小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用的制作方法
专利名称:小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦TaTOCl基因及其克隆方法与应用，属于农作物转基因技术领域：
。
背景技术：
植物由营养生长阶段向生殖生长阶段的转变，即成花转变，是植物完成整个生活周期的关键步骤。植物开花时间受内在发育信号和外部的环境信号共同控制。近些年来的研究表明，主要有四条途径控制开花，分别为光周期促进途径、自主促进途径、春化促进途径和GA促进途径。光周期现象是生物钟调控的诸多过程的一个特例，它是由生物钟和光信号共同作用的结果。光周期的感应器可以使植物准确地感知日照长度的变化，从而选择性地在合适的季节开花。过量表达LHY/CCA1和TOCl三个基因中的任一个都会导致转基因植株的昼夜节律性的破坏(Schaffer et al., 1998 ；ffang and Tobin, 1998),这说明它们是植物中心振荡器的核心 元件。TOCl基因属于拟南芥PRR基因家族，它编码的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver domain)和 CCT(CO, COL, and T0C1)结构域(Makino etal.，2000)，采用模式化和聚类分析的方法证明了这两个结构域可能分别发挥响应信号和转录调控的功能(Kolmos et al.，2008)。TOCl基因的mRNA和蛋白水平呈现昼夜节律性的积累，这种情况即使是在持续光照或持续黑暗的条件下依然表现的很明显(Strayer etal.,2000 ；Mas et al.，2003b)。但最近的研究发现，TOCl在持续光照条件下的昼夜节律性表达的现象在拟南芥的根里并没有被检测到，而在茎中却有很明显的节律性的TOClmRNA量的积累，这说明TOCl在不同器官中的作用模式很可能不同，这也用分子的证据说明植物不同器官的生物钟是具有特异性的，但并不排除不同器官的生物钟之间的相互联系与调控(James et al.,2008)。
拟南芥TOCl的第562位丙氨酸突变成缬氨酸后产生了 tocl_l，它是一种弱的功能缺失型突变体，tocl-Ι的生物钟的昼夜节律周期相对于野生型拟南芥变短(Somers etal.，1998 ；Strayer et al.，2000)。而拟南芥中增加TOCl的表达时，植株的生物钟周期变长；当TOCl被过量表达时，转基因拟南芥的生物钟则完全变得紊乱(Makino et al.，2002 ；Mas et al.，2003a)。这些都说明TOCl在维持生物钟正常节律方面的重要功能。因此，可以利用植物转基因技术来调节植物的生长发育周期。
长日照植物小麦是世界上重要的粮食作物之一。人们试图通过对育种和栽培方式的探索来改善其产量和品质。传统的主要育种手段之一是引种，即把外地或外国优良的作物品种引入当地，作为推广品种或是育种材料应用。但是小麦要完成从种子到种子的一个生长发育周期，必须通过春化阶段和光照阶段，否则就不能正常结实获取产量。但是由于全球各地的光照、温度等气候条件差异很大，所以引种工作受到很大的限制。如果能够利用生物技术手段调节小麦的生长发育周期，那么引种的范围就能够极大的扩大。
小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。依赖于基因工程的进展可以解决目前我国小麦生产面临的干旱、病虫害以及遗传育种中优良品种引种范围窄等问题。由于小麦的遗传背景较其它作物复杂，遗传转化困难，因此是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电击法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率未超过6 %。由基因枪法等物理转化方法获得的转基因小麦存在外缘基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷。小麦转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今已获得的有经济应用价值的转基因小麦极其有限。
在现有的小麦转化技术中，农杆菌介导的小麦遗传转化一直是国内外相关领域的热点和难点。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次报道了以小麦幼胚和胚性愈伤组织为外植体获得了农杆菌介导的转基因(npt II)再生植株，并提出了一套较为成熟的转化系统。1999年我国的夏光敏也报道了用农杆菌介导法将npt II基因导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，得到转基因植株，转基因频率达到3.7-5.9%，明显高于其它小麦转化研究。但这些转化方法均需经过组织培养再生植株。已有的研究表明小麦不同基因型的受体材料对植株再生有显著影响。目前已知小麦幼胚和胚性愈伤组织的再生能力较高，但受基因型的限制很大，而我国多数生产用小麦当家品种，由愈伤组织分化再生非常困难，这限制了需经组织培养途径进行遗传转化技术的应用。
2005年2月16日公开的公开号为1580257,名称为“ 一种培育转基因小麦的方法及其应用”的中国专利申请中，采用小麦生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，从根本上克服了小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制，获得了表达报告基因的转基因小麦，生长点转化率达到60-70%，成苗率平均90%，从而克服了小麦遗传转化的瓶颈问题-基因型的限制。
上述技术的探索是一种适合于我国小麦的遗传转化方法，克服了当前小麦遗传转化中存在的瓶颈问题。然而，至今为止，通过上述技术转化到小麦中的基因多是报告基因，获得的有经济应用价值的转基因小麦却是少之又少。鉴于以上所述，本发明利用反转录-聚合酶链式反应从小麦中分离出三个同源基因TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D，进一步构建RNAi的表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化小麦CB037，并获得抽穗期提iu的转基因小麦。
缩略语和关键 术语定义:
TOCl =Timing Of CAB I( 一个与 CAB I 的定时有关的基因)；
LHY:Late Elongated Hypocotyl( 一个能导致下胚轴晚延伸的基因)；
CCAl:Circadian Clock Associated I ( 一个与昼夜节律钟相关的基因)；
PRR:Pseudo-Response Regulators ( 一类非典型的响应调节因子)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供小麦TaTOCl基因及其克隆方法和应用。采用如下技术方案:
小麦TaTOCl 基因，包括 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D，TaTOCl-A 核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl-B 核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ;TaT0Cl_D 核苷酸序列为 SEQ ID NO:3。
