具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体的制作方法
专利名称:具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体的制作方法
具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体
本发明是国际申请号为PCT/IB2004/003896，国际申请日为2004年11月5日，进入中国国家阶段日期为2006年7月5日，中国申请号为200480039946. 3，发明名称为“具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体”的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在特别的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，包括特异于人⑶20的嵌合的，primatized或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及产生本发明的ABMs的方法，和将这些ABMs用在治疗疾病中的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化作用和具有改善的治疗特性的ABMs，包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
背景领域
免疫系统和抗-⑶20抗体
包括人的脊椎动物的免疫系统，由许多器官和细胞类型组成，它们逐渐发展到准确和特异性识别，结合和破坏入侵的异种微生物(“抗原”)。淋巴细胞对于免疫系统的正确功能是关键的。这些细胞在胸腺，脾和骨髓(成人)中产生并且代表了在成人循环系统中存在的全部白血细胞的约30%。存在淋巴细胞的两个主要的亚群T细胞和B细胞。T细胞对细胞介导的免疫负责，而B细胞对抗体产生(体液免疫)负责。然而，在典型的免疫应答中，T细胞和B细胞相互依赖地发挥作用当T细胞受体与抗原片段结合时，T细胞被激活，所述抗原片段与在抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合物(“MHS”)糖蛋白结合；这种激活导致生物介质(“白介素)的释放，其刺激B细胞分化和产生针对抗原的抗体 (“免疫球蛋白”)。
在宿主中的每种B细胞表达一种特定类型和特异性的抗体，并且不同的B细胞表达特异于不同抗原的抗体。B细胞增殖和抗体产生作为对异源抗原的反应而强化(spike)， 并且一旦异源抗原已经被中和，两者典型地停止(或相当大地减少)。然而，有时候，特定B 细胞增殖将持续不减弱；这种增殖可以导致被称为“B细胞淋巴瘤”的癌症。
T细胞和B细胞都包括细胞表面蛋白，其可以被用作用于分化和鉴定的“标志物”。 一种这样的人B细胞标志物是人B淋巴细胞-局限性分化抗原Bp35，其被称为“⑶20”。⑶20 在早期前B细胞发展中表达并且保持到血浆细胞分化。特异性地，CD20分子可以调节在激活过程中的步骤，所述激活过程是细胞周期起始和分化所必需的，并且通常在肿瘤性转化 (“肿瘤”)B细胞上以非常高的水平表达。因为⑶20在“恶性”B细胞，即那些未减弱的增殖会导致B细胞淋巴瘤的B细胞上以高水平存在，CD20表面抗原具有充当“靶向”B细胞淋巴瘤的候选物的潜能。
本质上，这些靶向可以如下进行概括例如，通过注射将特异于B细胞的⑶20表面抗原的抗体引入患者。这些抗-CD20抗体特异性地结合正常和恶性B细胞两者(表面上)的CD20细胞表面抗原；与CD20表面抗原结合的抗-CD20抗体可以导致肿瘤性转化B细胞的破坏和减少。此外，具有破坏肿瘤的潜能的化学试剂或放射性标记可以与抗-CD20抗体缀合从而使该试剂特异性地“递送”给，例如肿瘤性转化B细胞。无论方法如何，主要的目的是破坏肿瘤具体的方法可以通过所用的具体的抗-CD20抗体来确定，并因此靶向CD20 抗原的可获得的方法可以相当大地改变。
未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是用于治疗癌症的药，如由美国食品和药物管理局(U. S. Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明用于治疗⑶20阳性B细胞，低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(RituXan ;IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,禾口 Genentech Inc. , San Francisco, CA),用于治疗晚期乳腺癌(GrilIo-Lopez，A. -J.，et al.，Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M.M·，Clin. Ther. 21 :309-18(1999))的曲妥单抗(Herceptin ；Genentech Inc,)，用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉姆单抗(Mylotarg ，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑单抗(CAMPATH ，Millenium Pharmaceuticals/ Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效，还依赖于它们突出的安全模式 (Grillo-Lopez, A. -J. , et al. , Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M. M. , Clin. Ther. 21 :309-18 (1999))。尽管在这些药物上所取得的成就，目前在获得更高特异性抗体活性中存在巨大的目标，所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。鼠单克隆抗体，B-Lyl，是另一种已知特异于人CD20的抗体(Poppema, S. ^P Visser, L.，Biotest Bulletin 3 131-139(1987))。
