感染是通过病毒与靶细胞膜接触通过与细胞受体CD4和第二趋化因子辅助受体分子的相互作用而开始的。其通过被感染细胞通过血液和其它组织的复制和传播而发展。有各种各样的趋化因子，但是对于亲巨噬细胞HIV，相信作为感染早期体内复制的关键病原毒株，HIV进入细胞所需要的主要趋化因子受体是CCR5。还有人报道过CCR5基因在抵抗HIV感染中起作用，因为具有CCR5基因同型缺失的个体对HIV感染的抵抗力非常强。因此，干扰病毒受体CCR5和HIV之间的相互作用可以阻断病毒进入细胞而没有任何显著的副作用。
人们还注意到HIV-1包膜蛋白，例如，gp160，gp120和gp41，它们是AIDS患者体内存在的抗-HIV抗体的主要抗原。美国专利No.5,464,933和6,020,459和国际专利公开WO 96/40191描述了H1Vgp41蛋白质的一部分(已知为DP-178，T-20，和pentafuside)，它是病毒获许进入CD4+细胞所必需的。该蛋白质片段可以阻止HIV获许进入宿主CD4+细胞，并且还防治病毒的细胞与细胞间传递。
有人将T-20以连续输液或者一天两次(bid)皮下给药，一般剂量是100毫克/天。这使得接受这种肽治疗的患者生活大大不方便，因为接受这种抗-HIV治疗的患者必须一天两次到医生那里接受肽注射。
Vandamme等[抗病毒化学和化疗(Antiviral Chemistry&Chemotherapy)9187-203(1998)]公开了当前对人HIV-1感染的临床治疗方法，包括至少三种药物联合或者称为高活性抗逆转录病毒疗法(″HART″)；HAART包括核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和HIV蛋白酶抑制剂的各种组合。适用于单纯药物的患者，HAART在降低死亡率和HIV-1发展成AIDS中是有效的。但是，这些多种药物治疗方案不会消除HIV-1，并且长期治疗通常导致广谱抗药性。此外，NIV疗法昂贵，每年花费上万美元。提供通过不同的机理阻断HIV融合并进入CD4+细胞之中，有更方便的给药方案，并且与已知的治疗方法相比抗HIV更有效，花费更低的抗-HIV治疗方法是有益的。因此，保持优先的是开发提供更好的HIV-1治疗的新的药物疗法。
发明概述本发明提供改进的治疗病毒感染特别是HIV感染的方法。提供新的药物联合治疗法，包括有效量的第一种抗病毒剂，它是一种结构式I或II的哌啶衍生物或者其药学可接受盐，和有效量的第二种抗病毒剂，它是一种DP-178多肽或者其药学可接受衍生物。应用适合抑制病毒活性，病毒表达，病毒传播，或者减少病毒负载的剂量和给药方案对感染病毒优选HIV的个体施用本发明的组合。本发明的联合疗法优选提供与其它已知的抗-HIV联合疗法或者只含有本发明组合中存在的抗病毒剂中的一种的疗法相比具有改进的功效的疗法。更优选地，本发明的联合疗法是一种协同组合。
本发明的一个优点是本发明的联合治疗使得临床医生减少DP-178多肽给药频率(即，比每天两次少)，并且，如果期望，如下所述与一种或多种另外的治疗化合物联合给药。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗HIV感染的方法，包括联合给与治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐，和治疗有效量的DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗HIV感染的方法，包括施用下面结构式的CCR5拮抗剂 或者其药学可接受盐，和T-20，其中以25-400毫克/天的日剂量每天1-2次给与CCR5拮抗剂，并且以3-200毫克的剂量或者以将受感染个体的病毒负载量减小1或2个对数的其倍数每隔一天一次(qd)或者每周一次(qd)两次，三次或四次给与T-20。
另一方面，本发明提供用于联合治疗HIV感染的单一包装药物组合物的试剂盒，其包括在第一容器中含有在药学可接受载体中含有CCR5拮抗剂或其药学可接受盐的药物组合物，每周1-3次或隔天一次给药的口服剂量是25-600毫克，和在第二容器中含有药学可接受载体中含有DP-178多肽或其药学可接受衍生物的药物组合物，以3-200毫克的皮下剂量，或将病毒载量减小1或2个对数的其倍数。
本发明的详细描述使用术语″病毒感染″来描述一种疾病状态，其可能是潜伏的，病毒侵入细胞，利用细胞的复制机器繁殖或复制，最终溶解细胞引起细胞死亡，并且产生后代病毒颗粒，接着通过繁殖进一步感染其它细胞。
与病毒感染相关使用的术语″治疗″或″预防″意思是抑制病毒活性，表达，病毒的复制或传播，或者防止病毒在宿主细胞中自我繁殖，这些导致病毒感染引起的疾病综合症的改善或减轻。如果有病毒载量的减少或死亡率或发病率降低，则认为处理或疗法是治疗性的。
DP-178多肽或CCR5拮抗剂化合物，或者它们的衍生物的“治疗有效量”是根据合适的给药方案足以治疗或预防病毒感染的量，即，量和给药方案表现出抗病毒活性，从而将受感染个体血清中HIV RNA血浆水平降低至每毫升血清少于500个拷贝，优选至每毫升血清少于200个拷贝，更优选至每毫升血清少于50个拷贝，最优选拷贝数是根据定量多循环逆转录酶PCR方法测定检测不到的。优选使用Amplicor-1Monitor 1.5(从Roche Diagnsotics获得)或Nuclisens HIV-1 QT-1方法测定HIV RNA。
术语″联合疗法″指治疗病毒感染优选HIV感染的疗法，其包括施用有效量的CCR5拮抗剂和DP-178多肽。本发明的联合疗法可以包括一种或多种抗病毒剂，例如，HAART。另外，本发明的联合疗法可以被用作以前未感染个体在可能严重接触HIV病毒之后的预防措施。肽的这种预防性应用的例子包括但不限于预防病毒从母体传播给婴儿和存在HIV传播可能的其它环境，象，例如，工作人员暴露给含有HIV的血产品下健康护理环境中的偶发事件。
术语″协同″指比任何两种或多种单一物质的加和效果更有效的组合。″协同作用″指在治疗或预防病毒感染的单一疗法中使用更低量或剂量的抗病毒剂的能力。更低剂量一般导致毒性降低而功效不降低。另外，协同作用能够提高功效，例如，提高的抗病毒活性，或者避免或降低抵抗抗病毒剂的任何病毒抗性的程度。用常规的抗病毒测试方法，例如如下所述，能够测定DP-178多肽或者其药学可接受衍生物，和CCR5拮抗剂或者其药学可接受盐之间的协同作用。利用获得联合系数(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55)和使用计算机软件的剂量效果分析(Chou和Chou，1987，Software andManual.p19-64.Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)的Chou和Talalay联合方法能够分析测试的结果。联合系数值小于1表明协同作用，大于1表明拮抗作用，等于1表明加和作用。利用Pritchard和Shipman的方法(Pritchard和Shipman，1990，抗病毒研究(Antiviral Research)14181206)也能分析这些测试的结果。
术语″药学可接受载体″指不干扰活性成分的生物活性的效力，是化学惰性的并且一般对受体无毒的载体介质。
术语″药学可接受衍生物″指表现出抗病毒活性并且一般是无毒的多肽的截短物，类似物或其它修饰。
