预防和减轻皮肤皱纹的组合物的制作方法
专利名称：预防和减轻皮肤皱纹的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平(amoldipine)，以及用于透皮吸收制剂如霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、贴片或贴片型给药装置中的常规成分。
背景技术：
皮肤老化是由于内部因素如衰老以及环境因素两方面造成的。皮肤老化所表现出的现象是皮肤出现皱纹，包括颈部皱纹、抬头纹、皱眉纹、鱼尾纹、鼻翼至嘴角间的皱褶以及眼圈、唇下和面部的细纹。皮肤皱纹是由于皮肤老化所造成的，尽管存在个体差异，一般在二十出头时出现并且随年龄增加而增长。随皮肤老化的出现，皮肤中胶原蛋白的含量降低并且弹性纤维发生转变，由此造成皮肤松弛并导致细小皱纹的出现。同时，胶原蛋白是一种重要的基质蛋白，它由皮肤中的成纤维细胞生成，存在于细胞外基质中。它是一种主要蛋白质，占人体蛋白质的30重量％，具有牢固的三重螺旋结构。已经知道胶原蛋白起到为皮肤提供结构稳定性、为结缔组织提供耐久性、粘结组织以支持细胞连接、细胞增生和诱导未分化细胞分化等作用。此外，已经知道暴露于紫外线(UV，一种导致皮肤老化的环境因素)导致胶原蛋白破坏，UV所造成的破坏与暴露时间成正比。UV使胶原纤维变性，导致皱纹出现和皮肤弹性降低。其他已知的造成皮肤老化的环境因素包括风、热和吸烟。
如上所述，胶原蛋白与皮肤老化密切相关。皮肤中胶原蛋白的含量因皮肤老化和UV照射而降低。从20岁至80岁，皮肤胶原蛋白含量降低65％。胶原蛋白含量降低使皮肤变薄，这与皮肤皱纹的形成密切相关。
为寻找一种预防和减轻皮肤皱纹的方法，人们已经进行了广泛的研究，并阐明了胶原蛋白的重要作用。这些研究工作也证明，当皮肤中胶原蛋白的合成被激活时，皮肤基质成分增加，这些成分具有减轻皱纹、增加皮肤弹性和强度的作用。因此，利用具有保湿作用的胶原蛋白，现已开发出了一些含胶原蛋白的化妆品。但这些化妆品保湿效果差，这是因为这些化妆品涂于皮肤表面之上，高分子量的胶原蛋白难以透皮吸收的缘故。因此，使用它们并不能从根本上改善皮肤的外观。在现有技术中已经公开了维甲酸、TGF-β、源自动物胎盘的蛋白(JP8-231370)、白桦脂酸(JP8-208424)和小球藻提取物(JP9-40523，JP10-36283)作为促进胶原蛋白合成的物质。对于维甲酸而言，它不稳定并且存在安全性问题，应用于皮肤会造成刺激和皮肤发红，从而限制了其剂量范围。对于包括小球藻提取物在内的其它上述物质而言，它们促进胶原蛋白合成的作用微弱，因此基本上不能改善皮肤的外观。近期已经出现了几个通过促进胶原蛋白合成治疗皮肤皱纹的新方法，其实例包括超声处理、去除死皮、激光剥皮、肉毒毒素注射和Restilene注射。这些方法的缺点是缺乏经济性并且作用时效短。因此，有必要寻找并开发出一种高效的促进胶原蛋白合成的制剂。
发明内容
因此，本发明的研究者们经过研究已经开发出了促进胶原蛋白合成的化合物。通过实验发现，已知作为抗震颤药、免疫抑制剂或钙离子通道拮抗剂的苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于人类成纤维细胞系具有非常强的促进胶原蛋白合成的作用。此外，已经发现当施用于大鼠和小鼠皮肤之上时，这些化合物对于皱纹具有强烈的抑制和减轻作用，证实了抑制和防止皮肤老化如皮肤皱纹的作用。因此，本发明涉及一种包含苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平作为活性成分的组合物，这些活性成分具有促进胶原蛋白合成的作用。
苯妥英和丙戊酸已被广泛用作抗震颤剂而用于治疗癫痫，有关它们对于胶原蛋白合成的作用已有报道(USP5686489；Minerva Stomatol.，47(9)387-398，Sep.1998)。环孢菌素A已被广泛用作免疫抑制剂，用于抑制移植后组织的排异反应，其对于胶原蛋白合成的作用已有报道(J Periodontol.，72(7)921-931，Jul.2001)。硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，已被用作钙离子通道拮抗剂，有关它们对于胶原蛋白合成的作用也有报道(J Periodontol.，72(8)Aug.2001Proc NatlAcad Sci USA，93(11)5478-5482，May 1996；J Urol.，156(6)2067-2072，Dec.1996)。但是，上述药物作为皮肤外用药剂施用于皮肤之上以防止和减轻皮肤皱纹的做法尚无报道。
具体实施例方式