小麦TaTOCl基因的克隆方法，包括以下步骤:1)利用Trizol试剂盒提取总RNA ；2)第一条链的合成:取2yg总RNA，加入5X反应缓冲液4 μ 1，IOmM脱氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/yl)0.5yU|*oligodT(lyg/yl)lyl，S转录酶(iou/μ 1)2μ 1，42°C反应60分钟，85°C放置10分钟终止反应，稀释至200 μ I ；3)PCR反应；4)基因克隆:取2μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按pMD18-TVector说明书进行；然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板上生长过夜；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜；5)碱法提取质粒DNA ；6)序列测定；7)5'序列的分离。
所述的小麦TaTOCl基因在转基因小麦中的应用。
根据上述技术，从小麦中分离到了 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右开花。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
图1:小麦中 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D 与拟南芥中 TOCl 和水稻中 OsTOCl 的
氨基酸同源性比较。
图2:小麦中TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D与不同植物中PRR家族蛋白之间的进化关系。
图3:利用中国春缺体-四体小麦将TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因定位在六号染色体。
图4 =TaTOCl-A, TaTOCl-B, TaTOCl-D基因在小麦不同组织和器官中的表达分析。茎尖(SAM)，幼根(YR)，幼叶(YL)，节(N)，茎(In)，叶鞘(LS)，老根(MR)，老叶(ML)，幼穗(Spi)。
图5:过表达TaTOCl转基因拟南芥在短日照条件下延迟开花。
图6 =TaTOCl-RNAi转基因小麦长日照条件下提前抽穗。
图7 =TaTOCl-RNAi转基因小麦短日照条件下提前开花。
图5中WT代表野生型；0X-3，_9和-14分别代表过表达TaTOCl转基因拟南芥单株3、9和14。其中，A为转基因和野生型拟南芥的开花比较图；B SPCR鉴定图；C为开花时间统计图。
图6、图7中WT代表野生型，TaTOCl-RNAi代表沉默TaTOCl的转基因小麦。
图6中，长日照条件下，A代表转基因小麦与野生型抽穗比较图；B-E，为PCR鉴定图；F为转基因小麦和野生型小麦抽穗比较图。
图7中，短日照条件下，A代表转基因小麦与野生型抽穗比较图；B-E，为PCR鉴定图；F为转基因小麦和野生型小麦抽穗比较图。
具体实施例
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1:小麦 TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 基因的克隆
1)利用Trizol试剂盒提取总RNA，具体方法如下:
(1)在1.5mL离心管中加入1mL的Trizol试剂。
(2)称取约100mg中国春小麦叶片,液氮研磨,转至上述离心管中。镟润震荡混勻，常温静置5min。
(3) 4°C, 12，OOOrpm离心lOmin。取上清至一新的1.5mL离心管中。
(4)分相
①加0.2mL的氯仿，剧烈摇晃15s，15_30°C静置3min。
②4 ，12，OOOrpm 离心 15min。
(5)沉淀并去除多糖
①取无色水相(大约是原初Trizol体积的60% )至一新的Eppendorf管中。
②加0.25mL异丙醇、0.25mL高盐溶液，颠倒混匀，15_30°C静置lOmin。
③4°C, 12，OOOrpm 离心 IOmin,弃去上清。
(6)清洗
①用200μ L的枪吸除多余上清，加ImL冰预冷的75%乙醇，漩涡震荡。4°C，12, OOOrpm 离心 5min。
②用真空泵吸除乙醇，37°C干燥lOmin。
(7)加适量的DEPC' ddH20( —般为20 μ L)，枪打数次，置于55_60°C溶解lOmin。迅速放于冰浴中静置5min，稍离心。置于-70°C保存。
2)第一条链的合成:取2 μ g总RNA，加入5 X反应缓冲液4 μ I，IOmM脱氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制剂(40-200ιι/μ 1)0.5μ 1，引物 oligodT(lyg/y 1)1μ 1，反转录酶(lOu/μ 1)2μ 1，42°C反应60分钟，85°C放置10分钟终止反应，稀释至200 μ I。
3) PCR反应:聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为:
首先将下列试剂混在一起:
2Χ反应缓冲液(25μ I)+脱氧核苷酸混合物(dNTP) (4μ I)+正向引物(5 μ Μ，4 μ I)+反向引物(5μΜ,4μ I) +模板cDNA(4y I)+TaqDNA聚合酶(0.5 μ I),加水补至总体积 50 μ 10
PCR反应条件为:94°C 3分钟；然后进入下列循环:94°C I分钟，62°C I分钟，72°C I分钟，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。
4)基因克隆:取2μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按宝生物(大连)公司产品PMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_ Π引哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨节青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5)质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
(I)取ImL菌液，12, OOOrpm离心Imin收集菌体,弃去上清。
(2)用ImL STE缓冲液悬浮菌体，离心回收菌体，去尽上清。
(3)加入100 μ L预冷的SolutionI悬浮菌体，强烈振荡混匀。
(4)加入200 μ L新配制的Solution II，温和颠倒5次后，冰浴中放置3min。
(5)加入150 μ L冷的Solution III,温和颠倒IOs,冰浴中放置3_5min,期间颠倒混匀3次。
(6) 12，OOOrpm离心5min,取上清,加入等体积的苯酹/氯仿,振荡混勻。
(7) 12，OOOrpm离心2min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后室温放置2min, 12, OOOrpm 离心 5min,弃去上清。[0062](8)沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温干燥片刻。
(9) 30-50 μ L ddH20溶解沉淀，电泳检测并测定0D260，_20°C保存。
6)序列测定:本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