术语″抗病毒活性″指HIV向未感染CD4+细胞传递的抑制作用，HIV复制的抑制作用，防止HIV在宿主中自我繁殖，或者改善或减轻HIV感染引起的疾病症状。通过下文所述测试中病毒载量的减少或死亡率和/或发病率的降低能证实这些作用。抗病毒剂，或抗-HIV-1药物，具有抗病毒活性，并且用于治疗单纯HIV-1感染，或者作为多种药物联合治疗例如，HAART三联和四联联合治疗的部分。
″治疗剂″是改善对病毒感染或者病毒感染引起的疾病的治疗的任何分子，化合物或疗法。优选地，所述治疗剂具有抗病毒活性。
其传播可以被本发明联合疗法的抗病毒活性抑制的病毒包括，例如人逆转录病毒，特别是HIV-1和HIV-2和人T-淋巴细胞病毒(HTLV-I和II)；非人逆转录病毒，包括牛造白血病组织增生病毒，猫科动物病毒和白血病病毒，和羊进行性肺炎病毒；非逆转录病毒，包括人呼吸合胞体病毒，犬科温热兽病病毒，新城疫病毒，人副流感病毒，流感病毒，麻疹病毒，埃-巴二氏病毒，乙肝病毒，和猿Mason-Pfizer病毒；和没有包膜病毒，包括细小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒，甲肝病毒，肠道病毒，艾可病毒和柯萨奇病毒，乳多空病毒例如乳头状瘤病毒，细小病毒，腺病毒和呼肠病毒。
哌啶衍生物CCR5拮抗剂化合物具有下面结构式I和II的化合物，和其药学可接受盐，这里通称为″CCR5拮抗剂″。这些化合物对抗CC5趋化因子受体，并且描述于美国专利申请顺序号Nos.09/562,815和09/562,814和WO 00/66559和WO 00/11632中，这些专利文献在此分别全文引作参考。
在一个实施方案中，本发明的联合疗法包括结构式I的化合物，或者其药学可接受盐 其中R6，X和R2如表1中定义表1 在一个具体的实施方案中，本发明的联合疗法包括下面结构式的化合物 或者其药学可接受盐。
在另一个实施方案中，本发明的联合疗法中使用的CCR5拮抗剂化合物具有结构式II，或者其药学可接受盐 其中R，R3，R6和R2如表2中定义表2 在一个具体的实施方案中，本发明的联合疗法包括下面结构式的化合物 或者其药学可接受盐。
本发明中使用的一些CCR5拮抗剂化合物可以以不同的异构体形式存在，例如，对映异构体，非对映异构体和阻转异构体。本发明包括纯形式和混合物的所有这样的异构体，包括外消旋混合物。
一些化合物在自然状态下是酸性的，例如，带有羧基或酚羟基的化合物。这些化合物可以形成药学可接受盐。这样的盐的例子包括钠盐，钾盐，钙盐，铝盐，金盐和银盐。还包括与药学可接受胺例如氨，烷基胺，羟基烷基胺，N-甲基葡糖胺等形成的盐。
一些碱性化合物也形成药学可接受盐，例如，酸加成盐。例如，吡啶并-氮原子可以和强酸形成盐，而带有碱性取代基例如氨基的化合物也和弱酸形成盐。用于生成盐的合适的酸的例子是盐酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，苹果酸，富马酸，琥珀酸，抗坏血酸，马来酸，甲磺酸和本领域技术人员公知的其它无机酸和羧酸。通过使游离碱形式以常规方式接触足够量的期望的酸产生盐来制备盐。通过用合适的碱稀水溶液例如NaOH，碳酸钾，氨和碳酸氢钠稀水溶液处理盐可以再生游离碱形式。游离碱形式与它们的各种盐在一些物质性质上多少有些不同，例如在极性溶剂中的溶解度，另外，就本发明目的来说，酸和碱盐等价于它们各自的游离碱形式。
所有的这样的酸和碱盐是本发明范围内的药学可接受盐，并且认为所有的酸和碱盐就本发明目的来说等价于相应化合物的游离形式。
根据本领域公知的方法能够制备本发明中使用的CCR5拮抗剂化合物，例如，应用USP 5,883,096，USP 6,037,352，USP 5,889,006，USP5,952,349，和USP 5,977,138中描述的方法，这些专利文献在此全文引作参考。美国专利申请No.09/562,815和09/562,814和WO00/66559和WO 00/11632提供了制备在本发明中使用的CCR5拮抗剂的具体方法。
DP-178多肽DP-178多肽(即，全长DP-178和其药学可接受衍生物)描述于USP5,464,933，USP 6,020,459和WO 96/40191，这些专利文献各自在此全文引作参考。通过和病毒与靶细胞融合所必需的gp41上的远侧区(可能是DP-107)形成复合体，病毒gp41的DP-178区可以介导HIV和靶细胞膜的融合。本发明中使用的DP-178多肽表现出抗融合活性，(抑制病毒与宿主细胞膜融合)抗病毒活性，和/或调节涉及螺旋肽结构的胞内进程的能力，并且被USP 6,020,459中描述的ALLMOTI5，107X178X4和PLZIP检索主题鉴定或识别。
全长DP-178多肽以分离的来自HIV-1LAI的跨膜蛋白gp41的跨越残基638-673的36个氨基酸残基为基础，并且具有氨基酸序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(T-20；SEQ ID NO1)。
本发明中使用的DP-178多肽的类似物在全长DP-178多肽中包含一个或多个氨基酸取代(保守的或不保守的)，插入和/或缺失。来自其它病毒分离物或物种，或者来自其它生物体的DP-178类似物也是DP-178的类似物。除了全长DP-178多肽(SEQ ID NO1)之外，本发明中使用的DP-178多肽包括包括3-35个连续的氨基酸残基的全长DP-178的截短物。DP-178类似物也可以是截短的。USP 5,464,933，USP6,020,459，和WO 96/40191中描述了DP-178的截短物和类似物。
本发明中使用的DP-178多肽中氨基酸取代作用可以是保守的或不保守的取代作用。保守的氨基酸取代作用置换DP-178多肽序列中的一个或多个氨基酸，所述氨基酸有相似电荷，大小，和/或疏水性特征，象，例如，谷氨酸(E)与天冬氨酸(D)。非保守取代作用置换DP-178多肽序列中的一个或多个氨基酸，所述氨基酸有不同的电荷，大小，和/或疏水性特征，象，例如，谷氨酸(E)与缬氨酸(V)。
HIV-1和HIV-2包膜蛋白结构上不同，但是HIV-1和HIV-2的DP178-相应区中存在惊人的氨基酸保守性。氨基酸保守性是一种周期性性质，提示结构和/或功能的某些保守性。因此，一类氨基酸取代作用包括预计稳定本发明DP-178肽的结构的氨基酸改变。利用这里描述的和USP 6,020,459中描述的DP-178全长和DP178类似物序列，本领域技术人员能容易地确定DP-178共有序列，并且确定代表优选的氨基酸取代作用的保守氨基酸残基。
本发明中使用的DP-178多肽中氨基酸插入包括一个或多个单个氨基酸残基或一段残基插入DP178多肽中。DP-178多肽的氨基或羧基末端或者在多肽的中间位置可以有一处或多处插入。优选地，内部插入长度是2-15个氨基酸。优选地，氨基或羧基末端插入是大约2至大约50个氨基酸并且相应于是全长DP-178氨基酸序列的氨基或羧基的gp41的多肽序列。
本发明中使用的DP-178多肽可以包含一处或多处缺失。DP-178多肽中的缺失可以是去除一个或多个单一的氨基酸残基或一个或多个连续的氨基酸段，和它们的组合。包含缺失的DP-178多肽有至少4-6个氨基酸。