辅以试验性实施例和实施例，以下将详细描述一种用于防止和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物。试验性实施例1本发明活性成分对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用为在细胞水平上观察本发明活性成分对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用，将各活性成分加到人成纤维细胞培养液中，对Martens所提出的方法(Gut，331664-1670，1992)进行改进，测量所合成的胶原蛋白，以评价活性成分的作用。实验规程具体如下。
将人成纤维细胞转入24孔板中并在一种含有10％胎牛血清(FBS)的培养液中培养24小时，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。将细胞置于包含1％FBS、以及活性成分终浓度为10-8至10-5M的培养液中温育，所述活性成分是苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。温育1小时后向培养液中加入10μCi3H-脯氨酸/孔，然后再温育24小时。温育结束后收集各组细胞并将各培养液分成两份。其中一份用胶原蛋白酶处理。向各份培养液中加入三氯乙酸以沉淀蛋白。测量胶原蛋白酶敏感蛋白所结合的放射性的量，并与未用胶原蛋白酶处理的部分进行比较。放射性的差异是因为化合物的促进作用所导致的。没有添加活性成分的样品作为对照组，其胶原蛋白合成量定为100％。实验结果见下表1。
表1对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用(％)
*胶原蛋白产率＝(实验组胶原蛋白产量/对照组胶原蛋白产量)×100
如表1所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随化合物浓度增加，实验组中活性成分具有促进胶原蛋白形成的作用，胶原蛋白产率最小为182.42％，最大为381.54％，其增幅与浓度相关。这表明本发明的活性成分具有明显促进胶原蛋白合成的作用。试验性实施例2对于大鼠皮肤中胶原蛋白形成的促进作用通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平对于动物皮肤中胶原蛋白形成的促进作用。对Mard L DaCosta等人提出的方法(Surgery，123287-293，1998)进行改进，测量所合成的胶原蛋白。
简而言之，对5周龄雄性SD大鼠进行分组，每组5只。在各大鼠腹部中心位置切开1cm口子，并塞入PVA海绵(Unipoint ind.)。缝合后作为试验组，所试验的各活性成分施用于PVA海绵植入区，剂量为每天200μl，共计10天。解剖后将PVA海绵除去以定量分析羟脯氨酸。向PVA海绵中加入4ml 6N HCl，130℃下水解3小时并将其完全蒸干。加入50ml甲醇，溶液于110℃温育直至HCl被除去。加入1.2ml 50％异丙醇溶解剩余沉淀。搅拌下加入200μl氯胺-T(对甲苯磺酰胺钠三水合物)，放置10分钟。此后加入1.2ml Ehrlich试剂，混匀，溶液于50℃下温育90分钟。所得溶液冷至室温，于558nm下测量吸光度。将1mg羟脯氨酸溶于1ml HCl中，稀释为0、0.2、0.4、0.8、1mg/25μl 6N HCl，由此制备羟脯氨酸标准溶液。标准溶液于130℃下水解3小时。相对于仅采用溶剂的对照组所测得的羟脯氨酸值(100％)，羟脯氨酸的定量值列于表2中。
表2对于动物皮肤中胶原蛋白形成的促进作用(％)
*胶原蛋白产率＝(实验组羟脯氨酸值/对照组羟脯氨酸值)×100如表2所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随化合物浓度增加，实验组中活性成分具有促进胶原蛋白产量的作用，最小为122.44％，最大为185.88％，其增幅与浓度相关。这表明本发明的活性成分具有明显促进胶原蛋白合成的作用。试验性实施例3对于无毛小鼠皱纹产生的抑制作用通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于无毛小鼠皱纹产生的抑制作用。