7) 5'序列的分离:按 Clontech 公司的 SMAR TRACE cDNA Amplification Kit 说明书进行。
实施例2:小麦TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D氨基酸序列分析
I) TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 与 TOCl、OsTOCl 的氨基酸序列比对；
(I) NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库中搜索出TOCl (拟南芥，NP_200946)和OsTOCl (水稻，BAD38854)的氨基酸序列。
(2)运用 Vector NTI Explorer 软件，将 TaTOCl-A (SEQ ID NO: 4)、TaTOC 1-B (SEQID NO:5)和TaTOCl-D (SEQ ID NO:6)与TOCl、OsTOCl的氨基酸序列进行比对。结果见附图1，小麦 TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 基因全长 cDNA 分别长 2149bp (SEQ ID NO:1),2162bp(SEQ ID NO:2)和 2143bp (SEQ ID NO:3)，分别包含长度为 1551bp、1551bp 和 1563bp的开放阅读框架，相应的编码516aa、516aa和520aa。
将TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D与T0Cl、0sT0Cl的氨基酸序列进行比对发现，TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 与 TOCl (拟南芥，NP_200946)、OsTOCl (水稻，BAD38854)具有较高的同源性，尤其在N端的非典型的接收域(pseudoreceiver-domain)和C端的CCT (CO, COL, and TOCI)结构域，属于PRR家族，为小麦生物钟调控基因中的关键基因。
2)不同物种中PRR家族的蛋白聚类分析
(I)NCBI 数据库中搜索出拟南芥 TOCl (Arabidopsis thaliana, NP_200946)、PRR3 (BAB13744)、PRR5(BAB13743)、PRR7 (BAB13742)、PRR9 (BAB13741)，大麦Ppd-Hl(Hordeum vulgare AAY42111),水稻 OsTOCl (Oryza sativa, BAD38854)、0sPRR37 (BAD38855)、0sPRR73 (BAD38856)、0sPRR95 (BAD38857)，大豆 GmTOCl (Glycine max,ABW87010),栗 CsTOCl(Castanea sativa, AAU20772),冰花 McTOCl(Mesembryanthemumcrystal I inum, AAQ73525)，浮萍 LgPRR37 (Lemna gibba, BAE72700)、LgPRR59 (BAE72701)、LgPRR95 (BAE72702),稀脉萍 LpPRR37(Lemna paucicostata, BAE72697)、LpPRR59(BAE72698)、LpPRR95(BAE72699)。
(2)利用MEGA 4.0软件构建系统进化树，对不同物种中PRR家族的蛋白进行聚类分析发现，小麦TaT0Cl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D蛋白与水稻OsTOCl蛋白的亲缘关系最近(见附图2)
实施例3: TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的组织特异性表达
I)取21°C等长日照(12h光照/12h黑暗)生长条件下15天苗龄小麦的茎尖、幼根及幼叶和90天苗龄小麦的节、茎、叶鞘、老根、老叶及幼穗于液氮中迅速固定。
2)提取总RNA，反转录为cDNA(方法同实施例1)。
3)设计特异性引物:
TaTOCl-AF CCCCCAAAACAGACCAATG (SEQ ID NO:7)
TaTOCl-AR CATAGGCGTCTCAAAAGCTTC (SEQ ID NO:8)
TaTOCl-BF CAATTCCCGAGGAAAGACAC (SEQ ID NO:9)
TaTOCl-BR AATGATCATCCGCACACCAT (SEQ ID NO:10)[0082]TaTOCl-DF GGTATCGAGCACACCAATTCT (SEQ ID NO: 11)
TaTOCl-DR GCAATGATCATCCTCACTCCC (SEQ ID NO:12)
4)以2)中cDNA为模板，进行实时定量RT-PCR反应。
实时定量PCR反应程序是95°C IOs预变性，95°C IOs变性，68°C退火/延伸50s，78°C Is后采集荧光信号，循环40次。从65°C每隔0.5°C采集依次荧光信号直至95°C做溶解曲线分析。结果见附图3，结果显示TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因被定位在六号染色体上。
实施例4: TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的染色体定位
I)改良的CTAB法从中国春缺体-四体小麦叶片中提取基因组DNA
(I)取约0.3g叶片，置于研钵中液氮研磨，加入CTAB提取缓冲液750 μ L。
(2)研磨至匀浆状，将其装入1.5mL离心管中，充分混匀，于65°C水浴中保温Ih (间隔晃动5-6次)。
(3)向离心管中加入等体积的氯仿，轻轻颠倒离心管lOmin，放置片刻。
(4)于 16。。下 10，OOOrpm 离心 IOmin0
(5)取上清液加入2倍体积的预冷无水乙醇中，静置至出现絮状物DNA沉淀。
(6)挑出絮状DNA用70 %乙醇洗1_2次后,干燥,然后用ddH20溶解后保存备用。
2)设计特异性引物:同实施例3中3)。
3)以中国春缺体-四体小麦的基因组DNA为模板，利用上述设计的特异引物组合在高严谨的PCR反应条件下同时进行PCR反应。
反应条件为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，68°C退火加延伸50s，38个循环结束后，4°C保存。PCR反应结束后取15uL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
通过对小麦不同的组织器官进行实时定量RT-PCR检测发现，TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因在所研究的各个组织和器官中均有不同程度的表达，其中在幼叶和老叶中的表达量较高(见附图4)。
实施例5:表达载体的构建
I)过量表达TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因转化拟南芥用表达载体构建
(I)根据分离出的TaTOCl基因的核苷酸序列，设计引物:
正向引物:5'-TCGCAGACCAGCCACCGC-3' (SEQ ID NO: 13)
反向引物:5'-TAATGCCATGTGTATCRCTGA-3' (SEQ ID NO: 14)
以中国春小麦叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