本发明中使用的DP-178多肽类似物是来自除HIV-1LAI之外的来源例如其它HIV-1和HIV-2分离物，非-HIV-1LAI有包膜病毒，没有包膜病毒和非病毒生物体的全长或截短DP-178。DP-178类似物也能包含如上所述的一个或多个缺失，插入或取代。DP-178类似物可以包括，例如，有包膜病毒的跨膜蛋白中存在的肽序列或者没有包膜病毒和非病毒生物体中存在的多肽序列。USP 5,464,933，USP 6,020,459，和WO 96/40191中描述了DP-178类似物，并且包括YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(DP-185；SEQ ID NO3)；YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF(SEQ ID NO4)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO5)；和LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL(SEQ ID NO6)，它们分别从HIV-1SF2，HIV-1RF，HIV-1MN，和HIV-2NIHZ分离物衍生。
本发明中使用的DP-178多肽可以存在对氨基和/或羧基末端的修饰作用，提供，例如，提高的生物可利用率，稳定性，或者降低的宿主免疫识别。例如，末端NH2基团可以被疏水性基团，羧苄基，丹酰，或叔丁氧羰基，乙酰基，或者9-芴基甲氧-羰基(FMOC)置换。大分子基团，例如，脂质-脂肪酸偶合物，聚乙二醇，碳水化合物或肽基，能够与NH2或者与修饰物共价连接。例如酰氨基，叔丁氧羰基，或共价连接的大分子基团，例如，脂质-脂肪酸偶合物，聚乙二醇，碳水化合物或另外一个多肽基团可以置换末端COOH基团。大分子基团可以与COOH或修饰物连接。
下表提供了可以在本发明中使用的DP-178多肽的例子表3YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO1)；YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(DP-185；SEQ ID NO3)；YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF(SEQ ID NO4)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO5)；LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL(SEQ ID NO6)；CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO7)；WMEWDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO8)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWLIKFI(SEQ IDNO9)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF(SEQ ID NO10)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANWF(SEQ ID NO11)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO12)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF(SEQ ID NO13)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF(SEQ ID NO14)；YTSLIHSLQEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO15)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO16)；YTSLIHSLIEQSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO17)；YTSLIHSLIQESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO18)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO19)；YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO20)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF(SEQ ID NO21)；YTSLIHSLIEESQNLQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO22)；YTSLIHSLIEESQNQQEKLEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO23)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEFDKWASLWNWF(SEQ ID NO24)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASPWNWF(SEQ ID NO25)；YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNSF(SEQ ID NO26)；NKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKASLWNW F(SEQ ID NO27)；SLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO28)；LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQE(SEQ ID NO29)；EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO30)；QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN(SEQ ID NO31)；IWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE(SEQ ID NO32)；WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ(SEQ ID NO33)；NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE(SEQ ID NO34)；NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL(SEQ ID NO35)；MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ IDNO36)；TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO37)；WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL(SEQ ID NO38)；WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE(SEQ ID