将6周龄无毛小鼠分为21个试验组和3个对照组，每组10只。对于试验组，在小鼠皮肤上施用各化合物，浓度为10-8至10-3M。对照组仅施用不含活性成分的溶剂。实验规程具体如下。采用模拟阳光照射无毛小鼠，照射剂量为2MED(造成皮肤发红的最小剂量的2倍)，每周照射3天共照射12周，以此造成皱纹。将各活性成分或溶剂施用于皮肤之上，每天2次(具体而言在照射前和照射后30min施用)，每次100μ1，自照射之日起共计10周。检查对于皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视和照相进行检查。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即无效(分值0)、轻微(分值1)、中等(分值2)和强效(分值3)，将化合物处理组(试验组)与对照组(分值0)进行对比，同时对各组小鼠进行计数。试验数据列于表3a至3c中。
表3a对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
表3b对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
表3c对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
如表3a至3c所示，对于抑制无毛小鼠皱纹产生而言，本发明活性成分表现出强效抑制的占80％以上。这说明本发明的活性成分具有明显抑制皱纹产生的作用。试验性实施例4减轻无毛小鼠皮肤皱纹的效应通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于减轻无毛小鼠皱纹的效应。
将小鼠分为21个试验组和3个对照组，每组10只。对于试验组，在小鼠皮肤上施用各化合物，浓度为10-8至10-3M。对照组仅施用不含活性成分的溶剂。实验规程具体如下。采用模拟阳光照射无毛小鼠，照射剂量为2MED(造成皮肤发红的最小剂量的2倍)，每周照射3天共照射10周，以此造成皱纹。此后将各活性成分或溶剂施用于皮肤之上，每天2次，每次100μl，共计6周。检查对于皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视检查施用化合物的区域并对该区域照相。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即不抑制(分值0)、轻微(分值1)、中等(分值2)和强效(分值3)，将化合物处理组(实验组)与对照组(分值0)进行对比，同时对各组小鼠进行计数。试验数据列于表4a至4c中。
表4a减轻无毛小鼠皱纹的效应
表4b减轻无毛小鼠皱纹的效应
表4c减轻无毛小鼠皱纹的效应
如表4a至4c所示，对于减轻无毛小鼠皱纹而言，本发明活性成分表现出强效作用的占约80％以上。这说明本发明的活性成分具有明显减轻皱纹的作用。
采用本发明活性成分促进人、大鼠和小鼠成纤维细胞胶原蛋白合成的评价试验的结果表明，浓度为10-8至10-3M的苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平具有明显促进胶原蛋白合成的作用。
含有本发明活性成分的皮肤外用组合物可以采用任何适用于皮肤的剂型，如霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、气溶胶、贴片或带有微型针的贴片型给药装置。组合物被特制为霜、软膏和涂敷剂，施用于人皮肤之上以减轻皱纹。已经发现他们可以显著降低皱纹密度。
伴随实施例和对照例，以下将详细描述一种用于防止和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物。应注意到这些实施例仅起描述作用，不能认为本发明仅局限于这些实施例。包含本发明活性成分的各种配方的制备适用于皮肤的皮肤外用制剂的配方列于表5至7中，其中采用了本发明的各活性成分以及其它辅助成分。在本发明中制备了局部用于皮肤的软膏、霜、涂敷剂、精油、皮肤软化剂、营养乳液、贴片或带有微型针的贴片型给药装置。应注意到此处仅制备了采用苯妥英和环孢菌素A作为活性成分的组合物，这些实施例并非用于限定配方和活性成分的。
表5软膏的配方(单位重量％)
*聚氧乙烯油基醚磷酸酯表6霜的配方(单位重量％)
表7贴片的配方(单位重量％)
表8精油的配方(单位重量％)
表9皮肤软化剂的配方(单位重量％)
表10营养乳液的配方(单位重量％)
表11贴片的配方(单位重量％)