许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用，并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合激活Fc受体，并且与抑制性配偶体 FcyRIIB 结合程度最小(Clynes, R. A.，et al.，Nature Medicine 6(4) 443-446 (2000) ；Kalergis, A.M.，和 Ravetch，J. V.，J. Exp. Med. 195(12) :1653-1659 (June 2002)。例如，至少一项研究的结果显示Fc γ RIIIa受体特别地与抗体疗法的功效紧密相关 (Cartron,G. , et al.，Blood99 (3) :754-757 (February 2002))。该研究显示对于Fc γ RIIIa 是纯合的患者，与对于Fc y RIIIa是杂合的患者相比，具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与Fc γ RIIIa的更好的体内结合，其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的 ADCC 活性(Cartron，G.，et al.，Blood99(3) :754-757 (February 200 )。
已经报道了对靶向⑶20表面抗原的各种尝试。据报道，鼠(小鼠)单克隆抗体1F5(抗-⑶20抗体)通过持续的静脉内输注被施用给B细胞淋巴瘤患者。据报道，需要极高水平(> 2克)的1F5来减少循环的肿瘤细胞，并且该结果被描述为“瞬时的”。 Press et al. , “ Monoclonal Antibody 1F5(Anti_CD20)Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas. " Blood 69/2:584-591(1987)。关于该方法的潜在问题是非人单克隆抗体 (即，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能度，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶标细胞。此外，非人单克隆抗体可以被人宿主识别为异源蛋白质；因此重复注射这些异源抗体可以导致免疫应答的诱导，其导致有害的过敏性反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体应答，或"HAMA"应答。此外，这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。
报道的提高鼠单克隆抗体有效治疗B细胞疾病的能力的另一种方法是将放射性标记或毒素与抗体结合从而使标记或毒素位于肿瘤位点。例如，上述1F5抗体已经用碘-131(" 131I")进行标记，并且据报道进行了在两个患者中关于生物分布的评价° 见 Eary, J. F. et al. , “ Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8 :1257-1268(1990)；还见，Press，0. W. et al. , “ Treatment of Refractory Non-Hodgkin ' s Lymphoma with Radiolabeled MB-I(Anti-CD37)Antibody " J. Clin. One. 7/8 :1027-1038(1989)(指示用131I-标记的IF_5处理的一个患者获得了“部分应答，，)；Goldenberg, D. M. et al. , “ Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-I3I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J.Clin. One. 9/4 :548-564(1991)(据报道接受多次注射的8个患者中有3个已经发展了 HAMA应答)；Appelbaum, F. R. “ Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin' s Lymphoma" Hem. /One. Clinics of N. A. 5/5 :1013-1025 (1991)(综述文章)；Press, 0. W. et al" Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. “ New England J. Med. 329/17 :1219-12223(1993) (碘-131 标记的抗-CD20 抗体 IF5 和 Bi)；和 Kaminski，M. G. et al “ Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131IAnti-Bl (Anti-CD20) Antibody “ . New England J. Med. 329/7(1993)(碘-131 标记的抗-CD20 抗体 Bl ；下文“Kaminski ”)。毒素(即，化疗试剂诸如多柔比星或丝裂霉素C)也与抗体缀合。见，例如，PCT公布的申请W092/07466(公布于1992年5月14日)。
已经将包括来自两种或更多种不同物种(例如，小鼠和人)的抗体的部分的嵌合抗体发展为“缀合”抗体的备选。例如，Liu，A. Y. et al, “ Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10 :3521-3526 (1987)，描述了定向针对 CD20 抗原的小鼠 / 人嵌合抗体。还见，PCT出版号WO 88/04936。例如，已经批准将利妥昔单抗(RITUXAN )，一种嵌合的抗-CD20抗体用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤。