NO39)；MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD(SEQ ID NO40)；EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK(SEQ ID NO41)；WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW(SEQ ID NO42)；DREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA(SEQ ID NO43)；REINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS(SEQ ID NO44)；EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL(SEQ ID NO45)；INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW(SEQ ID NO46)；NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO47)；TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN(SEQ ID NO48)；SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI(SEQ ID NO49)；LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT(SEQ ID NO50)；TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO51)；LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO52)；ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO53)；NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO54)；EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO55)；LRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAV(SEQ ID NO56)；YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO57)；NNLLRAIEAQQGLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO58)；NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQGGC(SEQ ID NO59)；NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQGGC(SEQ ID NO60)；CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYKDQGGC(SEQ ID NO61)；和LSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV(SEQ ID NO62)。
DP-107肽任意地，DP-178多肽可以和DP-107多肽使用，这描述于USP6,020,459和WO 96/40191。因为跨膜蛋白gp41的DP-107和DP178部分形成正常病毒感染所必需的非共价的蛋白质-蛋白质相互作用，DP178和DP-107肽的化合可以与病毒gp41形成复合体，并且干扰融合过程。因此，可以预期在本发明的联合疗法中使用DP-107多肽。
全长DP-107多肽是相应于HIV-1LAI跨膜gp41蛋白的558-595残基的38个氨基酸，如下所示NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO2)。
本发明中使用的DP-107多肽包括全长DP-107多肽的截短物，并且包含3-38个连续的氨基酸残基。DP-107截短物的实施例描述于USP 6,020,459和WO 96/40191。
本发明中使用的DP-107多肽包括全长的和截短的DP-107的类似物，这些类似物包含如上文对于DP-178所述的一个或多个氨基酸取代(保守的或不保守的)，插入和/或缺失。DP-107的类似物描述于USP6,020,459和WO 96/40191。DP107多肽还可以在氨基末端或羧基末端包含修饰作用以提供例如提高的生物可利用率，稳定性，或降低的宿主免疫识别，如上文对于DP-178和USP 6,020,459和WO 96/40191中所述。来自其它病毒分离物或物种的或者来自其它生物体的DP-107类似物也是DP-107类似物，并且描述于USP 6,020,459和WO96/40191。
本发明中使用的DP-107多肽，不管是全长的，截短的，类似物(即，包含DP-107的插入，缺失，取代，或类似物)，或者另外修饰的，都表现出抗病毒活性，抗融合活性，或调节涉及螺旋肽结构的胞内进程的能力，并且具有与DP-107类似的结构和/或氨基酸基序，并且能够被USP 6,020,459中详细描述的ALLMOTI5，107X178X4和PLZIP检索基序鉴定或识别。多肽的制备通过本领域公知的技术能够合成或制备本发明中使用的多肽。参见，例如，Creighton，1983，蛋白质结构和分子原理(ProteinsStructures and Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，NY。例如，在固相载体上或者在溶液中可以合成短肽。较长的肽可以利用重组DNA技术制备。根据本领域公知的技术可以合成，和/或克隆，和表达编码本发明的肽的核苷酸序列。参见，例如，Sambrook，等，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Vols.1-3，冷泉港出版社，NY。
如上所述，用连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键的方式能够合成本发明中使用的多肽。通过本领域公知的常规反应，例如通过亚氨基，酯，酰肼，氨基脲，和偶氮键，能够形成非肽键。还可以合成氨基末端和/或羧基末端有另外的化学基团(即如上所述的修饰作用)的在本发明中使用的肽，以提高根据常规方法的多肽的稳定性，生物可利用度，和/或抑制活性。
用改变的空间构型也能合成本发明中使用的多肽，例如，使用多肽的氨基酸残基的一个或多个的D-异构体对L-异构体。如果期望，本发明中使用的多肽的一个或多个氨基酸残基能够被非天然存在的氨基酸残基取代。象这样的改变可以用来提高本发明肽的稳定性，生物可利用度和/或抑制作用。
