一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法
一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法
【专利说明】-种优化的猪干扰素_a 8基因及其表达方法
[0001]
技术领域： 本发明属于生物技术高科技研宄领域，涉及一种优化的猪干扰素-a8基因及其表达 方法。
[0002]
【背景技术】： 目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪瘟病毒（CSFV)、伪狂犬病毒（PRV)和口蹄 疫病毒（FMDV)等病毒性疫病已成为阻碍养猪业持续健康发展的重大问题。每年因病毒感 染而造成的经济损失无法估量。对这些常见的病毒病，虽然有些可用疫苗作常规免疫，但由 于免疫程序、疫苗本身和动物个体等原因，使其在实际应用中的效果并不十分理想。干扰素 (interferon,INF)是由细胞产生的一类诱生性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、抑制 细胞分裂活性和免疫调节活性，是目前应用前景较为广阔的生物制剂之一。干扰素可分为 a、0和Y三大类型。其中《干扰素的抗病毒作用最广、效果最显著。研宄表明，猪干 扰素-a对猪痘病毒（SPV)、猪瘟病毒（CSFV)，猪流感病毒（SIV)、水泡性口炎病毒（VSV)、 传染性胃肠炎病毒（TGEV)、伪狂犬病毒（PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)和口蹄 疫病毒（FMDV)都具有较好的抗病毒作用。更重要的是，猪干扰素-a对口蹄疫病毒等病毒 的感染具有防治作用，有望开发成新型的抗病毒制剂。猪干扰素是一个多基因家族， 包括17个干扰素-a亚型，其中，猪干扰素-a1是研宄得最清楚的干扰素。研宄表明， 不同猪干扰素及其亚型在不同组织细胞中的表达谱不同。猪干扰素-a1、猪干扰素-a8 和猪干扰素-a12几乎在所有的组织中均有表达，提示其在机体正常防御中的重要地位， 从而有望开发成最有效的抗病毒制剂（Sang,Y.，etal.，Differentialexpression andactivityoftheporcinetypeIinterferonfamily.PhysiolGenomics, 2010. 42(2):p. 248-58.)。目前尚未有成功利用基因工程技术手段生产出有活性的猪干扰 素_a8的报道，也无商品化猪干扰素-a8报道。由于猪干扰素-a8在组织中的广泛分布 性和高抗病毒活性，其市场前景非常广阔。
[0003] 大肠杆菌表达系统由于生长快、成本低、表达水平高而成为应用最为广泛的表达 系统，但外源蛋白由于不正确的折叠通常在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。应用大肠 杆菌表达系统制备猪干扰素-a也面临同样的问题。如陈涛等构建的PGEX-IFN/大肠杆 菌表达系统（Chen,T. ,et al.,[Site-directed mutation of PoIFN-alpha and its expression in Escherichia coli].Sheng ffu Gong Cheng Xue Bao, 2002. 18(3): p. 339-42.)、曹瑞兵等构建的pRLC-al/大肠杆菌表达系统（Cao, R.B., et al., [Gene modification and high prokaryotic expression of porcine interferon alpha-1]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2004. 20(2): p. 291-4.)、夏青等构建的pQE3〇-a ac/大 肠杆菌表达系统所表达的猪干扰素-a均以包涵体形式存在（Xia，C.，etal.，Cloning and expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus. Vet Immunol Immunopathol, 2005. 104(1-2):p.81-9.)。猪干扰素-a在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要经变性、复性、 纯化等才能获得具有抗病毒活性的干扰素_a，不仅费时费力，而且得率较低，成为规模化 生产中面临的技术瓶颈。2003年青岛宝依特生物技术研宄所公布了"猪a-干扰素的基因 合成、表达载体构建及产物的制法"(专利申请号为200310109820. 6)，将猪a-干扰素的基 因克隆入pRLC表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2007年中国科学院微生物研宄所公 布了"一种改良重组猪a干扰素蛋白及其编码基因与应用"(专利号为200710176867. 2)， 将猪a-干扰素的基因克隆入PBV220表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。黑龙江省农 业科学院畜牧研宄中心和东北农业大学公布了 "野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及 产物的生产方法"（专利号为200710144345. 