假定⑶20由B细胞淋巴瘤表达，这种抗原可以充当“靶向”这些淋巴瘤的候选物。 本质上，这种靶向可以如下进行归纳将特异于B细胞上CD20表面抗原的抗体施用于患者。 这些抗-⑶20抗体特异性地结合于正常和恶性B细胞两者(表面上)的⑶20抗原，并且结合在细胞表面上的CD20的抗体导致了肿瘤发生B细胞的破坏和减少。此外，化学试剂，细胞毒素或放射性试剂可以直接或间接连接于抗-⑶20抗体从而使该试剂选择性地“递送” 给CD20抗原表达B细胞。关于这两种方法，主要的目标都是破坏肿瘤。该特异性的方法将取决于所用的特定抗-CD20抗体。因此，显而易见的是靶向CD20抗原的各种方法可以相当大地变化。
该利妥昔单抗(RITUXAN )抗体是遗传改造的嵌合人Υ ι鼠恒定结构域，所述结构域包含定向针对人CD20抗原的单克隆抗体。该嵌合抗体包含人Yl不变结构域并在美国专利号5，736，137 (Andersen et. al.)中以名称“C2B8”进行鉴别，所述专利在1998 年 4 月 17 日被授权，并被转让给 IDEC Pharmaceuticals Corporation。RITUXAN 被批准用于治疗具有复发性或折射性低级或滤泡性，CD20阳性，B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者。体外的作用机制研究已经显示RITUXAN 展示了人补体依赖性细胞毒性(⑶C) (Reff et. al, Blood 83(2) :435-445 (1994))。此外，其显示了测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定中的明显活性。RITUXAN 已经显示具有在胸苷结合测定中的抗增生活性和直接诱导程序性细胞死亡的有限能力，而⑶20抗体则没有显示(Maloney et. al, Blood 88(10) :637a(1996))ο
抗体糖基化
寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性， 对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药物代谢动力学，和特异性生物活性。这些特性可以不仅依赖于寡糖的存在或缺乏，还依赖于寡糖的特异性结构。可以在寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些总结。例如，某些寡糖结构通过与特异性糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除，而其它的可以被抗体结合并且触发不需要的免疫反应。 (Jenkins et al.，Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选宿主，由于它们具有以对于人应用的最相容的形式使蛋白质糖基化的能力。(Cumming et al. , Glycobiology 1 115-30(1991) Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81 (1996))。细菌极少使蛋白质糖基化，并且类似的其它类型的常见宿主，诸如酵母，丝状真菌，昆虫和植物细胞，产生糖基化模式，所述糖基化模式与从血流中快速清除，不理想的免疫相互作用有关，并且在一些特别的情形中，减少生物学活性。在哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是过去的20年间最常用的细胞。除了给出适合的糖基化模式之外，这些细胞容许持续的产生遗传稳定性，高生产性的克隆细胞系。使用无血清培养基，它们可以在简单生物反应器中被培养到高密度，并且容许开发安全和可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾 (BHK)细胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近，还已经测试了来自转基因动物的产物。 (Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
所有的抗体在重链恒定区的保守区域包含糖结构，其中每种同种型都具有N-连接的糖结构的独特阵列，其可变地影响蛋白质排列，分泌或功能活性。(Wright，Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。连接的 N-连接糖的结构取决于加工的程度而相当大地变化，并且可以包括高-甘露糖，多支链以及双触角的复合物寡糖 (Wright, Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。典型地，存在在特定糖基化位点连接的核心寡糖结构的不均勻加工从而使均一的单克隆抗体作为多种糖形存在。类似地，已经显示在抗体糖基化中的主要不同发生在不同细胞系之间，并且在不同培养条件下，甚至观察到对于给定细胞系的微小差异。(Lifely, M. R. et al.，Glycobiology 5(8) :813-22(1995))。
获得潜能的大的增加，同时维持简单的生产过程并潜在地避免明显的，不理想的副作用的一种方式是通过改造它们的寡糖成分增加单克隆抗体的天然的、细胞介导的效应子功能，如在Umafia, P. et al.，Nature Biotechnol. 17 :176-180(1999)和美国专利号6，602，684中所述，将它们全部内容并入作为参考。IgGl型抗体，在癌症的免疫疗法中最常用的抗体是在每个CH2结构域的Asn297具有保守N-连接糖基化位点的糖蛋白。与 Asn297连接的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是
6必要的。(Lifely, M. R.，et al.，Glycobiology5 :813-822(1995) Jefferis, R.，et al.， Immunol Rev.163 :59-76(1998) ；Wright, A.and Morrison, S. L. , Trends Biotechnol. 15 ^-32(1997))。