USP 6,015,881中描述了本发明中使用的DP-178或DP-107多肽的具体合成方法，其利用固相和液相合成方法合成并化合具体的多肽片段基团，得到感兴趣的肽。一般情况下，这些方法包括在固相上合成具体的侧链被保护的肽片段中间体，在溶液中偶联被保护的片段，生成被保护的肽，接着将侧链去保护，得到最终多肽。另外的治疗物质的应用本发明的联合疗法进一步包括一种或多种，优选一种至三种另外的在抗-HIV治疗中使用的抗病毒剂。作用于病毒复制中涉及的不同的靶分子的，作用于病毒传播中涉及的不同的靶分子的，防止或减少病毒抗性发生的，并且作用于相同分子的不同位置的抗病毒剂可以和本发明的联合疗法一起使用。这类物质包括引起病毒逆转录酶的抑制作用，病毒mRNA封闭反应的抑制作用，HIV蛋白酶的抑制作用，蛋白糖基化作用的抑制作用，病毒融合的抑制作用的那些(例如，如上所述的DP-107)，和其它抗病毒药物，其中的一些在这里讨论，不局限在上述活性内。本领域技术人员能确定使用表现出这些活性模式之一的抗病毒剂的各种各样的抗病毒疗法。特别地，可以与本发明的组合一起使用已知为HAART的组合。优选地，在本发明的联合疗法中使用较低剂量的抗病毒剂，这样减小与那种物质相关的毒性，而不降低抗病毒活性，同时减小或避免病毒抗性。
这里使用的术语″核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂″(″NRTIs″)意思是抑制HIV-1逆转录酶的活性，催化病毒基因组向病毒原HIV-1 DNA转化的核苷和核苷酸和其类似物。核苷衍生物包括但不限于2′，3′-双脱氧腺苷(ddA)；2′，3′-双脱氧鸟苷(ddG)；2′，3′-双脱氧肌苷(dd1)；2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)；2′，3′-双脱氧胸苷(ddT)；2′，3′-双脱氧-双脱氧胸苷(d4T)和3′-叠氮基-2′，3′-双脱氧胸苷(AZT)。
或者，可以使用卤化核苷衍生物，优选2′，3′-双脱氧-2′-氟代核苷，例如，2′，3′-双脱氧-2′-氟代腺苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代肌苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代胸苷；2′，3′-双脱氧-2′-氟代胞苷；和2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢-2′-氟代核苷，包括但不限于2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢-2′-氟代胸苷(Fd4T)。优选地，本发明的2′，3′-双脱氧-2′-氟代核苷是其中氟键是β构型的那些，例如，2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代腺苷(F-ddA)，2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代肌苷(F-dd1)，和2′，3′-双脱氧-2′-β-氟代胞苷(F-ddC)。
典型的合适的NRTIs包括从Glaxo-Wellcome Inc.，(ResearchTriangle，NC)购得的商品名是RETROVIR的叠氮胸苷(AZT)；从Bristol-Myers Squibb Co.(Princeton，NJ)购得的商品名是VIDEX的2′，3′-双脱氧肌苷(dd1)；从Roche Pharmaceuticals，(Nutley，NJ)购得的商品名是HIVID的2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)；从Bristol-MyersSquibb Co.购得的商品名是ZERIT的双脱氧胸苷(d4T)；从Glaxo-Wellcome购得的商品名是EPIVIR的lamivudine(3TC)；WO 96/30025中公开的以商品名ZIAGEN购得的abacavir(1592U89)；从GileadSciences(Foster City，CA)购得的商品名是PREVON的adefovirdipivoxil[bis(POM)-PMEA]；lobucavir(BMS-180194)，EP-0358154和EP-0736533中公开的Bristol-Myers Squibb，(Princeton，NJ)开发的一种核苷逆转录酶抑制剂；BCH-10652，Biochem Pharma，(Laval，魁北克，加拿大)开发的一种逆转录酶抑制剂(BCH-10618和BCH-10619外消旋混合物形式)；EmoryUniversity’s美国专利No.5,814,639许可并且由TrianglePharmaceuticals，(Durham，NC)开发的emitricitabine[(-)-FTC]；耶鲁大学对Vion Pharmaceutical，(New Haven CT)许可的β-L-FD4(也称为β-L-D4C并且名称是β-L-2′，3′-双脱氧-5-氟代胞苷)；DAPD，嘌呤核苷，EP 0656778公开的并且由Emory University和University of Georgia对Triangle Pharmaceutical许可的(-)-β-D-2，6-二氨基-嘌呤二氧戊环；和lodenosine(FddA)，9-(2，3-双脱氧-2-氟-b-D-苏-呋喃戊糖苷)腺嘌呤，NIH发现并且由U.S.Bioscience Inc.，(West Conshohoken，PA)开发的酸稳定性嘌呤为基础的逆转录酶抑制剂。
这里使用的术语″非-核苷逆转录酶抑制剂″(″NNRTI″s)意思是抑制HIV-1逆转录酶活性的非-核苷。典型的合适的NNRTIs包括从Roxane Laboratories(Columbus OH)生产商Boehringer Ingelheim购得的商品名是VIRAMUNE的nevirapine(BI-RG-587)；从Pharmacia& Upjohn Co.(Bridgewater NJ)购得的商品名是RESCRIPTOR的delaviradine(BHAP，U-90152)；WO94/03440公开的从DuPontPharmaceutical Co.(Wilmington DE)获得的商品名是SUSTIVA的efavirenz(DMP-266)，一种苯并嗪-2-酮；PNU142721，Pharmacia& Upjohn Co.开发的呋喃吡啶-硫代-嘧啶；AG-1549(以前称为Shionogi & num；S-1153)；WO 96/10019中公开的并且由AgouronPharmaceuticals，Inc.(LaJolla CA)临床开发的5-(3，5-二氯苯基)-硫代-4-异丙基-1-(4-吡啶基)甲基-1H-咪唑-2-基甲基碳酸酯；Mitsubishi Chemical Co.发现的并且由Triangle Pharmaceuticals开发的MKC-442(1-(乙氧基-甲基)-5-(1-甲基乙基)-6-(苯基甲基)-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)；和美国专利No.5,489,697公开的对Med Chem Research许可的(+)-calanolide A(NSC-675451)和B，香豆素衍生物，Vita-Invest将(+)calanolide A共同开发为口服给药产品。