4)，将野猪a-干扰素的基因克隆入PWL表达 载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2010年山东罗朗科技有限公司公布了"编码猪a-干扰 素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用"（专利号为201010295921. 7)，将猪a-干扰素的 基因克隆入PQE30表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2011年上海交通大学和上海市 浦东新区动物疫病预防控制中心公布了"一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法" (专利申请号为201110237881. 5)，将猪a和y-干扰素的基因克隆入pET30a表达载体，目 标蛋白以包涵体形式表达。上述专利均未能有效解决猪干扰素在大肠杆菌表达系统中的可 溶性表达问题。
[0004]
【发明内容】
： 本发明的保护范围只由权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节
【发明内容】
的陈 述所限。
[0005] 本发明的目的在于提供一种优化的猪干扰素_a8基因，具有序列表中序列1的核 苷酸序列。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种表达上述猪干扰素_a8基因的方法，包括以下 步骤： (1) 将所述的猪干扰素-a8基因克隆入冷应激表达载体pColdII，构建表达载体 pColdII-PoIFN_a8,转化到宿主细胞中； (2) 从所述宿主细胞中筛选含有所述pColdII-P〇IFN-a8载体的重组细胞； (3) 培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-a8蛋白； 所述方法中使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3); 所述方法中的表达条件为16°C，0. 02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24h。
[0007] 所述方法还包括在非变性条件下，使用Ni2+_柱对所述猪干扰素-a8蛋白进行纯 化的步骤。
[0008] 本发明首次在大肠杆菌系统中表达出有活性的猪干扰素-a8蛋白，具有以下优 占. A. 本发明人工设计合成的猪干扰素-a8基因选用大肠杆菌偏爱密码子，有利于密码 子在大肠杆菌中的识别和表达，从而可达到高效表达的目的； B. 本发明的表达系统有利于重组蛋白的正确折叠，促进了猪干扰素_a8以可溶性形 式表达，该蛋白在非变性条件下经一步纯化即可获得高纯度产品，工序少，生产效率高； C. 本发明获得的可溶性表达的猪干扰素-a8表达量高，能达到100mg/L，为后续规模 化生产打下了良好的基础； D. 上述猪干扰素_a8蛋白实现良好的抗病毒活性，在PK-15细胞上的抗水泡性口炎病 毒（VSV)的活性可达1.0X109U/mg，具有良好的产业应用前景。
[0009]
【附图说明】： 图1是在诱导剂异丙基_B-D-硫代吡喃半乳糖苷不同浓度对所得菌体的上清和沉淀 进行SDS-PAGE实验的结果； 图2是在不同诱导时间对所得菌体的上清和沉淀进行SDS-PAGE实验的结果； 图3是经纯化后的猪干扰素-a8蛋白SDS-PAGE实验的结果； 图4是经纯化后的猪干扰素-a8蛋白WesternBlot(WB)实验的结果。
[0010]
【具体实施方式】： 下面结合具体实施例详细阐述本发明，但并不将本发明限制在所述的【具体实施方式】的 范围中。如无特别说明，本发明各个实施例所用方法均为相关商品化试剂的说明书所列方 法、实验材料均为常规实验材料。
[0011] 实施例1猪干扰素-a8基因的优化设计与合成 根据GenBank上poIFN-a8的氨基酸序列（登录号：ABI26100. 1，氨基酸序列如序列表 中序列2所示）和猪干扰素-(18天然基因序列（登录号：0〇872661.1，0嫩序列如序列表中 序列3所示)，本发明对天然基因序列的密码子进行了优化、设计出编码poIFN-a8成熟蛋 白的基因。
[0012] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数 (CAI)为0. 60,通过密码子优化后，使得本发明的猪干扰素-a8基因在大肠杆菌中CAI 指数为0.80,CAI指数升高表明经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高猪干扰 素-a8基因在大肠杆菌中的表达水平。
[0013] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因在大肠杆菌中的低利用率密码子出 现百分比为13%，而本发明的猪干扰素-a8基因在大肠杆菌中低利用率密码子的出现百分 比为3%，显著提高了翻译的效率。
[0014] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因的GC碱基平均含量为60. 37%，而本 发明的猪干扰素-a8基因GC碱基平均含量为57. 19%。GC碱基过高时容易发生错误配对， 影响基因的表达，将GC含量优化后更利于目的基因的表达，提高其表达水平。
[0015] 该p〇IFN-a成熟蛋白编码基因全长498bp，在其5'端添加起始密码子ATG、在 3'端添加了终止密码子TGA，并分别在两端设计了Ndel和Hindlll酶切位点，得到了本发 明的猪干扰素-a8基因，其完整的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