(2)取2 μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按宝生物(大连)公司产品PMD18-T Vector说明书进 行。转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
(3)利用 pMD18-T Vector 的 XbaI 位点与 TaTOCl-A、TaTOCl-B 以及 TaTOCl-D 全长cDNA 3’端非编码区的SpeI位点分别进行双酶切三种重组质粒，同时XbaI和SpeI双酶切pCAM-HA-SDIR载体连接产物转化DH5 α细胞，然后在含卡纳青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
(4)将构建好的表达载体转化农杆菌GV3101。[0107]2)沉默TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因转化小麦用载体的构建
(1)根据TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的核苷酸序列，在它们的同源保守区段设计加有Kpnl、SpeI和BamH1、SacI酶切位点的引物:
TaTRN1-F:5’ -GGGGTACCACTAGTTGCAGTATCCTTTGGTA-3’ (SEQ ID NO:15)
TaTRN1-R:5，-CGGGATCCGAGCTCGCAACTTTCTTCCGATT-3’ (SEQ ID NO:16)
以叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，生成TaRNi片段。
(2)用SpeI和SacI同时双酶切TaTRNi片段和pTCK303，生成重组质粒TaTRN1-pTCK303o 用 KpnI 和 BamHI 同时双酶切 TaTRNi 片段和重组质粒 TaTRNi_pTCK303，生成TaT0Cl-RNA1-pTCK303。被用于农杆菌介导的转基因小麦实验。
实施例6:基因功能分析
1)转基因拟南芥的开花表型分析
(1)种植拟南芥。
(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28°C振荡培养。
(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5%蔗糖，0.1M MgCl2,0.5% SilwetL-77)悬浮，菌液0D600在0.8左右。
(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
(5)收获的种子在筛选培养基(1XMS盐，1%蔗糖，pH 5.7，0.8 %琼脂，潮霉素30 μ g/ml)筛选，得到抗性植株。
(6)将T3代纯合株系种子种于GM培养基上培养，同时种野生型作对照，植株抽花序时统计莲座叶的数目以测量开花时间。结果表明，与野生型相比，转基因植株在短日照条件下延迟开花(见附图5)。
2)转基因小麦的抽穗时间分析
(1)从消毒的授粉后12天的小麦种子种挑出幼胚(大小为1-1.5mm)，盾片朝上接种在预培养培养基(MS基本培养基+30g/l蔗糖+2.4mg/l植物凝胶+0.5mg/l PAA+2mg/IDicamba7PH = 6.0)上，25°C黑暗条件下培养4天，产生的小愈伤组织作为转化受体材料。
(2)收集农杆菌C58C1菌液(OD = 0.7)，用悬浮培养基(1/10MS基本培养基+40g/l麦芽糖+0.75mg/l MgCl2+0.75mg/l MES+10mlMS 维生素(IOOx)+0.5mg/l 谷氛酸胺+0.lmg/I水解酪蛋白+10mg/l葡萄糖+100mg/l维生素C+2.2mg/l Pocloram+39mg/l乙酰丁香酮+0.5mg/l PAA+2mg/1 Dicamba, PH = 5.4)重悬液重悬，转化前加入 Silwet L-77。
(3)将50-80个外植体转移至小培养皿中，室温下侵染30分钟。
(4)将愈伤组织转移至放置无菌滤纸的培养皿中，25°C黑暗条件下共培养2天。
(5)将共培养的愈伤组织转移到筛选培养基(MS基本培养基+MS维生素+30g/l蔗糖 +2mg/l Dicamba, PH = 5.8)上，25°C条件下暗培养 2-3 周。
(6)经过筛选，成活的愈伤组织被转移到分化培养基(MS基本培养基+0.2mg/12,4D+30g/l 鹿糖 +IOmlMS 维生素(IOOx)+0.lg/Ι 维生素 C+8mg/l Agar+250mg/l 羧卞青霉素+25mg/l G418, PH = 6.0)上，22_24°C光照培养 3-4 周。
(7)分化的小苗长到2_3cm时即可转到生根壮苗培养基(1/2MS培养基+250mg/l羧卞青霉素+25mg/l G418，PH = 5.8)上，22_24°C，光照培养3-4周成苗。[0129](8) 50mg/L卡那霉素对TO代种子进行筛选，经4小时浸泡后于平皿中25°C黑暗中萌发48小时，以筛选TO代种子。
(9)卡那霉素筛选后萌发的种子转移到以蛭石为基质的花盆中，在25°C、60%相对湿度、16/8小时光周期培养室中培养。
(10)出第三片叶时，取叶片提取gDNA，PCR鉴定Tl代阳性植株。
(11)T2代种子种植于分别种于25°C /18°C、60 %相对湿度、16/8小时长日照和25°C/18°C、60%相对湿度、10/14小时短日照条件光照培养箱中的光照培养箱，同时种野生型作对照，统计小麦穗抽出苞叶1/2时的日期以测量开花时间。结果见附图6、附图7，结果表明，与野生型相比，转基因植株在不同光照条件下均提前抽穗。
根据上述技术，从小麦中分离到了 TaTOCl-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右开花。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换 都应属于本发明所附权利要求
的保护范围。
权利要求
1.小麦TaTOCl基因在调节转基因小麦抽穗时间中的应用，所述的小麦TaTOCl基因为TaT0Cl-A、TaT0Cl-B、TaT0Cl-D，TaTOCl-A 核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl_B 核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ；TaTOC1-D 核苷酸序 列为 SEQ ID NO:3。
专利摘要
本发明公开了小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用，包括TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D，TaTOC1-A核苷酸序列为SEQ ID NO1；TaTOC1-B核苷酸序列为SEQID NO2；TaTOC1-D核苷酸序列为SEQ ID NO3，根据本发明，从小麦中分离到了TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右抽穗。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/84GKCN102220347 B发布类型授权 专利申请号CN 201110093145
公开日2013年7月3日 申请日期2011年4月14日
发明者张宪省, 赵翔宇, 陈祥彬, 叶兴国, 潘衍有 申请人:山东农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),