本发明者在前面显示了 β (l，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“( TΠI”)，其是催化等分寡糖的形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了由改造的CHO细胞产生的抗-成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见 Umana, P. et al. , Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)；和国际公开号 WO 99/54342， 将其全部内容并入作为参考)。抗体chCE7属于未缀合的mAbs的大类，其具有高肿瘤亲和性和特异性，但是当在缺乏&1TIII酶的标准工业化细胞系中生产时，潜能过低而无法进行临床应用(Umana, P.，et al.，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999))。该研究首先显示 ADCC活性的大量增加可以通过将产生抗体的细胞改变为表达&1TIII而获得，其也导致了恒定区(Fe)-关联的，等分的寡糖的比例增加到在天然存在的抗体中发现水平以上，所述寡糖包括等分的，非岩藻糖基化的寡糖。
仍旧存在对于靶向CD20抗原以治疗灵长类动物中的B细胞淋巴瘤的增加的治疗性方法的需要，所述灵长类动物包括，但不限于，人。
发明简述
认识到抗原结合分子(ABMs)的巨大治疗潜能，本发明人开发了生产这些ABMs的方法，所述ABMs具有鼠B-Lyl抗体的结合特异性并且已经进行了糖改造(glycoengineer) 以增加Fc受体结合亲和性和效应子功能。特别地，该方法包括产生重组的，嵌合抗体或其嵌合片段。这些ABMs的功效还通过改变抗体Fc区域的糖基化模式而增加。
因此，在一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括(a)选自由SEQ ID N0. :5， SEQ ID NO. :6 和 SEQ ID NO. :7. (CDRs Vih)组成的组的序列；(b)选自由 SEQ ID N0. :21， SEQ ID NO. :22 和 SEQ ID NO. :23. (CDRs VH_2)和 SEQ ID NO :24 组成的组的序列。在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. :9和SEQ ID NO. 10.(⑶Rs VJ。在一个实施方案中，这些多核苷酸的任一个编码融合的多肽。
在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :2的分离的多核苷酸。在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :4的分离的多核苷酸。在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括选自由 SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ； SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和 SEQ ID No :71组成的组的序列。在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :75的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，这些多核苷酸编码融合的多肽。
本发明还涉及包括与SEQ ID NO :2具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。在另一个方面，本发明涉及包括与SEQ ID NO :4具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。本发明还涉及包括与选自由SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ；SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和SEQ ID No :71组成的组的序列具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。在另一个方面，本发明涉及包括与SEQ ID N0:75具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。
本发明还涉及包括SEQ ID NO :11(整个重链)的多核苷酸，或与SEQ ID NO: 11具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。本发明还涉及包括SEQ ID NO :12(整个轻链)的多核苷酸，或与SEQ ID而12具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。
本发明还涉及编码具有SEQ ID No. :1的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :1的序列的多肽的序列；和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。本发明还涉及编码具有选自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ； SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；和 SEQ ID No 72组成的组的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有选自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2 组成的组的序列的多肽的序列；和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。