[0016] 实施例2猪干扰素-a8基因表达载体构建 将实施例1获 得的优化的猪干扰素-a8基因，亚克隆到pColdll载体(购自宝生 物工程（大连）有限公司），转化ToplO感受态菌株(购自上海捷瑞生物工程有限公司）， 挑取单克隆，应用快速质粒小提试剂盒(购自天根生化科技(北京）有限公司）提取质粒， Ndel/Hindlll(购自宝生物工程（大连）有限公司）双酶切和测序鉴定，阳性载体命名为 pColdll-PoIFN-a8。
[0017] 实施例3猪干扰素-a8基因的表达 将鉴定阳性的质粒pColdll-PoIFN-a8转化BL21(DE3)感受态菌株(购自宝生物工程 (大连）有限公司），阳性工程菌接种于LB培养液37°C过夜培养，次日按1%接种量接种于 含10mL新鲜LB培养基的100mL锥形瓶中，37°C振荡培养，当菌液0D600值达0. 6-0. 8时 加入异丙基-0 -D-硫代啦喃半乳糖苷（IPTG)(购自天根生化科技(北京）有限公司），加入 浓度 0.01mM-0.64mM，16°C诱导 12-48h。
[0018] 实施例4猪干扰素-a8基因表达的诱导条件优化 为了获得最佳表达水平，本发明对诱导剂浓度、诱导时间分别进行了优化。
[0019] 诱导剂浓度优化 采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌0D600值达0. 6-0. 8时，分别加入0、0. 01mM、0. 02mM、0. 04mM、0. 08mM、0. 16mM、0. 32mM和 0. 64mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳 糖苷，16°C诱导24h。将诱导表达的菌液于4°C，12000 离心lOmin，将沉淀悬浮于结 合缓冲液（〇. 5MNaCl, 5% (v/v)丙三醇，20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH7.9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计 lOmin)。裂解菌液于4 °C，12 000i-mirT1离心30min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 分析。结果如附图1所示。
[0020] 图中M为蛋白质Marker, 1、3、5、7、9、11、13、15 泳道分别为 0，0.01，0.02， 0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的上清，2、4、 6、 8、10、12、14、16 泳道分别为 0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mM异丙 基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的沉淀。
[0021] 结果表明，表达液上清和沉淀中在约20. 0ku处均有一特异性目的条带，随着 IPTG浓度的增加，沉淀中目标蛋白的浓度不断增加，而上清中可溶性目标蛋白的浓度变化 不明显。当用0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导时，目标蛋白主要以可溶性形 式存在于上清中。
[0022] 诱导时间优化 采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌0D600值达0. 6-0. 8时，加入0. 02mM异 丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷，16°C诱导，分别于诱导后12、24、36、4811取样，所取样品于 raUOOOr.mirT1离心lOmin，将沉淀悬浮于结合缓冲液（0.5MNaCl，5% (v/v)丙三醇， 20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH7. 9)中，混匀，置冰浴进行超声波 破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计lOmin)。裂解菌液于4 °C，12 000i-mirT1 离心30min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果如附图2所示，图中M为蛋白质 Marker, 1、3、5、7泳道分别为0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、24、36、 48h取样的上清，2、4、6、8泳道分别为0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、 24、36、48h取样的沉淀。结果表明，诱导24h后，上清中的目标蛋白浓度达到高峰，而随着诱 导时间的延长，沉淀中的目标蛋白浓度不断增加。
[0023] 实施例5猪干扰素-a8蛋白的分离纯化及鉴定 采用同实施例3相同的实验步骤，在重组菌中加入0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半 乳糖苷，16°C诱导24h。