技术领域：
本发明涉及小麦TaTOCl基因及其克隆方法与应用，属于农作物转基因技术领域：
。
背景技术：
植物由营养生长阶段向生殖生长阶段的转变，即成花转变，是植物完成整个生活周期的关键步骤。植物开花时间受内在发育信号和外部的环境信号共同控制。近些年来的研究表明，主要有四条途径控制开花，分别为光周期促进途径、自主促进途径、春化促进途径和GA促进途径。光周期现象是生物钟调控的诸多过程的一个特例，它是由生物钟和光信号共同作用的结果。光周期的感应器可以使植物准确地感知日照长度的变化，从而选择性地在合适的季节开花。过量表达LHY/CCA1和TOCl三个基因中的任一个都会导致转基因植株的昼夜节律性的破坏(Schaffer et al., 1998 ；ffang and Tobin, 1998),这说明它们是植物中心振荡器的核心 元件。TOCl基因属于拟南芥PRR基因家族，它编码的蛋白含有非典型的接收域(pseudo-receiver domain)和 CCT(CO, COL, and T0C1)结构域(Makino etal.，2000)，采用模式化和聚类分析的方法证明了这两个结构域可能分别发挥响应信号和转录调控的功能(Kolmos et al.，2008)。TOCl基因的mRNA和蛋白水平呈现昼夜节律性的积累，这种情况即使是在持续光照或持续黑暗的条件下依然表现的很明显(Strayer etal.,2000 ；Mas et al.，2003b)。但最近的研究发现，TOCl在持续光照条件下的昼夜节律性表达的现象在拟南芥的根里并没有被检测到，而在茎中却有很明显的节律性的TOClmRNA量的积累，这说明TOCl在不同器官中的作用模式很可能不同，这也用分子的证据说明植物不同器官的生物钟是具有特异性的，但并不排除不同器官的生物钟之间的相互联系与调控(James et al.,2008)。
拟南芥TOCl的第562位丙氨酸突变成缬氨酸后产生了 tocl_l，它是一种弱的功能缺失型突变体，tocl-Ι的生物钟的昼夜节律周期相对于野生型拟南芥变短(Somers etal.，1998 ；Strayer et al.，2000)。而拟南芥中增加TOCl的表达时，植株的生物钟周期变长；当TOCl被过量表达时，转基因拟南芥的生物钟则完全变得紊乱(Makino et al.，2002 ；Mas et al.，2003a)。这些都说明TOCl在维持生物钟正常节律方面的重要功能。因此，可以利用植物转基因技术来调节植物的生长发育周期。
长日照植物小麦是世界上重要的粮食作物之一。人们试图通过对育种和栽培方式的探索来改善其产量和品质。传统的主要育种手段之一是引种，即把外地或外国优良的作物品种引入当地，作为推广品种或是育种材料应用。但是小麦要完成从种子到种子的一个生长发育周期，必须通过春化阶段和光照阶段，否则就不能正常结实获取产量。但是由于全球各地的光照、温度等气候条件差异很大，所以引种工作受到很大的限制。如果能够利用生物技术手段调节小麦的生长发育周期，那么引种的范围就能够极大的扩大。
小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。依赖于基因工程的进展可以解决目前我国小麦生产面临的干旱、病虫害以及遗传育种中优良品种引种范围窄等问题。由于小麦的遗传背景较其它作物复杂，遗传转化困难，因此是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电击法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率未超过6 %。由基因枪法等物理转化方法获得的转基因小麦存在外缘基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷。小麦转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今已获得的有经济应用价值的转基因小麦极其有限。
在现有的小麦转化技术中，农杆菌介导的小麦遗传转化一直是国内外相关领域的热点和难点。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次报道了以小麦幼胚和胚性愈伤组织为外植体获得了农杆菌介导的转基因(npt II)再生植株，并提出了一套较为成熟的转化系统。1999年我国的夏光敏也报道了用农杆菌介导法将npt II基因导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，得到转基因植株，转基因频率达到3.7-5.9%，明显高于其它小麦转化研究。但这些转化方法均需经过组织培养再生植株。已有的研究表明小麦不同基因型的受体材料对植株再生有显著影响。目前已知小麦幼胚和胚性愈伤组织的再生能力较高，但受基因型的限制很大，而我国多数生产用小麦当家品种，由愈伤组织分化再生非常困难，这限制了需经组织培养途径进行遗传转化技术的应用。
2005年2月16日公开的公开号为1580257,名称为“ 一种培育转基因小麦的方法及其应用”的中国专利申请中，采用小麦生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，从根本上克服了小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制，获得了表达报告基因的转基因小麦，生长点转化率达到60-70%，成苗率平均90%，从而克服了小麦遗传转化的瓶颈问题-基因型的限制。
上述技术的探索是一种适合于我国小麦的遗传转化方法，克服了当前小麦遗传转化中存在的瓶颈问题。然而，至今为止，通过上述技术转化到小麦中的基因多是报告基因，获得的有经济应用价值的转基因小麦却是少之又少。鉴于以上所述，本发明利用反转录-聚合酶链式反应从小麦中分离出三个同源基因TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D，进一步构建RNAi的表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化小麦CB037，并获得抽穗期提iu的转基因小麦。
缩略语和关键 术语定义:
TOCl =Timing Of CAB I( 一个与 CAB I 的定时有关的基因)；
LHY:Late Elongated Hypocotyl( 一个能导致下胚轴晚延伸的基因)；
CCAl:Circadian Clock Associated I ( 一个与昼夜节律钟相关的基因)；
PRR:Pseudo-Response Regulators ( 一类非典型的响应调节因子)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供小麦TaTOCl基因及其克隆方法和应用。采用如下技术方案:
小麦TaTOCl 基因，包括 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D，TaTOCl-A 核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl-B 核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ;TaT0Cl_D 核苷酸序列为 SEQ ID NO:3。