在另一个方面中，本发明涉及编码具有SEQ ID No. :3的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :3的序列的多肽的序列；和来自除小鼠外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。在另一个方面中，本发明涉及编码具有SEQ ID No. :76的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :76的序列的多肽的序列； 和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的Vh区域的多肽，或其功能变体，和一段序列，所述序列来自除小鼠之外的物种，编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的/区域的多肽，或其功能变体，和一段序列， 所述序列来自除小鼠之外物种，编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
本发明还涉及包括上述分离的多核苷酸的任一种的表达载体，并且涉及包括这样的表达载体的宿主细胞。在另一个方面，本发明涉及包括上述分离的多核苷酸的任一种的宿主细胞。
在一个方面，本发明涉及分离的多肽，其包括(a)选自由SEQ ID NO. 15，SEQ ID NO. :16 和 SEQ ID NO. :17. (CDRs Vh^1)组成的组的序列；(b)选目由 SEQ ID NO. :25，SEQID NO. J6和SEQ ID NO. :27 (CDRs VH_2)；和SEQ ID NO :28组成的组的序列，其中所述多肽是融合多肽。在另一个方面，本发明涉及分离的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO. :18, SEQ ID NO. :19和SEQ ID NO. :20.(⑶Rs Vj，其中所述多肽是融合的多肽。
本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :1的序列，或其变体。本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :3的序列，或其变体。在一个实施方案中，这些多肽的任何一个还包括人Fc区域。本发明还涉及嵌合的多肽，其包括选自由SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ； SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2组成的组的序列，或其变体。本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :76的序列，或其变体。在一个实施方案中，这些多肽的任何一个还包括人Fc区域。
在另一个方面，本发明涉及这样的多肽，所述多肽包括来自鼠B-Lyl抗体的序列和来自异源多肽的序列，并且涉及包括这样的多肽的抗原结合分子。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是嵌合的。在另一个优选的实施方案中，该抗体是人源化的或primatized。
在另外的方面中，本发明涉及分离的多肽，其包括SEQ ID NO :13，或其变体。在另一个方面中，本发明涉及包括SEQ ID NO :14的分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及ABM，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合⑶20并且是嵌合的。在一个实施方案中，该ABM是抗体或其片段。在另一个实施方案中，ABM是重组抗体，其包括具有选自由 SEQ ID N0. 1 ；SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ； 和SEQ ID No :72组成的组的氨基酸序列的Vh区域。在另一个实施方案中，ABM是重组抗体，其包括具有选自由SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO :76组成的组的氨基酸序列的Vl区域。 在另一个实施方案中，ABM是primatized的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是人源化的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是包括人Fc区域的重组抗体。在另一个实施方案中，上述讨论的ABMs的任一个可以缀合于诸如毒素或放射性标记的部分。
本发明还涉及本发明的ABM，所述ABM具有修饰的寡糖。在一个实施方案中，与未修饰的寡糖相比，修饰的寡糖具有减少的岩藻糖基化。在其它的实施方案中，修饰的寡糖是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，ABM在所述分子的Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化的寡糖或等分的非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，该等分的，非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在一个实施方案中，在所述多肽的Fc区域中，寡糖的至少20%是非岩藻糖基化的或等分的，非岩藻糖基化的。在更优选的实施方案中，寡糖的至少30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%， 65 %，70 %或75 %或更多是非岩藻糖基化的或等分的，非岩藻糖基化的。