[0024] 将诱导表达的菌液于4°C，12000 i-mirT1离心10min，将沉淀悬浮于结合缓冲液 (0.5MNaCl, 5% (v/v)丙三醇，20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH 7. 9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计lOmin)。裂 解菌液于4 °C，12 000r'mirf1离心30min，取上清，利用Ni2+柱（His'Bind?Kits蛋白质纯 化试剂盒)进行纯化(购自Novagen公司），收集洗脱下来的目的蛋白，PBS磷酸盐缓冲液（pH 7.4)透析脱盐，收集蛋白液，应用Bradford蛋白质定量试剂盒(购自天根生化科技(北京） 有限公司）测定蛋白浓度，测得蛋白浓度为2mg/mL，1升培养液可收集洗脱蛋白液50mL，则 从1升培养液中可纯化获得l〇〇mg猪干扰素-a8蛋白。纯化蛋白过滤除菌，分装，零下 20°C保存备用。经SDS-PAGE电泳，结果见附图3。图中M为蛋白质Marker，1为表达产物 经超声波破碎离心后的上清，2为上清过柱后的溶液，3为表达上清洗脱的目标蛋白。结果 显示目的蛋白可被Ni2+-柱高效吸附，洗脱后呈单一条带，分离效果较好，经BandScan软件 分析，纯度超过了 95%。将表达的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，用半干转印法转印到硝酸 纤维素膜上，5%脱脂奶封闭过夜，磷酸盐缓冲液（含0. 05%吐温）洗涤3次，加入1: 5000稀 释的PoIFN-a单克隆抗体(购自PBLInterferonSource公司），4°C孵育2h，磷酸盐缓冲 液（含0? 05%吐温）洗涤后加入1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(购自PBLInterferon Source公司），室温孵育2h，磷酸盐缓冲液（含0. 05%吐温）洗涤后，使用DAB二氨基联苯 显色液(购自天根生化科技(北京)有限公司)显色。Westernblot结果见附图4。图中M为蛋 白质Marker,泳道1为2yg纯化的猪干扰素-a8,泳道2为1yg纯化的猪干扰素-a8， 泳道3为0. 5yg纯化的猪干扰素-a8。
[0025] 结果表明，猪干扰素-a8蛋白能与抗poIFN-a的单克隆抗体在目的带20. 0ku 处发生特异性显色反应。
[0026] 实施例6猪干扰素_a8蛋白的抗病毒活性 采用PK-15细胞-VSV(水泡性口炎病毒）（购自中国兽药监察所）系统微量细胞病变 抑制法。将PK-15细胞(购自中国科学院细胞库）接种于96孔培养板，置37°C5%C02温箱 中培养至单层。去除营养液，依次加入系列稀释的本发明制备的猪干扰素-a8,每个稀释 度各加8孔，同设人干扰素a2b(购自北京凯因科技股份有限公司，300万IU/支）标准对 照、细胞对照和病毒对照。37°C5%C02温箱中培养24h。去除干扰素溶液，用100TCID50的 VSV攻击，细胞对照加不含病毒的营养液。48h后在倒置显微镜下观察结果，将抑制细胞病 变减少50%的干扰素的最高稀释度的定为一个干扰素单位。结果测得本发明制备的猪干扰 素_a8抗病毒活性为lxl09U/mg(lxlO9IU/mg)，与接毒对照和空白对照相比，10U猪干扰 素-a8可完全抑制细胞病变的形成。
[0027] 表1本发明猪干扰素_a8蛋白与现有技术生产的猪干扰素_a蛋白对比
【主权项】
1. 一种猪干扰素-a8基因，其特征在于，所述猪干扰素-a8基因含有序列表中序列I 所示的核苷酸序列。
2. -种猪干扰素-a8基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有序列表中序列 1所示的核苷酸序列。
3. -种表达猪干扰素-a8基因的方法，包括以下步骤： (1) 将权利要求1所述的猪干扰素-a8基因克隆入冷应激表达载体pColdII，构建表 达载体pColdII-PoIFN-a8,转化到宿主细胞中； (2) 从所述宿主细胞中筛选含有所述pColdII-PoIFN-a8载体的重组细胞； (3) 培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-a8蛋白。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)的表达条件为16°C，0. 02mM 异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24h。
6. 根据权利要求3~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用 Ni2+-柱对所述猪干扰素-a8蛋白进行纯化的步骤。
【专利摘要】本发明涉及一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法，表达方法包括以下步骤：（1）将所述的猪干扰素-α8基因克隆入冷应激表达载体pCold II，构建表达载体pCold II-PoIFN-α8,转化到宿主细胞中；（2）从所述宿主细胞中筛选含有所述pCold II-PoIFN-α8载体的重组细胞；（3）培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-α8蛋白。本发明首次高效地表达了可溶性的猪干扰素-α8蛋白，生产工序少、生产效率和产量都得到显著提高，且本发明的猪干扰素-α8蛋白的抗病毒活性效果非常优秀。
【IPC分类】C07K14-56, C12N15-21, C12N15-70