小麦TaTOCl基因的克隆方法，包括以下步骤:1)利用Trizol试剂盒提取总RNA ；2)第一条链的合成:取2yg总RNA，加入5X反应缓冲液4 μ 1，IOmM脱氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/yl)0.5yU|*oligodT(lyg/yl)lyl，S转录酶(iou/μ 1)2μ 1，42°C反应60分钟，85°C放置10分钟终止反应，稀释至200 μ I ；3)PCR反应；4)基因克隆:取2μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按pMD18-TVector说明书进行；然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板上生长过夜；挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜；5)碱法提取质粒DNA ；6)序列测定；7)5'序列的分离。
所述的小麦TaTOCl基因在转基因小麦中的应用。
根据上述技术，从小麦中分离到了 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右开花。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
图1:小麦中 TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D 与拟南芥中 TOCl 和水稻中 OsTOCl 的
氨基酸同源性比较。
图2:小麦中TaTOC 1-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D与不同植物中PRR家族蛋白之间的进化关系。
图3:利用中国春缺体-四体小麦将TaTOC 1-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因定位在六号染色体。
图4 =TaTOCl-A, TaTOCl-B, TaTOCl-D基因在小麦不同组织和器官中的表达分析。茎尖(SAM)，幼根(YR)，幼叶(YL)，节(N)，茎(In)，叶鞘(LS)，老根(MR)，老叶(ML)，幼穗(Spi)。
图5:过表达TaTOCl转基因拟南芥在短日照条件下延迟开花。
图6 =TaTOCl-RNAi转基因小麦长日照条件下提前抽穗。
图7 =TaTOCl-RNAi转基因小麦短日照条件下提前开花。
图5中WT代表野生型；0X-3，_9和-14分别代表过表达TaTOCl转基因拟南芥单株3、9和14。其中，A为转基因和野生型拟南芥的开花比较图；B SPCR鉴定图；C为开花时间统计图。
图6、图7中WT代表野生型，TaTOCl-RNAi代表沉默TaTOCl的转基因小麦。
图6中，长日照条件下，A代表转基因小麦与野生型抽穗比较图；B-E，为PCR鉴定图；F为转基因小麦和野生型小麦抽穗比较图。
图7中，短日照条件下，A代表转基因小麦与野生型抽穗比较图；B-E，为PCR鉴定图；F为转基因小麦和野生型小麦抽穗比较图。
具体实施例
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1:小麦 TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 基因的克隆
1)利用Trizol试剂盒提取总RNA，具体方法如下:
(1)在1.5mL离心管中加入1mL的Trizol试剂。
(2)称取约100mg中国春小麦叶片,液氮研磨,转至上述离心管中。镟润震荡混勻，常温静置5min。
(3) 4°C, 12，OOOrpm离心lOmin。取上清至一新的1.5mL离心管中。
(4)分相
①加0.2mL的氯仿，剧烈摇晃15s，15_30°C静置3min。
②4 ，12，OOOrpm 离心 15min。
(5)沉淀并去除多糖
①取无色水相(大约是原初Trizol体积的60% )至一新的Eppendorf管中。
②加0.25mL异丙醇、0.25mL高盐溶液，颠倒混匀，15_30°C静置lOmin。
③4°C, 12，OOOrpm 离心 IOmin,弃去上清。
(6)清洗
①用200μ L的枪吸除多余上清，加ImL冰预冷的75%乙醇，漩涡震荡。4°C，12, OOOrpm 离心 5min。
②用真空泵吸除乙醇，37°C干燥lOmin。
(7)加适量的DEPC' ddH20( —般为20 μ L)，枪打数次，置于55_60°C溶解lOmin。迅速放于冰浴中静置5min，稍离心。置于-70°C保存。
2)第一条链的合成:取2 μ g总RNA，加入5 X反应缓冲液4 μ I，IOmM脱氧核糖核酸(dNTP)2y 1，核糖核酸酶抑制剂(40-200ιι/μ 1)0.5μ 1，引物 oligodT(lyg/y 1)1μ 1，反转录酶(lOu/μ 1)2μ 1，42°C反应60分钟，85°C放置10分钟终止反应，稀释至200 μ I。
3) PCR反应:聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为:
首先将下列试剂混在一起:
2Χ反应缓冲液(25μ I)+脱氧核苷酸混合物(dNTP) (4μ I)+正向引物(5 μ Μ，4 μ I)+反向引物(5μΜ,4μ I) +模板cDNA(4y I)+TaqDNA聚合酶(0.5 μ I),加水补至总体积 50 μ 10
PCR反应条件为:94°C 3分钟；然后进入下列循环:94°C I分钟，62°C I分钟，72°C I分钟，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。
4)基因克隆:取2μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按宝生物(大连)公司产品PMD18-T Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_ Π引哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨节青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5)质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
(I)取ImL菌液，12, OOOrpm离心Imin收集菌体,弃去上清。
(2)用ImL STE缓冲液悬浮菌体，离心回收菌体，去尽上清。
(3)加入100 μ L预冷的SolutionI悬浮菌体，强烈振荡混匀。
(4)加入200 μ L新配制的Solution II，温和颠倒5次后，冰浴中放置3min。
(5)加入150 μ L冷的Solution III,温和颠倒IOs,冰浴中放置3_5min,期间颠倒混匀3次。
(6) 12，OOOrpm离心5min,取上清,加入等体积的苯酹/氯仿,振荡混勻。
(7) 12，OOOrpm离心2min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后室温放置2min, 12, OOOrpm 离心 5min,弃去上清。[0062](8)沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温干燥片刻。
(9) 30-50 μ L ddH20溶解沉淀，电泳检测并测定0D260，_20°C保存。
6)序列测定:本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
7) 5'序列的分离:按 Clontech 公司的 SMAR TRACE cDNA Amplification Kit 说明书进行。