本发明还涉及编码上述讨论的ABMs的任一种的多核苷酸，并涉及包括这样的多核苷酸的表达载体和细胞。[0041]本发明还涉及生产ABM的方法，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合⑶20，并且其中所述ABM是嵌合的；所述方法包括(a)在容许编码所述ABM的所述多核苷酸表达的条件下， 在培养基中培养包含编码本发明的ABM的多核苷酸的宿主细胞；和(b)从得到的培养物中回收所述ABM。
在另一个方面，本发明涉及包括本发明的ABM的药物组合物。意欲该药物组合物还可以包含药用载体，佐剂或其组合。
在另一个方面，本发明涉及治疗可通过B细胞消减治疗的疾病的方法。所述方法包括将治疗有效量的本发明的ABM施用给需要其的人受试者。在优选的实施方案中，通过施用ABM来治疗所述疾病，所述ABM是嵌合抗体，或抗体的嵌合片段。
在另一个方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而以足以修饰由该宿主细胞产生的Fc区域中寡糖的量，表达编码具有&1TIII活性的多肽的至少一种核酸，其中所述ABM能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20，并且其中ABM是嵌合的。在一个实施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽。在另一个实施方案中，由宿主细胞产生的ABM是抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，该ABM包括与人IgG的Fc区域等价的区域。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包括鼠B-Lyl抗体的至少一个互补决定区，或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。优选地，这种分离的多核苷酸编码作为抗原结合分子的融合多肽。在一个实施方案中，多核苷酸包括鼠B-Lyl抗体的三个互补决定区，或包含所述三个互补决定区的每个的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。在另一个实施方案中，多核苷酸编码嵌合(例如，人源化)抗体的轻链或重链的整个可变区。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括鼠B-Lyl抗体的至少一个互补决定区的抗原组合分子，或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式，并包含来自异源多肽的序列。在一个实施方案中，抗原结合分子包括鼠B-Lyl抗体的三个互补决定区，或包含所述三个互补决定区的每个的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。在另一个方面，抗原结合分子包括抗体轻链或重链的可变区。在一个特别有用的实施方案中， 抗原结合分子是嵌合的，例如人源化的抗体。本发明还涉及制备这些抗原结合分子的方法， 和将这些分子用在治疗疾病中的应用，所述疾病包括B细胞淋巴瘤。
本发明是对II型抗-⑶20抗体进行了改造从而增加其效应子功能诸如ADCC，同时仍旧保持有效的程序性细胞死亡能力的第一个已知实例。因此，本发明涉及改造的II型抗-CD20抗体，其因为所述改造而具有增加的ADCC并且没有丧失诱导程序性细胞死亡的基本能力。在一个实施方案中，II型抗-CD20抗体已经被改造从而具有在Fc区域中的改变的糖基化模式。在特别的实施方案中，改变的糖基化包括在Fc区域中增加水平的的等分的复合残基。在另一个特别的实施方案中，改变的糖基化包括在Fc区域中减少水平的岩藻糖残基。在另一个实施方案中，II型-抗⑶20抗体已经进行了多肽改造。本发明还涉及制备这样的被改造的II型抗体的方法，和涉及使用这些抗体治疗各种B细胞疾病，包括B细胞淋巴瘤的方法。
本发明的宿主细胞可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，CHO细胞，BHK细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER. C6细胞或杂交瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括编码鼠B-Lyl抗体的/区域或其变体的多核苷酸和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括编码鼠 B-Lyl抗体的Vh区域或其变体的多核苷酸和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。
在另一个方面，本发明涉及这样的宿主细胞，其产生由于修饰了其寡糖而显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能的ABM。在一个实施方案中，增加的结合亲和性针对Fc受体，特别地针对Fc YRIIIA受体。本文考虑的效应子功能可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，增加的Fc-介导的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞引发。
在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞包括至少一个编码具有&1TIII活性的多肽的核酸，其与组成型启动子元件可操作地连接。