【公开号】CN104818283
【申请号】CN201510244475
【发明人】缪德年, 王秀花, 郭佳宏
【申请人】南通海康生物科技有限公司, 上海市农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月14日
【专利说明】-种优化的猪干扰素_a 8基因及其表达方法
[0001]
技术领域： 本发明属于生物技术高科技研宄领域，涉及一种优化的猪干扰素-a8基因及其表达 方法。
[0002]
【背景技术】： 目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪瘟病毒（CSFV)、伪狂犬病毒（PRV)和口蹄 疫病毒（FMDV)等病毒性疫病已成为阻碍养猪业持续健康发展的重大问题。每年因病毒感 染而造成的经济损失无法估量。对这些常见的病毒病，虽然有些可用疫苗作常规免疫，但由 于免疫程序、疫苗本身和动物个体等原因，使其在实际应用中的效果并不十分理想。干扰素 (interferon,INF)是由细胞产生的一类诱生性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、抑制 细胞分裂活性和免疫调节活性，是目前应用前景较为广阔的生物制剂之一。干扰素可分为 a、0和Y三大类型。其中《干扰素的抗病毒作用最广、效果最显著。研宄表明，猪干 扰素-a对猪痘病毒（SPV)、猪瘟病毒（CSFV)，猪流感病毒（SIV)、水泡性口炎病毒（VSV)、 传染性胃肠炎病毒（TGEV)、伪狂犬病毒（PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)和口蹄 疫病毒（FMDV)都具有较好的抗病毒作用。更重要的是，猪干扰素-a对口蹄疫病毒等病毒 的感染具有防治作用，有望开发成新型的抗病毒制剂。猪干扰素是一个多基因家族， 包括17个干扰素-a亚型，其中，猪干扰素-a1是研宄得最清楚的干扰素。研宄表明， 不同猪干扰素及其亚型在不同组织细胞中的表达谱不同。猪干扰素-a1、猪干扰素-a8 和猪干扰素-a12几乎在所有的组织中均有表达，提示其在机体正常防御中的重要地位， 从而有望开发成最有效的抗病毒制剂（Sang,Y.，etal.，Differentialexpression andactivityoftheporcinetypeIinterferonfamily.PhysiolGenomics, 2010. 42(2):p. 248-58.)。目前尚未有成功利用基因工程技术手段生产出有活性的猪干扰 素_a8的报道，也无商品化猪干扰素-a8报道。由于猪干扰素-a8在组织中的广泛分布 性和高抗病毒活性，其市场前景非常广阔。
[0003] 大肠杆菌表达系统由于生长快、成本低、表达水平高而成为应用最为广泛的表达 系统，但外源蛋白由于不正确的折叠通常在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。应用大肠 杆菌表达系统制备猪干扰素-a也面临同样的问题。如陈涛等构建的PGEX-IFN/大肠杆 菌表达系统（Chen,T. ,et al.,[Site-directed mutation of PoIFN-alpha and its expression in Escherichia coli].Sheng ffu Gong Cheng Xue Bao, 2002. 18(3): p. 339-42.)、曹瑞兵等构建的pRLC-al/大肠杆菌表达系统（Cao, R.B., et al., [Gene modification and high prokaryotic expression of porcine interferon alpha-1]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2004. 20(2): p. 291-4.)、夏青等构建的pQE3〇-a ac/大 肠杆菌表达系统所表达的猪干扰素-a均以包涵体形式存在（Xia，C.，etal.，Cloning and expression of interferon-alpha/gamma from a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus. Vet Immunol Immunopathol, 2005. 104(1-2):p.81-9.)。猪干扰素-a在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要经变性、复性、 纯化等才能获得具有抗病毒活性的干扰素_a，不仅费时费力，而且得率较低，成为规模化 生产中面临的技术瓶颈。2003年青岛宝依特生物技术研宄所公布了"猪a-干扰素的基因 合成、表达载体构建及产物的制法"(专利申请号为200310109820. 6)，将猪a-干扰素的基 因克隆入pRLC表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2007年中国科学院微生物研宄所公 布了"一种改良重组猪a干扰素蛋白及其编码基因与应用"(专利号为200710176867. 2)， 将猪a-干扰素的基因克隆入PBV220表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。黑龙江省农 业科学院畜牧研宄中心和东北农业大学公布了 "野猪a-干扰素的基因合成和载体构建及 产物的生产方法"（专利号为200710144345. 