对于带有微型针的贴片型给药装置，贴片的主体是一个含有药物溶剂的储液池，该储液池含有聚合物支持体以确保贴片的整体性，同时防止药物如苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平渗漏。包含在储液池内部的药物溶剂可以是水、聚乙二醇、乙氧基二乙二醇或乙醇。对于聚合物支持体，可以采用聚乙烯、聚丙烯、无纺布或棉布。上述药物以粉末形式分散于储液池的下部。贴片型装置是一种透皮给药的装置，其特征在于还包含有微针基座和多微针。微针基座可以用纤维素、聚丙烯、碳氟化合物或聚碳酸酯制成，它们具有膨胀性，粘附于皮肤上后溶剂被释放。对于微针，它们被分散且垂直固定于微针基座上并且与皮肤接触。更具体而言，每单位面积(cm2)中将10至50个微针固定于微针基座上，每根针具有一个药物可通过的通道，该通道的直径为1至1000μm，而针外向固定的长度为0.1-1mm。该装置下部有一个粘接层，用于将装置粘附于皮肤之上，粘接层由诸如聚丙烯酸酯或聚丁烯的材料制成。应注意的是粘接层对于皮肤没有副作用并且不被溶剂所溶解。同时，溶剂通过后不会使其粘接性能下降。最后，将一个保护膜贴在粘接层上，当使用装置时，它易于被除去，其作用是防止药物泄漏和保护粘接层。辅以实施例，以下将详细描述本发明，但不能认为本发明仅局限于这些实施例。含有本发明活性成分且带有微针的贴片型装置的制备对照例1将1g 3％的明胶溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到对照基材。实施例1将0.001％的苯妥英加到1g 3％的明胶溶液，混匀。将该溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到含苯妥英的基材。实施例2将0.001％的环孢菌素A加到1g 3％的明胶溶液，混匀。将该溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到含环孢菌素A的基材。包含本发明活性成分的组合物对于皮肤老化的防治作用的评价为评价上述对照例和实施例以及表5至11所列实施例制备的制剂对于减轻皮肤皱纹的效果，采用年龄在35岁至60岁之间的女性作为实验对象。将760名女性实验对象分为38个组，每组20人。每天将各实施例及对照例涂于实验对象脸上，每天2次，共计3个月(对于表7中的涂敷剂使用35分钟后除去)。3个月后，通过走访调查和皱纹图像分析确定皱纹的减轻程度。对于走访调查而言，与未使用各组合物之前的情况相比较，将皱纹的减轻程度和皮肤弹性增加分为四级，即没有效果、轻微、中等和强效，并对各实验组人员进行统计。实验结果见表12。为进行皱纹的图像分析，在实验开始前用Xantopren(Bayer)取各实验对象眼下区域的摹本，在实验结束后立即取相同区域的另一摹本，将两摹本进行图像分析。通过二维分析测量皱纹密度。相对于实验前皱纹密度，测量结果表示成皱纹减速轻率。结果见表13。
表12女性皮肤皱纹的减轻程度
*计数的实验对象的数目表13减轻女性皱纹密度的效应
如表12所示，本发明的实施例表现出明显的减轻皱纹和增加皮肤弹性的作用。更具体而言，超过80％的实验对象改善效果为强效。如表13所示，当包含本发明活性成分的实施例用于实验对象时，与实验前的情况相比，皱纹密度明显降低，达37％至50％。同样，当使用带有微针的贴片型给药装置时，实施例1和2明显降低了皱纹密度，分别达70％和60％，说明这些实施例的作用效果优于对照例(98％)(实验数据未显示)。
以上实验结果表明，采用软膏、霜、涂敷剂、精油、皮肤软化剂、营养乳液、贴片或带有微型针的贴片型给药装置等形式对皮肤局部给药时，因内部或外部因素所造成的皮肤皱纹明显减轻。
从上述描述中可见，本发明提出了一种皮肤外用组合物，其中包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，该组合物表现出抑制、减轻和防止皮肤老化如皮肤皱纹的作用。
为起到描述的目的，在此已经公开了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，在不背离所附权利要求所界定的本发明范围和精神的基础上，有可能对本发明进行多种的改进、增添和替代。
权利要求
1.一种预防和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。
2.如权利要求1所述分组合物，其中以组合物总重计，活性成分的含量为0.00001至30重量％。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该组合物为霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、贴片或带有微针的贴片型给药装置的形式。
全文摘要
本发明公开了一种预防和减轻皮肤皱纹的组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。
文档编号A61K8/64GK1482896SQ01821089
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月19日 优先权日2000年12月20日