在另一个方面中，本发明涉及在宿主细胞中产生ABM的方法，其包括(a)在容许所述ABM产生和容许在所述ABM的Fc区域上存在的寡糖的修饰的条件下，培养这样的宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而表达至少一个编码具有&1TIII活性的融合多肽的多核苷酸；和(b)分离所述ABM ；其中所述ABM能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20并且其中所述 ABM是嵌合的。在一个实施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽，优选地包括&1TIII 的催化结构域和异源高尔基体定居(resident)多肽的高尔基体定位结构域，所述定位结构域选自由下列组成的组甘露糖苷酶II的定位结构域，β (1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶 K "GnTI")的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，β (1，2)-Ν-乙酰葡糖胺转移酶 IK "GnTII")的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在另一个方面，本发明涉及改进由宿主细胞产生的抗-CD20 ABM的糖基化模式的方法，所述方法包括向该宿主细胞引入至少一个本发明的核酸或表达载体。在一个实施方案中，该ABM是抗体或其片段；优选地包括IgG的Fc区域。或者，多肽是融合蛋白质，其包括等价于人IgG的Fc区域的区域。
在一个方面，本发明涉及重组的，嵌合抗体，或其片段，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20并具有减少的岩藻糖基化。
在另一个方面，本发明涉及通过使用融合多肽，来改进本发明的重组抗体或其片段的糖基化的方法，所述融合多肽具有&1ΤΙΙΙ活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结合域。在一个实施方案中，本发明的融合多肽包括&1ΤΙΙΙ的催化结构域。在另一个实施方案中，高尔基体定位结构域选自由下列组成的组甘露糖苷酶II的定位结构域，&ιΤΙ的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，&1ΤΙΙ的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及产生具有修饰的寡糖的重组的，嵌合的抗体或其片段，其中所述修饰的寡糖与未修饰的寡糖相比具有减少的岩藻糖基化。按照本发明，这些修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的，嵌合的抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的等分的，非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的，嵌合的抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有至少20 %的寡糖，所述寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。在优选的实施方案中，在所述多肽的Fc区域中至少30% 的寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。在另一个优选的实施方案中，其中在所述多肽的Fc区域中，至少35%的寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。
在另一个方面，本发明涉及重组的，嵌合的抗体或其片段，其由于其寡糖的修饰而显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在一个实施方案中，增加的结合亲和性针对Fc激活受体。在另一个实施方案中，Fc受体是Fc γ激活受体，特别地 Fc γ RIIIA受体。本文考虑的效应子功能可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞引发。
在另一个方面，本发明涉及重组的，嵌合的抗体片段，其具有鼠B-Lyl抗体的结合特异性并包含Fc区域，所述抗体片段被进行了改造从而具有由本发明的方法的任一个所产生的增加的效应子功能。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :1的序列的多肽和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方法所产生的增加的效应子功能。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :3的序列的多肽和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方法所产生的增加的效应子功能。
在一方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的重组的嵌合的抗体，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的重组的嵌合的抗体片段，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的融合蛋白和药用载体。
本发明还涉及治疗可通过B细胞消减来治疗的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的通过本发明的方法的任一种产生的重组的，嵌合抗体或其片段施用于需要其的人受试者。
附图简述
图1鼠B-Lyl的Vh区域的核苷酸(SEQ ID NO 2)和氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。
图2鼠B-Lyl的Vl区域的核苷酸(SEQ ID NO 4)和氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。
图3利妥昔单丨充 (0)和ch_B_Lyl ( Δ )与在feiji B-淋巴瘤细胞上的⑶20的结
口 O