4)，将野猪a-干扰素的基因克隆入PWL表达 载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2010年山东罗朗科技有限公司公布了"编码猪a-干扰 素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用"（专利号为201010295921. 7)，将猪a-干扰素的 基因克隆入PQE30表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达。2011年上海交通大学和上海市 浦东新区动物疫病预防控制中心公布了"一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法" (专利申请号为201110237881. 5)，将猪a和y-干扰素的基因克隆入pET30a表达载体，目 标蛋白以包涵体形式表达。上述专利均未能有效解决猪干扰素在大肠杆菌表达系统中的可 溶性表达问题。
[0004]
【发明内容】
： 本发明的保护范围只由权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节
【发明内容】
的陈 述所限。
[0005] 本发明的目的在于提供一种优化的猪干扰素_a8基因，具有序列表中序列1的核 苷酸序列。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种表达上述猪干扰素_a8基因的方法，包括以下 步骤： (1) 将所述的猪干扰素-a8基因克隆入冷应激表达载体pColdII，构建表达载体 pColdII-PoIFN_a8,转化到宿主细胞中； (2) 从所述宿主细胞中筛选含有所述pColdII-P〇IFN-a8载体的重组细胞； (3) 培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-a8蛋白； 所述方法中使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3); 所述方法中的表达条件为16°C，0. 02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24h。
[0007] 所述方法还包括在非变性条件下，使用Ni2+_柱对所述猪干扰素-a8蛋白进行纯 化的步骤。
[0008] 本发明首次在大肠杆菌系统中表达出有活性的猪干扰素-a8蛋白，具有以下优 占. A. 本发明人工设计合成的猪干扰素-a8基因选用大肠杆菌偏爱密码子，有利于密码 子在大肠杆菌中的识别和表达，从而可达到高效表达的目的； B. 本发明的表达系统有利于重组蛋白的正确折叠，促进了猪干扰素_a8以可溶性形 式表达，该蛋白在非变性条件下经一步纯化即可获得高纯度产品，工序少，生产效率高； C. 本发明获得的可溶性表达的猪干扰素-a8表达量高，能达到100mg/L，为后续规模 化生产打下了良好的基础； D. 上述猪干扰素_a8蛋白实现良好的抗病毒活性，在PK-15细胞上的抗水泡性口炎病 毒（VSV)的活性可达1.0X109U/mg，具有良好的产业应用前景。
[0009]
【附图说明】： 图1是在诱导剂异丙基_B-D-硫代吡喃半乳糖苷不同浓度对所得菌体的上清和沉淀 进行SDS-PAGE实验的结果； 图2是在不同诱导时间对所得菌体的上清和沉淀进行SDS-PAGE实验的结果； 图3是经纯化后的猪干扰素-a8蛋白SDS-PAGE实验的结果； 图4是经纯化后的猪干扰素-a8蛋白WesternBlot(WB)实验的结果。
[0010]
【具体实施方式】： 下面结合具体实施例详细阐述本发明，但并不将本发明限制在所述的【具体实施方式】的 范围中。如无特别说明，本发明各个实施例所用方法均为相关商品化试剂的说明书所列方 法、实验材料均为常规实验材料。
[0011] 实施例1猪干扰素-a8基因的优化设计与合成 根据GenBank上poIFN-a8的氨基酸序列（登录号：ABI26100. 1，氨基酸序列如序列表 中序列2所示）和猪干扰素-(18天然基因序列（登录号：0〇872661.1，0嫩序列如序列表中 序列3所示)，本发明对天然基因序列的密码子进行了优化、设计出编码poIFN-a8成熟蛋 白的基因。
[0012] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数 (CAI)为0. 60,通过密码子优化后，使得本发明的猪干扰素-a8基因在大肠杆菌中CAI 指数为0.80,CAI指数升高表明经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高猪干扰 素-a8基因在大肠杆菌中的表达水平。
[0013] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因在大肠杆菌中的低利用率密码子出 现百分比为13%，而本发明的猪干扰素-a8基因在大肠杆菌中低利用率密码子的出现百分 比为3%，显著提高了翻译的效率。
[0014] 密码子没有优化前，猪干扰素-a8天然基因的GC碱基平均含量为60. 37%，而本 发明的猪干扰素-a8基因GC碱基平均含量为57. 19%。GC碱基过高时容易发生错误配对， 影响基因的表达，将GC含量优化后更利于目的基因的表达，提高其表达水平。
[0015] 该p〇IFN-a成熟蛋白编码基因全长498bp，在其5'端添加起始密码子ATG、在 3'端添加了终止密码子TGA，并分别在两端设计了Ndel和Hindlll酶切位点，得到了本发 明的猪干扰素-a8基因，其完整的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