术语″蛋白酶抑制剂″描述抑制HIV-1蛋白酶的抗病毒剂，而HIV-1蛋白酶是病毒多蛋白母体(例如，病毒GAG和GAG Pol多蛋白)蛋白水解裂解成感染HIV-1中发现的各种功能蛋白所必需的。Pis主要可以在病毒装配(即病毒发育)期间或之后工作，来抑制病毒体熟化成成熟感染状态。HIV蛋白酶抑制剂包括具有模拟肽结构，高分子量(7600道尔顿)和实际上肽特征的化合物，例如，CRIXIVAN(从Merck获得)和非肽蛋白酶抑制剂，例如，VIRACEPT(从Agouron获得)。
典型的合适的PIs包括从Roche Pharmaceuticals购得的商品名是INVIRASE的硬凝胶胶囊和商品名是FORTOVASE的软凝胶胶囊噻喹努佛(Ro 31-8959)；从Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)购得的商品名是NORVIR的ritonavir(ABT-538)；从Merck & Co.，Inc.，(West Point，PA)购得的商品名是CRIXIVAN的indinavir(MK-639)；从Agouron Pharmaceutical，Inc.购得的商品名是VIRACEPT的nelfnavir(AG-1343)；amprenavir(141W94)，商品名AGENERASE，一种Vertex Pharmaceuticals，Inc.，(Cambridge，MA)开发的并且从行使使用权程序的Glaxo-Wellcome获得的非肽蛋白酶抑制剂；从Bristol-Myers Squibb(Novartis发现的(CGP-61755)获得的lasinavir(BMS-234475)；DMP-450，一种Dupont发现的并且由Triangle Pharmaceuticals开发的环状脲；BMS-2322623，Bristol-Myers Squibb开发的作为第二代HIV-1PI的氮杂肽；Abbott开发的ABT-378；和AG-1549，Shionogi(Shionogi & num；S-1153)发现的Agouron Pharmaceuticals，Inc.开发的口服活性咪唑氨基甲酸酯。
本发明的联合疗法可以进一步与尿苷磷酸化酶抑制剂组合使用，所述尿苷磷酸化酶抑制剂是例如，无环尿苷(acyclouridine)化合物，包括苄基无环尿苷(BAU)，苄基氧基苄基无环尿苷(BBAU)，氨基甲基苄基无环鸟苷(AMBAU)，氨基甲基苄基氧基苄基无环鸟苷(AMB-BAU)，羟甲基苄基无环鸟苷(HMBAU)，和羟甲基苄基氧基苄基无环鸟苷(HMBBAU)；细胞因子或细胞因子抑制剂，例如，IL-2[PROLEUKIN(aldesleukin)，Chiron Corp.(Emeryville，CA)描述于EP-0142268，EP-0176299，RE 33653，USP 4530787，USP 4569790，USP4604377，USP 4748234，USP 4752585，和USP 4949314]，IL-12(WO96/25171中公开，Roche Pharmaceutical and American HomeProdocts，Madison，NJ)，IFN-α(INTRON-ASchering Plough)IFN-β和IFN-γ及其重组形式，TNF-α抑制剂，和MNX-160；干扰5′-mRNA进程的病毒封闭药物，例如，利巴韦林1-β-D-核糖呋喃糖苷-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺；描述于美国专利No.4,211,771 ICNPharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA；)；有抵抗各种脂质包被的病毒包括HIV活性的抗病毒剂，例如，两性霉素B(AmphotericinB)或者作为具有抗病毒(抗-HIV)活性的脂质结合分子的其甲基酯；糖蛋白处理的抑制剂，例如，粟精胺(Boehringer Mannheim)；羟基脲(Droxia；Bristol-Myers Squibb)，它是核糖核苷三磷酸还原酶的抑制剂，临床前研究表明对2′，3′-双脱氧肌苷有协同作用，并且可以和双脱氧胸苷一起使用；Yissum项目No.11607，它是Yissum ResearchDevelopment Co.(Jerusalem，Israel)临床前开发的以HIV-1Vif蛋白为基础的协同蛋白。
抗真菌剂和抗任意感染的其他药物，包括TB，HBV，EBV，和CMV，可以和本发明的联合疗法一起用于减轻和治疗与HIV-感染的免疫抑制患者相关的疾病。
本发明的联合疗法中使用的优选的另外的治疗剂包括dd1，DP-107，3TC，利巴韦林，和IFN-β。
抗病毒活性测试HIV感染(急性，共培养，和慢性)的不同阶段化合物(抗病毒活性研究的体外测试是本领域公知的，例如，参见Lambert等，抗病毒研究(Antiviral Res.)21327-342，(1993)。利用这些测试来评价本发明的联合疗法，如果期望，还有另外的治疗剂，的效果。利用体外测试，例如如下所述，能测定本发明的联合疗法中使用的抗病毒剂表现出的抗病毒活性，该项测试测定DP-178多肽抑制合胞体syncytia)形成或抑制无细胞病毒感染的能力，和/或测定CCR5抑制活性和本发明中使用的CCR5拮抗剂化合物的拮抗活性。应用这些测试，象肽的相对抗病毒活性这样的参数表现出抗给定病毒株和/或能测定肽的毒株特异性抑制活性。
此外，通过Chou和alalay的多药物分析方法(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55)和使用微机软件的剂量-效果分析(Chou和Chou，1987，Software and Manual.p.19-64Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)能测定本发明联合疗法的效力。通过MacSynergy计算机程序(Pritchard和Shipman，1990，抗病毒研究(Antiviral Research)14181-206)能计算本发明的联合疗法中使用的抗病毒剂之间的药物-药物相互作用分析，包括协同作用和拮抗作用。
本发明的CCR5拮抗剂化合物抑制RANTES(″调节激活作用，正常T细胞表达分泌″，其是CCR5的天然配体)结合，活性(Ki)是大约0.1至2000nM，优选0.1至1000nM，更优选大约0.1至500nM，最优选大约0.1至100nM。
CCR5膜结合测试应用CCR5膜结合测试的高通量筛选鉴定RANTES结合的抑制剂。该项测试使用从表达具有结合RANTES能力的人CCR5趋化因子受体的NIH 3T3细胞制备的膜。使用96-孔平板形式，化合物存在或不存在下膜制剂与125I-RANTES温育1小时。以0.001微克/毫升至1微克/毫升范围系列稀释化合物，并且三次测试。通过玻璃纤维过滤器收集反应混合物，并且充分洗涤。对复制总量取平均值，并且以抑制总125I-RANTES结合的50％所需要的浓度报道数据。在第二个以细胞为基础的HIV-1入侵和重复测试中进一步表征膜结合测试中具有有效活性的化合物。
HIV-1入侵测试通过编码HIV-1的NL4-3毒株的质粒(已经通过包膜基因突变而修饰并且导入荧光素酶报道基因质粒)和编码几种HIV-1包膜基因之一的质粒共转染产生复制缺陷HIV-1报道病毒体，如Connor等，病毒学(Virology)206935-944(1995)所述。通过磷酸钙沉淀转染两种质粒之后，在第三天收集病毒上清液并且测定病毒功能效价。然后使用这些原液感染稳定表达CD4和趋化因子受体CCR5的U87细胞，它与或不与试验化合物预先温育。37℃下进行感染2小时，冲洗细胞并且用含有CCR5拮抗剂化合物的新鲜培养基置换培养基。将细胞温育3天，溶解并且测定荧光素酶活性。以抑制对照培养物中荧光素酶活性的50％所需要的化合物浓度表示结果。