实施例2:小麦TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D氨基酸序列分析
I) TaTOCl-A、TaTOCl-B, TaTOCl-D 与 TOCl、OsTOCl 的氨基酸序列比对；
(I) NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库中搜索出TOCl (拟南芥，NP_200946)和OsTOCl (水稻，BAD38854)的氨基酸序列。
(2)运用 Vector NTI Explorer 软件，将 TaTOCl-A (SEQ ID NO: 4)、TaTOC 1-B (SEQID NO:5)和TaTOCl-D (SEQ ID NO:6)与TOCl、OsTOCl的氨基酸序列进行比对。结果见附图1，小麦 TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 基因全长 cDNA 分别长 2149bp (SEQ ID NO:1),2162bp(SEQ ID NO:2)和 2143bp (SEQ ID NO:3)，分别包含长度为 1551bp、1551bp 和 1563bp的开放阅读框架，相应的编码516aa、516aa和520aa。
将TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D与T0Cl、0sT0Cl的氨基酸序列进行比对发现，TaT0Cl-A、TaTOCl-B 和 TaTOCl-D 与 TOCl (拟南芥，NP_200946)、OsTOCl (水稻，BAD38854)具有较高的同源性，尤其在N端的非典型的接收域(pseudoreceiver-domain)和C端的CCT (CO, COL, and TOCI)结构域，属于PRR家族，为小麦生物钟调控基因中的关键基因。
2)不同物种中PRR家族的蛋白聚类分析
(I)NCBI 数据库中搜索出拟南芥 TOCl (Arabidopsis thaliana, NP_200946)、PRR3 (BAB13744)、PRR5(BAB13743)、PRR7 (BAB13742)、PRR9 (BAB13741)，大麦Ppd-Hl(Hordeum vulgare AAY42111),水稻 OsTOCl (Oryza sativa, BAD38854)、0sPRR37 (BAD38855)、0sPRR73 (BAD38856)、0sPRR95 (BAD38857)，大豆 GmTOCl (Glycine max,ABW87010),栗 CsTOCl(Castanea sativa, AAU20772),冰花 McTOCl(Mesembryanthemumcrystal I inum, AAQ73525)，浮萍 LgPRR37 (Lemna gibba, BAE72700)、LgPRR59 (BAE72701)、LgPRR95 (BAE72702),稀脉萍 LpPRR37(Lemna paucicostata, BAE72697)、LpPRR59(BAE72698)、LpPRR95(BAE72699)。
(2)利用MEGA 4.0软件构建系统进化树，对不同物种中PRR家族的蛋白进行聚类分析发现，小麦TaT0Cl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D蛋白与水稻OsTOCl蛋白的亲缘关系最近(见附图2)
实施例3: TaT0Cl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的组织特异性表达
I)取21°C等长日照(12h光照/12h黑暗)生长条件下15天苗龄小麦的茎尖、幼根及幼叶和90天苗龄小麦的节、茎、叶鞘、老根、老叶及幼穗于液氮中迅速固定。
2)提取总RNA，反转录为cDNA(方法同实施例1)。
3)设计特异性引物:
TaTOCl-AF CCCCCAAAACAGACCAATG (SEQ ID NO:7)
TaTOCl-AR CATAGGCGTCTCAAAAGCTTC (SEQ ID NO:8)
TaTOCl-BF CAATTCCCGAGGAAAGACAC (SEQ ID NO:9)
TaTOCl-BR AATGATCATCCGCACACCAT (SEQ ID NO:10)[0082]TaTOCl-DF GGTATCGAGCACACCAATTCT (SEQ ID NO: 11)
TaTOCl-DR GCAATGATCATCCTCACTCCC (SEQ ID NO:12)
4)以2)中cDNA为模板，进行实时定量RT-PCR反应。
实时定量PCR反应程序是95°C IOs预变性，95°C IOs变性，68°C退火/延伸50s，78°C Is后采集荧光信号，循环40次。从65°C每隔0.5°C采集依次荧光信号直至95°C做溶解曲线分析。结果见附图3，结果显示TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因被定位在六号染色体上。
实施例4: TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的染色体定位
I)改良的CTAB法从中国春缺体-四体小麦叶片中提取基因组DNA
(I)取约0.3g叶片，置于研钵中液氮研磨，加入CTAB提取缓冲液750 μ L。
(2)研磨至匀浆状，将其装入1.5mL离心管中，充分混匀，于65°C水浴中保温Ih (间隔晃动5-6次)。
(3)向离心管中加入等体积的氯仿，轻轻颠倒离心管lOmin，放置片刻。
(4)于 16。。下 10，OOOrpm 离心 IOmin0
(5)取上清液加入2倍体积的预冷无水乙醇中，静置至出现絮状物DNA沉淀。
(6)挑出絮状DNA用70 %乙醇洗1_2次后,干燥,然后用ddH20溶解后保存备用。
2)设计特异性引物:同实施例3中3)。
3)以中国春缺体-四体小麦的基因组DNA为模板，利用上述设计的特异引物组合在高严谨的PCR反应条件下同时进行PCR反应。
反应条件为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，68°C退火加延伸50s，38个循环结束后，4°C保存。PCR反应结束后取15uL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
通过对小麦不同的组织器官进行实时定量RT-PCR检测发现，TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因在所研究的各个组织和器官中均有不同程度的表达，其中在幼叶和老叶中的表达量较高(见附图4)。
实施例5:表达载体的构建
I)过量表达TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因转化拟南芥用表达载体构建
(I)根据分离出的TaTOCl基因的核苷酸序列，设计引物:
正向引物:5'-TCGCAGACCAGCCACCGC-3' (SEQ ID NO: 13)
反向引物:5'-TAATGCCATGTGTATCRCTGA-3' (SEQ ID NO: 14)
以中国春小麦叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
(2)取2 μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按宝生物(大连)公司产品PMD18-T Vector说明书进 行。转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面涂5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