[0016] 实施例2猪干扰素-a8基因表达载体构建 将实施例1获 得的优化的猪干扰素-a8基因，亚克隆到pColdll载体(购自宝生 物工程（大连）有限公司），转化ToplO感受态菌株(购自上海捷瑞生物工程有限公司）， 挑取单克隆，应用快速质粒小提试剂盒(购自天根生化科技(北京）有限公司）提取质粒， Ndel/Hindlll(购自宝生物工程（大连）有限公司）双酶切和测序鉴定，阳性载体命名为 pColdll-PoIFN-a8。
[0017] 实施例3猪干扰素-a8基因的表达 将鉴定阳性的质粒pColdll-PoIFN-a8转化BL21(DE3)感受态菌株(购自宝生物工程 (大连）有限公司），阳性工程菌接种于LB培养液37°C过夜培养，次日按1%接种量接种于 含10mL新鲜LB培养基的100mL锥形瓶中，37°C振荡培养，当菌液0D600值达0. 6-0. 8时 加入异丙基-0 -D-硫代啦喃半乳糖苷（IPTG)(购自天根生化科技(北京）有限公司），加入 浓度 0.01mM-0.64mM，16°C诱导 12-48h。
[0018] 实施例4猪干扰素-a8基因表达的诱导条件优化 为了获得最佳表达水平，本发明对诱导剂浓度、诱导时间分别进行了优化。
[0019] 诱导剂浓度优化 采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌0D600值达0. 6-0. 8时，分别加入0、0. 01mM、0. 02mM、0. 04mM、0. 08mM、0. 16mM、0. 32mM和 0. 64mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳 糖苷，16°C诱导24h。将诱导表达的菌液于4°C，12000 离心lOmin，将沉淀悬浮于结 合缓冲液（〇. 5MNaCl, 5% (v/v)丙三醇，20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH7.9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计 lOmin)。裂解菌液于4 °C，12 000i-mirT1离心30min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 分析。结果如附图1所示。
[0020] 图中M为蛋白质Marker, 1、3、5、7、9、11、13、15 泳道分别为 0，0.01，0.02， 0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的上清，2、4、 6、 8、10、12、14、16 泳道分别为 0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mM异丙 基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导的沉淀。
[0021] 结果表明，表达液上清和沉淀中在约20. 0ku处均有一特异性目的条带，随着 IPTG浓度的增加，沉淀中目标蛋白的浓度不断增加，而上清中可溶性目标蛋白的浓度变化 不明显。当用0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导时，目标蛋白主要以可溶性形 式存在于上清中。
[0022] 诱导时间优化 采用同实施例3相同的实验步骤，当重组菌0D600值达0. 6-0. 8时，加入0. 02mM异 丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷，16°C诱导，分别于诱导后12、24、36、4811取样，所取样品于 raUOOOr.mirT1离心lOmin，将沉淀悬浮于结合缓冲液（0.5MNaCl，5% (v/v)丙三醇， 20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH7. 9)中，混匀，置冰浴进行超声波 破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计lOmin)。裂解菌液于4 °C，12 000i-mirT1 离心30min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果如附图2所示，图中M为蛋白质 Marker, 1、3、5、7泳道分别为0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、24、36、 48h取样的上清，2、4、6、8泳道分别为0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后12、 24、36、48h取样的沉淀。结果表明，诱导24h后，上清中的目标蛋白浓度达到高峰，而随着诱 导时间的延长，沉淀中的目标蛋白浓度不断增加。
[0023] 实施例5猪干扰素-a8蛋白的分离纯化及鉴定 采用同实施例3相同的实验步骤，在重组菌中加入0.02mM异丙基-B-D-硫代吡喃半 乳糖苷，16°C诱导24h。