HIV-1复制试验该项试验使用原始外周血单核细胞或稳定的U87-CCR5细胞系来测定本发明联合疗法中使用的抗病毒剂阻断原发HIV-1毒株感染的效果。从正常健康供者纯化原始淋巴细胞，并且在感染之前用PHA和IL-2体外刺激三天。使用96-孔平板形式，37℃下用药物将细胞预处理1小时，并且接着用亲-M HIV-1分离物感染。感染之后，洗涤细胞，去除残留的接种物并且在化合物存在下培养4天。收集培养上清液，并且通过测定病毒p24抗原浓度测定病毒复制。
钙流出分析在加入化合物和天然CCR5配体(RANTES)之前对表达HIV辅助受体CCR5的细胞加载钙敏感染料。具有激动性质的化合物将诱导细胞中钙流出信号，而CCR5拮抗剂被鉴定为其本身不诱导信号的化合物，但是天然配体RANTES能阻断信号传导。
GTPγS结合测试(第二膜结合测试)GTPγS结合测试测定CCR5配体的受体激活作用。该项测试测定35S标记的-GTP和与G-蛋白偶联的受体的结合，其发生是合适的配体的受体激活作用的结果。在该项测试中，CCR5配体RANTES与来自CCR5表达细胞的膜温育，并且通过检测结合的35S标记来自测定对受体的结合(或激活作用)。如果化合物通过诱导受体的激活作用而表现出激动性质或者通过测定竞争或非竞争方式中RANTES结合的抑制作用而表现出拮抗剂性质，则该项测试是定量进行的。
趋化性分析趋化性分析是一项功能测试，其表征试验CCR5拮抗剂化合物的激动性质对拮抗性质。该项测试测定没有附着的表达人CCR5(BaF-550)的鼠细胞系响应试验化合物或天然配体(即，RANTES，MIP-1β)迁移过膜的能力。细胞迁移过可渗透膜朝着具有激动活性的化合物。是拮抗剂的化合物不能诱导趋化性但是能抑制响应已知的CCR5配体的细胞迁移。
细胞融合试验用于检测细胞融合作用的试验是本领域公知的，并且能用来测定DP-178多肽和/或CCR5拮抗剂抑制膜融合或病毒-诱导的合胞体。一般通过培养不存在任何处理下一般会经历可观察水平的合胞体形成的细胞体外进行细胞融合分析。例如，在诱导细胞融合的病毒(例如HIV)慢性感染的细胞的存在下或者在要分析的多肽的存在或不存在下，温育未感染的细胞(例如，CD4+细胞，例如Molt或MEM细胞)。温育(例如37℃下温育24小时)之后，用显微镜对细胞培养物检查多核巨细胞的存在，这是细胞融合和合胞体形成的指征。可以使用公知的染料，例如结晶紫染料，以有利于合胞体形成的观察。
药物组合物，剂量和给药方案因为DP-178的作用位点在病毒的表面，并且阻止自由病毒感染宿主细胞以及病毒在细胞和细胞间传播，和阻断宿主细胞受体和HIV的CCR5拮抗剂化合物联合使用DP178，提供能提供加和或协同作用的作用机理的不同的治疗靶物。优选地，用较低浓度的抗病毒剂使用本发明的联合疗法，产生降低的毒性。因此，本发明的联合疗法不仅可以减小抗病毒活性所需要的药物的有效剂量，从而降低其毒性，而且作为通过多种机理攻击病毒的结果，还可以提高绝对抗病毒作用。本发明的联合疗法还提供用于避免或减少产生病毒抗性机会的方法。
“联合”给与DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物，和CCR5拮抗剂化合物，或者其药学可接受盐，包括这样的方法，其中两种药物一起作为混合物给药(单一剂量形式)，还有这样的方法，其中两者药物分开但是同时给药，例如，通过分开的静脉内途径或口服和静脉内给药。
″联合″给药进一步包括分开给药顺序给与DP-178多肽和CCR5拮抗剂化合物，使得首先给与药物的一种，接着给与第二种，例如，作为循环治疗(即，一段时间给与第一种抗病毒化合物，接着一段时间给与第二种抗病毒剂，并且重复这种顺序给药以减少发生对化合物之一的抗药性)。
使用实现它们想要目的的治疗有效量的抗病毒剂和合适的药学载体配制适合在本发明中使用的药物组合物。对于所有的这样的目的，通过临床医生对患者状况的观察能选择精确配方，给药途径和剂量(参见，例如，Fingl等，1975，治疗的药学基础(″The PharmacologicalBasis of Therapeutics″)，第一章)。
配制和给药方法可以参见“Remington’s制药科学”(″Remington’sPharmaceutical Sciences″)，第18版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA。因此根据本发明使用的药物组合物可以以常规方法配制，使用一种或多种生理可接受载体，包括能在药物中使用的有利于将活性化合物加工成制剂的赋形剂和辅助剂。合适的配方取决于选择的给药途径。给药途径包括口服，直肠，透粘膜，肠内，肠胃外，肌内，皮下，髓内，鞘内，直接心室内，静脉内(即，注射或连续输注)，腹膜内，鼻内，吸入，眼内，经皮，局部，阴道等等。
本发明联合疗法中使用的药物制剂优选是单位剂量形式。在这样的形式中，制剂被分为含有合适量的抗病毒剂的合适大小的单位剂量。要给与的本发明肽的有效剂量可以通过本领域技术人员公知的程序确定，寻求象生物半寿期，生物可利用度，和毒性这样的参数。
剂量形式包括但不限于片剂，分散体，粉末剂，悬浮剂，栓剂，溶液，乳状液，胶囊，糖衣药丸，气雾剂，植入物，乳膏，贴剂，小唧筒等。最优选地，静脉内给药DP-178多肽。最优选地，口服给与CCR5拮抗剂化合物。
CCR5拮抗剂或者其衍生物在单位剂量制剂中的量，特别是对于口服给药，可以从大约10毫克至大约500毫克变化。CCR5拮抗剂的实际剂量可以根据象患者的年龄，症状和体重，要治疗的症状的严重程度，HIV分离物的类型而变化，这是本领域技术人员能确定的。根据需要，在给药的一天中，可以将总的日剂量分开并且分次给药。一般推荐的总日剂量给药方案范围是每天给药大约20毫克至大约800毫克，优选25毫克至600毫克，更优选大约50毫克至400毫克，最优选100毫克至200毫克。
在本发明的联合疗法中，可以每天一次或者不到每天一次的频率，例如每周两次至四次或者隔天一次，给与治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其衍生物。剂量也可以分为两剂至四剂，或者可以提供一次剂量。优选地，每天口服，每天两次(bid)口服治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其衍生物。医生可以确定本发明联合疗法的效力使得减少CCR5拮抗剂给药次数，例如一天一次或更少，例如每周1-3次或者隔天一次。
以单位剂量制剂施用的DP-178多肽，或其药学可接受衍生物的量，可以肠胃外给药，例如，作为连续灌注或注射。DP-178多肽的剂量范围是3毫克至200毫克(或者其将病毒载量减小1-2个对数的倍数)，优选7毫克至100毫克，更优选20毫克至35毫克，每天给药。本发明的一个优点在于可以比每天两次(bid)更少地给与多肽，从前对于临床试验中使用T-20有报道。因此，本发明的联合疗法允许每天一次(qid)给与治疗有效量的DP178多肽，优选每周一次(qd)两次至四次，更优选隔天一次(qd)。
根据包装说明中核准的剂量和给药方案或者特定物质记录中提出的核准的剂量和给药方案，考虑患者的年龄，性别和状况，要治疗的症状的严重程度和HIV分离物，临床医生能确定与本发明疗法联合使用的NRTIs，NNRTIs，PIs和其它治疗剂的剂量和给药方案。