(3)利用 pMD18-T Vector 的 XbaI 位点与 TaTOCl-A、TaTOCl-B 以及 TaTOCl-D 全长cDNA 3’端非编码区的SpeI位点分别进行双酶切三种重组质粒，同时XbaI和SpeI双酶切pCAM-HA-SDIR载体连接产物转化DH5 α细胞，然后在含卡纳青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
(4)将构建好的表达载体转化农杆菌GV3101。[0107]2)沉默TaTOCl-A、TaTOCl-B和TaTOCl-D基因转化小麦用载体的构建
(1)根据TaTOCl-A、TaTOC 1-B和TaTOCl-D基因的核苷酸序列，在它们的同源保守区段设计加有Kpnl、SpeI和BamH1、SacI酶切位点的引物:
TaTRN1-F:5’ -GGGGTACCACTAGTTGCAGTATCCTTTGGTA-3’ (SEQ ID NO:15)
TaTRN1-R:5，-CGGGATCCGAGCTCGCAACTTTCTTCCGATT-3’ (SEQ ID NO:16)
以叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，生成TaRNi片段。
(2)用SpeI和SacI同时双酶切TaTRNi片段和pTCK303，生成重组质粒TaTRN1-pTCK303o 用 KpnI 和 BamHI 同时双酶切 TaTRNi 片段和重组质粒 TaTRNi_pTCK303，生成TaT0Cl-RNA1-pTCK303。被用于农杆菌介导的转基因小麦实验。
实施例6:基因功能分析
1)转基因拟南芥的开花表型分析
(1)种植拟南芥。
(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28°C振荡培养。
(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5%蔗糖，0.1M MgCl2,0.5% SilwetL-77)悬浮，菌液0D600在0.8左右。
(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
(5)收获的种子在筛选培养基(1XMS盐，1%蔗糖，pH 5.7，0.8 %琼脂，潮霉素30 μ g/ml)筛选，得到抗性植株。
(6)将T3代纯合株系种子种于GM培养基上培养，同时种野生型作对照，植株抽花序时统计莲座叶的数目以测量开花时间。结果表明，与野生型相比，转基因植株在短日照条件下延迟开花(见附图5)。
2)转基因小麦的抽穗时间分析
(1)从消毒的授粉后12天的小麦种子种挑出幼胚(大小为1-1.5mm)，盾片朝上接种在预培养培养基(MS基本培养基+30g/l蔗糖+2.4mg/l植物凝胶+0.5mg/l PAA+2mg/IDicamba7PH = 6.0)上，25°C黑暗条件下培养4天，产生的小愈伤组织作为转化受体材料。
(2)收集农杆菌C58C1菌液(OD = 0.7)，用悬浮培养基(1/10MS基本培养基+40g/l麦芽糖+0.75mg/l MgCl2+0.75mg/l MES+10mlMS 维生素(IOOx)+0.5mg/l 谷氛酸胺+0.lmg/I水解酪蛋白+10mg/l葡萄糖+100mg/l维生素C+2.2mg/l Pocloram+39mg/l乙酰丁香酮+0.5mg/l PAA+2mg/1 Dicamba, PH = 5.4)重悬液重悬，转化前加入 Silwet L-77。
(3)将50-80个外植体转移至小培养皿中，室温下侵染30分钟。
(4)将愈伤组织转移至放置无菌滤纸的培养皿中，25°C黑暗条件下共培养2天。
(5)将共培养的愈伤组织转移到筛选培养基(MS基本培养基+MS维生素+30g/l蔗糖 +2mg/l Dicamba, PH = 5.8)上，25°C条件下暗培养 2-3 周。
(6)经过筛选，成活的愈伤组织被转移到分化培养基(MS基本培养基+0.2mg/12,4D+30g/l 鹿糖 +IOmlMS 维生素(IOOx)+0.lg/Ι 维生素 C+8mg/l Agar+250mg/l 羧卞青霉素+25mg/l G418, PH = 6.0)上，22_24°C光照培养 3-4 周。
(7)分化的小苗长到2_3cm时即可转到生根壮苗培养基(1/2MS培养基+250mg/l羧卞青霉素+25mg/l G418，PH = 5.8)上，22_24°C，光照培养3-4周成苗。[0129](8) 50mg/L卡那霉素对TO代种子进行筛选，经4小时浸泡后于平皿中25°C黑暗中萌发48小时，以筛选TO代种子。
(9)卡那霉素筛选后萌发的种子转移到以蛭石为基质的花盆中，在25°C、60%相对湿度、16/8小时光周期培养室中培养。
(10)出第三片叶时，取叶片提取gDNA，PCR鉴定Tl代阳性植株。
(11)T2代种子种植于分别种于25°C /18°C、60 %相对湿度、16/8小时长日照和25°C/18°C、60%相对湿度、10/14小时短日照条件光照培养箱中的光照培养箱，同时种野生型作对照，统计小麦穗抽出苞叶1/2时的日期以测量开花时间。结果见附图6、附图7，结果表明，与野生型相比，转基因植株在不同光照条件下均提前抽穗。
根据上述技术，从小麦中分离到了 TaTOCl-A、TaTOC 1-B、TaTOC 1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右开花。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换 都应属于本发明所附权利要求
的保护范围。
权利要求
1.小麦TaTOCl基因在调节转基因小麦抽穗时间中的应用，所述的小麦TaTOCl基因为TaT0Cl-A、TaT0Cl-B、TaT0Cl-D，TaTOCl-A 核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 ;TaT0Cl_B 核苷酸序列为 SEQ ID NO:2 ；TaTOC1-D 核苷酸序 列为 SEQ ID NO:3。
专利摘要
本发明公开了小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用，包括TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D，TaTOC1-A核苷酸序列为SEQ ID NO1；TaTOC1-B核苷酸序列为SEQID NO2；TaTOC1-D核苷酸序列为SEQ ID NO3，根据本发明，从小麦中分离到了TaTOC1-A、TaTOC1-B、TaTOC1-D基因，三个基因过量表达能导致转基因拟南芥延迟一周左右开花，它们沉默表达会引起转基因小麦提前5天左右抽穗。小麦是世界性的重要粮食作物，将该基因转入小麦使其降低表达能够调节小麦的抽穗时间，具有非常重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/84GKCN102220347 B发布类型授权 专利申请号CN 201110093145
公开日2013年7月3日 申请日期2011年4月14日
发明者张宪省, 赵翔宇, 陈祥彬, 叶兴国, 潘衍有 申请人:山东农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),
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