[0024] 将诱导表达的菌液于4°C，12000 i-mirT1离心10min，将沉淀悬浮于结合缓冲液 (0.5MNaCl, 5% (v/v)丙三醇，20mMTris-HCl,ImM苯甲基磺酰氟，5mM咪唑，pH 7. 9)中，混匀，置冰浴进行超声波破碎(超声功率为400w，工作5s，间隔5s，共计lOmin)。裂 解菌液于4 °C，12 000r'mirf1离心30min，取上清，利用Ni2+柱（His'Bind?Kits蛋白质纯 化试剂盒)进行纯化(购自Novagen公司），收集洗脱下来的目的蛋白，PBS磷酸盐缓冲液（pH 7.4)透析脱盐，收集蛋白液，应用Bradford蛋白质定量试剂盒(购自天根生化科技(北京） 有限公司）测定蛋白浓度，测得蛋白浓度为2mg/mL，1升培养液可收集洗脱蛋白液50mL，则 从1升培养液中可纯化获得l〇〇mg猪干扰素-a8蛋白。纯化蛋白过滤除菌，分装，零下 20°C保存备用。经SDS-PAGE电泳，结果见附图3。图中M为蛋白质Marker，1为表达产物 经超声波破碎离心后的上清，2为上清过柱后的溶液，3为表达上清洗脱的目标蛋白。结果 显示目的蛋白可被Ni2+-柱高效吸附，洗脱后呈单一条带，分离效果较好，经BandScan软件 分析，纯度超过了 95%。将表达的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，用半干转印法转印到硝酸 纤维素膜上，5%脱脂奶封闭过夜，磷酸盐缓冲液（含0. 05%吐温）洗涤3次，加入1: 5000稀 释的PoIFN-a单克隆抗体(购自PBLInterferonSource公司），4°C孵育2h，磷酸盐缓冲 液（含0? 05%吐温）洗涤后加入1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(购自PBLInterferon Source公司），室温孵育2h，磷酸盐缓冲液（含0. 05%吐温）洗涤后，使用DAB二氨基联苯 显色液(购自天根生化科技(北京)有限公司)显色。Westernblot结果见附图4。图中M为蛋 白质Marker,泳道1为2yg纯化的猪干扰素-a8,泳道2为1yg纯化的猪干扰素-a8， 泳道3为0. 5yg纯化的猪干扰素-a8。
[0025] 结果表明，猪干扰素-a8蛋白能与抗poIFN-a的单克隆抗体在目的带20. 0ku 处发生特异性显色反应。
[0026] 实施例6猪干扰素_a8蛋白的抗病毒活性 采用PK-15细胞-VSV(水泡性口炎病毒）（购自中国兽药监察所）系统微量细胞病变 抑制法。将PK-15细胞(购自中国科学院细胞库）接种于96孔培养板，置37°C5%C02温箱 中培养至单层。去除营养液，依次加入系列稀释的本发明制备的猪干扰素-a8,每个稀释 度各加8孔，同设人干扰素a2b(购自北京凯因科技股份有限公司，300万IU/支）标准对 照、细胞对照和病毒对照。37°C5%C02温箱中培养24h。去除干扰素溶液，用100TCID50的 VSV攻击，细胞对照加不含病毒的营养液。48h后在倒置显微镜下观察结果，将抑制细胞病 变减少50%的干扰素的最高稀释度的定为一个干扰素单位。结果测得本发明制备的猪干扰 素_a8抗病毒活性为lxl09U/mg(lxlO9IU/mg)，与接毒对照和空白对照相比，10U猪干扰 素-a8可完全抑制细胞病变的形成。
[0027] 表1本发明猪干扰素_a8蛋白与现有技术生产的猪干扰素_a蛋白对比
【主权项】
1. 一种猪干扰素-a8基因，其特征在于，所述猪干扰素-a8基因含有序列表中序列I 所示的核苷酸序列。
2. -种猪干扰素-a8基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有序列表中序列 1所示的核苷酸序列。
3. -种表达猪干扰素-a8基因的方法，包括以下步骤： (1) 将权利要求1所述的猪干扰素-a8基因克隆入冷应激表达载体pColdII，构建表 达载体pColdII-PoIFN-a8,转化到宿主细胞中； (2) 从所述宿主细胞中筛选含有所述pColdII-PoIFN-a8载体的重组细胞； (3) 培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-a8蛋白。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)的表达条件为16°C，0. 02mM 异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导24h。
6. 根据权利要求3~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用 Ni2+-柱对所述猪干扰素-a8蛋白进行纯化的步骤。
【专利摘要】本发明涉及一种优化的猪干扰素-α8基因及其表达方法，表达方法包括以下步骤：（1）将所述的猪干扰素-α8基因克隆入冷应激表达载体pCold II，构建表达载体pCold II-PoIFN-α8,转化到宿主细胞中；（2）从所述宿主细胞中筛选含有所述pCold II-PoIFN-α8载体的重组细胞；（3）培养所述重组细胞，表达得到猪干扰素-α8蛋白。本发明首次高效地表达了可溶性的猪干扰素-α8蛋白，生产工序少、生产效率和产量都得到显著提高，且本发明的猪干扰素-α8蛋白的抗病毒活性效果非常优秀。
【IPC分类】C07K14-56, C12N15-21, C12N15-70
【公开号】CN104818283
【申请号】CN201510244475
【发明人】缪德年, 王秀花, 郭佳宏
【申请人】南通海康生物科技有限公司, 上海市农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月14日
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