发明者李鹤模, 金祥年, 金文武, 安浩井, 卢景玉 申请人:Lg生活健康株式会社
技术领域：
本发明涉及一种预防和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平(amoldipine)，以及用于透皮吸收制剂如霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、贴片或贴片型给药装置中的常规成分。
背景技术：
皮肤老化是由于内部因素如衰老以及环境因素两方面造成的。皮肤老化所表现出的现象是皮肤出现皱纹，包括颈部皱纹、抬头纹、皱眉纹、鱼尾纹、鼻翼至嘴角间的皱褶以及眼圈、唇下和面部的细纹。皮肤皱纹是由于皮肤老化所造成的，尽管存在个体差异，一般在二十出头时出现并且随年龄增加而增长。随皮肤老化的出现，皮肤中胶原蛋白的含量降低并且弹性纤维发生转变，由此造成皮肤松弛并导致细小皱纹的出现。同时，胶原蛋白是一种重要的基质蛋白，它由皮肤中的成纤维细胞生成，存在于细胞外基质中。它是一种主要蛋白质，占人体蛋白质的30重量％，具有牢固的三重螺旋结构。已经知道胶原蛋白起到为皮肤提供结构稳定性、为结缔组织提供耐久性、粘结组织以支持细胞连接、细胞增生和诱导未分化细胞分化等作用。此外，已经知道暴露于紫外线(UV，一种导致皮肤老化的环境因素)导致胶原蛋白破坏，UV所造成的破坏与暴露时间成正比。UV使胶原纤维变性，导致皱纹出现和皮肤弹性降低。其他已知的造成皮肤老化的环境因素包括风、热和吸烟。
如上所述，胶原蛋白与皮肤老化密切相关。皮肤中胶原蛋白的含量因皮肤老化和UV照射而降低。从20岁至80岁，皮肤胶原蛋白含量降低65％。胶原蛋白含量降低使皮肤变薄，这与皮肤皱纹的形成密切相关。
为寻找一种预防和减轻皮肤皱纹的方法，人们已经进行了广泛的研究，并阐明了胶原蛋白的重要作用。这些研究工作也证明，当皮肤中胶原蛋白的合成被激活时，皮肤基质成分增加，这些成分具有减轻皱纹、增加皮肤弹性和强度的作用。因此，利用具有保湿作用的胶原蛋白，现已开发出了一些含胶原蛋白的化妆品。但这些化妆品保湿效果差，这是因为这些化妆品涂于皮肤表面之上，高分子量的胶原蛋白难以透皮吸收的缘故。因此，使用它们并不能从根本上改善皮肤的外观。在现有技术中已经公开了维甲酸、TGF-β、源自动物胎盘的蛋白(JP8-231370)、白桦脂酸(JP8-208424)和小球藻提取物(JP9-40523，JP10-36283)作为促进胶原蛋白合成的物质。对于维甲酸而言，它不稳定并且存在安全性问题，应用于皮肤会造成刺激和皮肤发红，从而限制了其剂量范围。对于包括小球藻提取物在内的其它上述物质而言，它们促进胶原蛋白合成的作用微弱，因此基本上不能改善皮肤的外观。近期已经出现了几个通过促进胶原蛋白合成治疗皮肤皱纹的新方法，其实例包括超声处理、去除死皮、激光剥皮、肉毒毒素注射和Restilene注射。这些方法的缺点是缺乏经济性并且作用时效短。因此，有必要寻找并开发出一种高效的促进胶原蛋白合成的制剂。
发明内容
因此，本发明的研究者们经过研究已经开发出了促进胶原蛋白合成的化合物。通过实验发现，已知作为抗震颤药、免疫抑制剂或钙离子通道拮抗剂的苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于人类成纤维细胞系具有非常强的促进胶原蛋白合成的作用。此外，已经发现当施用于大鼠和小鼠皮肤之上时，这些化合物对于皱纹具有强烈的抑制和减轻作用，证实了抑制和防止皮肤老化如皮肤皱纹的作用。因此，本发明涉及一种包含苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平作为活性成分的组合物，这些活性成分具有促进胶原蛋白合成的作用。
苯妥英和丙戊酸已被广泛用作抗震颤剂而用于治疗癫痫，有关它们对于胶原蛋白合成的作用已有报道(USP5686489；Minerva Stomatol.，47(9)387-398，Sep.1998)。环孢菌素A已被广泛用作免疫抑制剂，用于抑制移植后组织的排异反应，其对于胶原蛋白合成的作用已有报道(J Periodontol.，72(7)921-931，Jul.2001)。硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，已被用作钙离子通道拮抗剂，有关它们对于胶原蛋白合成的作用也有报道(J Periodontol.，72(8)Aug.2001Proc NatlAcad Sci USA，93(11)5478-5482，May 1996；J Urol.，156(6)2067-2072，Dec.1996)。但是，上述药物作为皮肤外用药剂施用于皮肤之上以防止和减轻皮肤皱纹的做法尚无报道。