典型的合适的多药物联合疗法例如(i)选自两种NRTIs，一种PI，第二种PI，和一种NNRTI的至少三种抗HIV-1药物；和(ii)至少两种选自NNRTts和PIs的抗病毒剂。典型的合适的HAART-多药物联合疗法包括(a)三联联合治疗，例如两种NRTIs和一种PI；或(b)两种NRT1s和一种NNRTI；和(c)四联联合治疗，例如两种NRTIs，一种PI和第二种PI或一种NNRTI。
这些多药物联合可以与CCR5拮抗剂和DP-178多肽，或它们的药学可接受盐/衍生物联合使用。
在对单纯性患者的治疗中，优选使用CCR5拮抗剂和DP-178多肽，或它们的药学可接受盐/衍生物的三联多药物联合疗法开始抗-HIV-1治疗；使用两种NRTIs和一种PI是优选的，除非对PIs有不耐药性。药物顺应性是必需的。应该每3-6个月监测CD4+和HIV-1-RNA血浆水平。应该使病毒载量水平趋稳，可以加入另外一种药物，例如，一种PI或一种NNRTI。下表中进一步描述与本发明联合使用的典型的疗法抗病毒多药物联合疗法A.三联联合疗法1.两种NRTIs1+一种PI2，2.两种NRTIs1+一种NNRTI3B.四联联合疗法4两种NRTIs+一种PI+第二种PI或一种NNRTIC.替代方案5两种NRTI1一种NRTI5+一种PI2
两种PIs6+一种NRTI7或NNRTI3一种PI2+一种NRTI7+一种NNRTI3表中脚注1.下面中的一种叠氮胸苷+lamivudine；叠氮胸苷+双脱氧腺苷；stavudine+lamivudine；stavudine+双脱氧腺苷；叠氮胸苷+扎西他宾。
2.Indinavir，nelfinavir，ritonavir或噻喹努佛软凝胶胶囊。
3.Nevirapine或delavirdine。
4.参见Vandamne等，抗病毒化学和化学疗法(Antiviral Chemistry& Chemotherapy)9193-197(1998)。
5.对由于顺应性问题或毒性而不能采用推荐的给药方案的患者，以及对推荐的给药方案失败或复发的那些患者的替代给药方案。两种核苷联合可以导致HIV-抗性，并且对很多患者临床失败。
6.用噻喹努佛和ritonavir(各400mg bid)获得大多数数据。
7.叠氮胸苷，stavudine或双脱氧腺苷。
权利要求
1.一种对需要这样的治疗的个体治疗HIV感染的方法，包括联合施用治疗有效量的CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐，和治疗有效量的DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物。
2.权利要求1的方法，其中CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐的剂量是25至600毫克，并且DP-178多肽，或者其药学可接受衍生物的剂量是3至200毫克，或者将个体病毒载量减小1-2个对数的其倍数。
3.权利要求1的方法，其中给药的每一天给与1或2次CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐。
4.权利要求1的方法，其中每周1-3次或者隔天一次给与CCR5拮抗剂，或者其药学可接受盐。
5.权利要求1的方法，其中每周1-3次或者隔天一次给与DP-178多肽。
6.权利要求1的方法，其中每周3次或者隔天一次给与DP-178多肽。
7.权利要求1的方法，其中口服给与CCR5拮抗剂。
8.权利要求1的方法，其中皮下给与DP-178多肽。
9.权利要求1的方法，其中所述CCR5拮抗剂是选自下面的化合物 和
10.权利要求1的方法，其中所述DP-178多肽由表3中的氨基酸序列组成。
11.权利要求1的方法，进一步包括联合给与用于治疗HIV的一种或多种抗病毒剂或治疗剂。
12.权利要求11的方法，其中所述抗病毒剂选自核苷逆转录酶抑制剂，非-核苷逆转录酶抑制剂，和蛋白酶抑制剂。
13.权利要求11的方法，其中所述抗病毒剂选自DP-107多肽，叠氮胸苷，lamivudine，扎西他宾，双脱氧腺苷，stavudine，abacavir，adefovir dipivoxil，lobucavir，BCH-10652，emitricitabine，β-LFD4，DAPD，lodenosine，奈韦拉平，delaviridine，efavirenz，PNU-142721，AG-1549，MKC-442，(+)-calanolide A和B，噻喹努佛，indinavir，ritonavir，nelfinavir，lasinavir，DMP-450，BMS-2322623，ABT-378，amprenavir，羟基脲，利巴韦林，IL-2，IL-12，Yissum No.11607和AG-1549。
14.一种对需要这样的治疗的个体治疗HIV感染的方法，包括每天一至两次口服施用25至400毫克/天的下面结构式的CCR5拮抗剂， 或者其药学可接受盐，并且每周一次，两次，三次或四次皮下给与3至200毫克，或者将个体病毒载量减小1-2个对数的其倍数的T-20。
15.权利要求14的方法，进一步包括联合给与用于治疗HIV的一种或多种抗病毒剂或治疗剂。
16.权利要求15的方法，其中所述抗病毒剂选自核苷逆转录酶抑制剂，非-核苷逆转录酶抑制剂，和蛋白酶抑制剂。
17.权利要求15的方法，其中所述抗病毒剂选自DP-107多肽，叠氮胸苷，lamivudine，扎西他宾，双脱氧腺苷，stavudine，abacavir，adefovir dipivoxil，lobucavir，BCH-10652，emitricitabine，β-LFD4，DAPD，lodenosine，奈韦拉平，delaviridine，efavirenz，PNU-142721，AG-1549，MKC-442，(+)-calanolide A和B，噻喹努佛，indinavir，ritonavir，nelfinavir，lasinavir，DMP-450，BMS-2322623，ABT-378，amprenavir，羟基脲，利巴韦林，IL-2，IL-12，Yissum No.11607和AG-1549。
18.一种包括用于联合治疗HIV感染的单一包装药物组合物的试剂盒，其包括在第一容器中含有在药学可接受载体中含有CCR5拮抗剂或其药学可接受盐的药物组合物，每周1-3次或隔天一次给药的口服剂量是25-600毫克，和在第二容器中含有药学可接受载体中含有DP-178多肽或其药学可接受衍生物的药物组合物，以3-200毫克的皮下剂量，或将病毒载量减小1或2个对数的其倍数。
19.权利要求18的试剂盒，其包括在附加的容器中含有包括用于治疗HIV的药学可接受载体中的治疗有效量抗病毒剂或治疗剂的一种或多种药物组合物。
全文摘要
本发明提供用于治疗HIV的新的联合疗法，包括CCR5拮抗剂或其药学可接受盐，和DP－178多肽或其药学可接受衍生物。本发明联合疗法通过将DP－178多肽给药频率从每日皮下两次减少至每天一次或者只是每周几次而提供更耐受的治疗方案。
文档编号A61K38/00GK1481251SQ01820919
公开日2004年3月10日 申请日期2001年12月17日 优先权日2000年12月19日
发明者B·M·巴鲁迪, B M 巴鲁迪 申请人:先灵公司
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