具体实施例方式
辅以试验性实施例和实施例，以下将详细描述一种用于防止和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物。试验性实施例1本发明活性成分对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用为在细胞水平上观察本发明活性成分对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用，将各活性成分加到人成纤维细胞培养液中，对Martens所提出的方法(Gut，331664-1670，1992)进行改进，测量所合成的胶原蛋白，以评价活性成分的作用。实验规程具体如下。
将人成纤维细胞转入24孔板中并在一种含有10％胎牛血清(FBS)的培养液中培养24小时，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。将细胞置于包含1％FBS、以及活性成分终浓度为10-8至10-5M的培养液中温育，所述活性成分是苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。温育1小时后向培养液中加入10μCi3H-脯氨酸/孔，然后再温育24小时。温育结束后收集各组细胞并将各培养液分成两份。其中一份用胶原蛋白酶处理。向各份培养液中加入三氯乙酸以沉淀蛋白。测量胶原蛋白酶敏感蛋白所结合的放射性的量，并与未用胶原蛋白酶处理的部分进行比较。放射性的差异是因为化合物的促进作用所导致的。没有添加活性成分的样品作为对照组，其胶原蛋白合成量定为100％。实验结果见下表1。
表1对于成纤维细胞中胶原蛋白形成的促进作用(％)
*胶原蛋白产率＝(实验组胶原蛋白产量/对照组胶原蛋白产量)×100
如表1所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随化合物浓度增加，实验组中活性成分具有促进胶原蛋白形成的作用，胶原蛋白产率最小为182.42％，最大为381.54％，其增幅与浓度相关。这表明本发明的活性成分具有明显促进胶原蛋白合成的作用。试验性实施例2对于大鼠皮肤中胶原蛋白形成的促进作用通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平对于动物皮肤中胶原蛋白形成的促进作用。对Mard L DaCosta等人提出的方法(Surgery，123287-293，1998)进行改进，测量所合成的胶原蛋白。
简而言之，对5周龄雄性SD大鼠进行分组，每组5只。在各大鼠腹部中心位置切开1cm口子，并塞入PVA海绵(Unipoint ind.)。缝合后作为试验组，所试验的各活性成分施用于PVA海绵植入区，剂量为每天200μl，共计10天。解剖后将PVA海绵除去以定量分析羟脯氨酸。向PVA海绵中加入4ml 6N HCl，130℃下水解3小时并将其完全蒸干。加入50ml甲醇，溶液于110℃温育直至HCl被除去。加入1.2ml 50％异丙醇溶解剩余沉淀。搅拌下加入200μl氯胺-T(对甲苯磺酰胺钠三水合物)，放置10分钟。此后加入1.2ml Ehrlich试剂，混匀，溶液于50℃下温育90分钟。所得溶液冷至室温，于558nm下测量吸光度。将1mg羟脯氨酸溶于1ml HCl中，稀释为0、0.2、0.4、0.8、1mg/25μl 6N HCl，由此制备羟脯氨酸标准溶液。标准溶液于130℃下水解3小时。相对于仅采用溶剂的对照组所测得的羟脯氨酸值(100％)，羟脯氨酸的定量值列于表2中。
表2对于动物皮肤中胶原蛋白形成的促进作用(％)
*胶原蛋白产率＝(实验组羟脯氨酸值/对照组羟脯氨酸值)×100如表2所示，与不含本发明活性成分的对照组相比，随化合物浓度增加，实验组中活性成分具有促进胶原蛋白产量的作用，最小为122.44％，最大为185.88％，其增幅与浓度相关。这表明本发明的活性成分具有明显促进胶原蛋白合成的作用。试验性实施例3对于无毛小鼠皱纹产生的抑制作用通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于无毛小鼠皱纹产生的抑制作用。
将6周龄无毛小鼠分为21个试验组和3个对照组，每组10只。对于试验组，在小鼠皮肤上施用各化合物，浓度为10-8至10-3M。对照组仅施用不含活性成分的溶剂。实验规程具体如下。采用模拟阳光照射无毛小鼠，照射剂量为2MED(造成皮肤发红的最小剂量的2倍)，每周照射3天共照射12周，以此造成皱纹。将各活性成分或溶剂施用于皮肤之上，每天2次(具体而言在照射前和照射后30min施用)，每次100μ1，自照射之日起共计10周。检查对于皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视和照相进行检查。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即无效(分值0)、轻微(分值1)、中等(分值2)和强效(分值3)，将化合物处理组(试验组)与对照组(分值0)进行对比，同时对各组小鼠进行计数。试验数据列于表3a至3c中。
表3a对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
表3b对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
表3c对于无毛小鼠抑制皱纹产生的效应
如表3a至3c所示，对于抑制无毛小鼠皱纹产生而言，本发明活性成分表现出强效抑制的占80％以上。这说明本发明的活性成分具有明显抑制皱纹产生的作用。试验性实施例4减轻无毛小鼠皮肤皱纹的效应通过实验观察本发明活性成分，即苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，对于减轻无毛小鼠皱纹的效应。
将小鼠分为21个试验组和3个对照组，每组10只。对于试验组，在小鼠皮肤上施用各化合物，浓度为10-8至10-3M。对照组仅施用不含活性成分的溶剂。实验规程具体如下。采用模拟阳光照射无毛小鼠，照射剂量为2MED(造成皮肤发红的最小剂量的2倍)，每周照射3天共照射10周，以此造成皱纹。此后将各活性成分或溶剂施用于皮肤之上，每天2次，每次100μl，共计6周。检查对于皱纹产生的抑制程度。利用裸眼目视检查施用化合物的区域并对该区域照相。将抑制皱纹产生的程度分为4级，即不抑制(分值0)、轻微(分值1)、中等(分值2)和强效(分值3)，将化合物处理组(实验组)与对照组(分值0)进行对比，同时对各组小鼠进行计数。试验数据列于表4a至4c中。
表4a减轻无毛小鼠皱纹的效应
表4b减轻无毛小鼠皱纹的效应
表4c减轻无毛小鼠皱纹的效应
如表4a至4c所示，对于减轻无毛小鼠皱纹而言，本发明活性成分表现出强效作用的占约80％以上。这说明本发明的活性成分具有明显减轻皱纹的作用。
采用本发明活性成分促进人、大鼠和小鼠成纤维细胞胶原蛋白合成的评价试验的结果表明，浓度为10-8至10-3M的苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平具有明显促进胶原蛋白合成的作用。
含有本发明活性成分的皮肤外用组合物可以采用任何适用于皮肤的剂型，如霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、气溶胶、贴片或带有微型针的贴片型给药装置。组合物被特制为霜、软膏和涂敷剂，施用于人皮肤之上以减轻皱纹。已经发现他们可以显著降低皱纹密度。
伴随实施例和对照例，以下将详细描述一种用于防止和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物。应注意到这些实施例仅起描述作用，不能认为本发明仅局限于这些实施例。包含本发明活性成分的各种配方的制备适用于皮肤的皮肤外用制剂的配方列于表5至7中，其中采用了本发明的各活性成分以及其它辅助成分。在本发明中制备了局部用于皮肤的软膏、霜、涂敷剂、精油、皮肤软化剂、营养乳液、贴片或带有微型针的贴片型给药装置。应注意到此处仅制备了采用苯妥英和环孢菌素A作为活性成分的组合物，这些实施例并非用于限定配方和活性成分的。
表5软膏的配方(单位重量％)
*聚氧乙烯油基醚磷酸酯表6霜的配方(单位重量％)
表7贴片的配方(单位重量％)
表8精油的配方(单位重量％)
表9皮肤软化剂的配方(单位重量％)
表10营养乳液的配方(单位重量％)
表11贴片的配方(单位重量％)
对于带有微型针的贴片型给药装置，贴片的主体是一个含有药物溶剂的储液池，该储液池含有聚合物支持体以确保贴片的整体性，同时防止药物如苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平渗漏。包含在储液池内部的药物溶剂可以是水、聚乙二醇、乙氧基二乙二醇或乙醇。对于聚合物支持体，可以采用聚乙烯、聚丙烯、无纺布或棉布。上述药物以粉末形式分散于储液池的下部。贴片型装置是一种透皮给药的装置，其特征在于还包含有微针基座和多微针。微针基座可以用纤维素、聚丙烯、碳氟化合物或聚碳酸酯制成，它们具有膨胀性，粘附于皮肤上后溶剂被释放。对于微针，它们被分散且垂直固定于微针基座上并且与皮肤接触。更具体而言，每单位面积(cm2)中将10至50个微针固定于微针基座上，每根针具有一个药物可通过的通道，该通道的直径为1至1000μm，而针外向固定的长度为0.1-1mm。该装置下部有一个粘接层，用于将装置粘附于皮肤之上，粘接层由诸如聚丙烯酸酯或聚丁烯的材料制成。应注意的是粘接层对于皮肤没有副作用并且不被溶剂所溶解。同时，溶剂通过后不会使其粘接性能下降。最后，将一个保护膜贴在粘接层上，当使用装置时，它易于被除去，其作用是防止药物泄漏和保护粘接层。辅以实施例，以下将详细描述本发明，但不能认为本发明仅局限于这些实施例。含有本发明活性成分且带有微针的贴片型装置的制备对照例1将1g 3％的明胶溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到对照基材。实施例1将0.001％的苯妥英加到1g 3％的明胶溶液，混匀。将该溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到含苯妥英的基材。实施例2将0.001％的环孢菌素A加到1g 3％的明胶溶液，混匀。将该溶液倒入带有微针的布(15针/cm2)上，其中微针被垂直固定于布上。将布置于冻干机中真空干燥。由此得到含环孢菌素A的基材。包含本发明活性成分的组合物对于皮肤老化的防治作用的评价为评价上述对照例和实施例以及表5至11所列实施例制备的制剂对于减轻皮肤皱纹的效果，采用年龄在35岁至60岁之间的女性作为实验对象。将760名女性实验对象分为38个组，每组20人。每天将各实施例及对照例涂于实验对象脸上，每天2次，共计3个月(对于表7中的涂敷剂使用35分钟后除去)。3个月后，通过走访调查和皱纹图像分析确定皱纹的减轻程度。对于走访调查而言，与未使用各组合物之前的情况相比较，将皱纹的减轻程度和皮肤弹性增加分为四级，即没有效果、轻微、中等和强效，并对各实验组人员进行统计。实验结果见表12。为进行皱纹的图像分析，在实验开始前用Xantopren(Bayer)取各实验对象眼下区域的摹本，在实验结束后立即取相同区域的另一摹本，将两摹本进行图像分析。通过二维分析测量皱纹密度。相对于实验前皱纹密度，测量结果表示成皱纹减速轻率。结果见表13。
表12女性皮肤皱纹的减轻程度
*计数的实验对象的数目表13减轻女性皱纹密度的效应
如表12所示，本发明的实施例表现出明显的减轻皱纹和增加皮肤弹性的作用。更具体而言，超过80％的实验对象改善效果为强效。如表13所示，当包含本发明活性成分的实施例用于实验对象时，与实验前的情况相比，皱纹密度明显降低，达37％至50％。同样，当使用带有微针的贴片型给药装置时，实施例1和2明显降低了皱纹密度，分别达70％和60％，说明这些实施例的作用效果优于对照例(98％)(实验数据未显示)。
以上实验结果表明，采用软膏、霜、涂敷剂、精油、皮肤软化剂、营养乳液、贴片或带有微型针的贴片型给药装置等形式对皮肤局部给药时，因内部或外部因素所造成的皮肤皱纹明显减轻。
从上述描述中可见，本发明提出了一种皮肤外用组合物，其中包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平，该组合物表现出抑制、减轻和防止皮肤老化如皮肤皱纹的作用。
为起到描述的目的，在此已经公开了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，在不背离所附权利要求所界定的本发明范围和精神的基础上，有可能对本发明进行多种的改进、增添和替代。
权利要求
1.一种预防和减轻皮肤皱纹的皮肤外用组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。
2.如权利要求1所述分组合物，其中以组合物总重计，活性成分的含量为0.00001至30重量％。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该组合物为霜、软膏、乳液、皮肤滋养液、凝胶剂、涂敷剂、贴片或带有微针的贴片型给药装置的形式。
全文摘要
本发明公开了一种预防和减轻皮肤皱纹的组合物，其包含一种或多种促进胶原蛋白合成的活性成分，所述活性成分选自苯妥英、丙戊酸、环孢菌素A、硝苯地平、地尔硫卓、盐酸维拉帕米和氨氯地平。
文档编号A61K8/64GK1482896SQ01821089
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月19日 优先权日2000年12月20日
发明者李鹤模, 金祥年, 金文武, 安浩井, 卢景玉 申请人:Lg生活健康株式会社
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