图4在下列三种不同种类的FCYRIIIa-158V/F基因型的全血中，利妥昔单抗 (0)和ch-B_Lyl ( Δ )导致的B细胞消减㈧来自对于较低亲和性受体纯合的F/F供体的全血；(B)来自对于亲和性受体是杂合的F/V供体的全血；和(C)来自对于较高亲和性受体纯合的V/V供体的全血。
图5嵌合的，抗-⑶20抗体的重链的核苷酸(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQID NO 13)。
图6嵌合的，抗-⑶20抗体的轻链的核苷酸(SEQ ID NO 12)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。
图7鼠B-Lyl抗体CDRs的核苷酸和氨基酸序列。(A) Vh区域的预期CDRs。(B)Vl 区域的预期⑶Rs。
图8糖改造的，嵌合B-Lyl抗体的MALDI-T0F模式。(A)详述特异性峰的百分比的表；(B)糖改造的嵌合B-Lyl的光谱；(C)用Endo-H处理的糖改造的嵌合B-Lyl的光谱。
图9不同的人源化的抗-⑶20抗体与Raji B细胞的结合。在B-HH2构建体和 B-HL8和B-HLll构建体之间的差异存在于构架1和2区域中，其中所有的三个⑶Rs是相同的。B-HL8和B-HLll的FRl和FR2序列来自人VH3类，而完整的B-HH2构架是人VHl来源的。B-HLll是具有单一突变GlulGln的B-HL8的衍生物，其中Gln是B-HH2构建体的氨基酸残基。这意味着GlulGln交换没有改变结合亲和性或强度。在B-HH2和B-HL8之间的其它差异是14FR残基，其中一个或多个将影响该抗体的抗原结合行为。
图10在Raji靶细胞上的人源化的抗-⑶20抗体BHL4-KV1的结合。通过用人种系序列VH1_45的FRl替换B-HH2的FRl，该B-HL4构建体来源自B-HH2抗体。该构建体显示大大减少的抗原结合能力，尽管在FRl中的仅三个位点上具有不同的氨基酸。这些残基位于按照Kabat编号方式的位点2，14，和30处。其中，位点30似乎是最有影响的位点，因为其是⑶Rl的Chothia限定的部分。
图11.在B-HH1，B-HH2，B_HH3和母体抗体B-Iyl之间的结合行为的比较。该数据显示所有的Abs显示相似的EC50值，但是与变体B-HH2和B-HH3相比，B-HHl构建体以更低的强度/化学计量结合。B-HHl可以通过其部分人⑶Rl和⑶R2区域(Kabat定义)，以及在位点28 (Kabat编号方式)上的Ala/Thr多态性，与B-HH2和B-HH3区分。这显示位点观，完整的⑶R1，和/或完整的⑶R2的任一对于抗体/抗原相互作用是重要的。
图12B-HL1，B-HHljP B-Iyl母体抗体的比较。该数据显示在B-HLl构建体中的任何结合活性的缺乏，和与B-Iyl相比，大约一半的B-HHl结合强度/化学计量。B-HLl以及B-HHl两者，基于来自人VHl类的受体构架进行设计。在其它的差异中，B-HLl的位点 71 (Kabat编号方式)构建体是显著的差异，显示其对于抗原结合的推定的重要性。
图13抗-CD20抗体与其抗原的capaicty的荧光细胞计量(Fluorocytometric) 分析。该数据显示B-HL2和B-HL3构建体没有显示CD-20结合活性。
图14在Z-138MCL细胞上的抗-⑶20抗体的程序性细胞死亡。
图15抗-⑶20抗体导致程序性细胞死亡。测定详述将切105细胞/孔接种在M 孔板(5x105细胞/ml)的培养基中。将用于阴性对照的IOmg的各个Ab，PBS或5mM喜树碱(CPT)阳性对照加入孔中。将样品温育ο/η (16小时)，用ArmV-FITC染色，并通过FACS 进行分析。测定以三次重复进行(*)减去对于单独的PBS的信号(单独的PBS对于PR-I 和Ζ-138细胞分别给出8%和2%的ArmV+)。所用的抗体是C2B8 (嵌合的，非糖改造的)； BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的)。注意该测定不包括任何另外的效应细胞，仅是靶加上抗体或对照。
图16以免疫效应细胞造成的抗-⑶20抗体的靶细胞杀伤。测定详述在过夜温育的正常全血细胞中的B细胞消减和通过FACS分析⑶19+/⑶3+。使用PBMCs作为效应物的ADCC，4小时温育，25 1的效应物靶标比率，通过钙荧光素-保留相对于去污剂-裂解 (100% )和无Ab的裂解(0% )测量的靶标杀伤。所用的抗体:C2B8(嵌合的，非糖改造形式)；BHH2-KVl-Wt (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)；BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)。
图17未修饰的，非糖改造的BHH2-KV1人源化的IgGl B-Iyl抗-人⑶20抗体的 PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。
图18糖改造的BHH2_KVlgl人源化的IgGlB-Iyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有β_1， 4-Ν-乙酰葡糖胺转移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因的共表达来进行。
图19糖改造的BHH2_KVlg2人源化的IgGl B-Iyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有 β-1，4-Ν-乙酰葡糖胺转移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因以及编码具有高尔基体 α -甘露糖苷酶II催化活性的酶的基因的共表达来进行。
图20非糖改造和糖改造的抗体与在重组CHO-⑶16细胞表面展示上的人 Fc γ RIIIa受体的结合。
图21非-Fc改造的和Fc改造的抗-⑶20抗体对Z-138MCL细胞造成的程序性细胞死亡。测定详述将切105细胞/孔接种在对孔板(5x105细胞/ml)的培养基中。将用于阴性对照的IOmg的各个Ab，PBS加入孔中。将样品温育ο/η (16小时)，用ArmV-FITC染色，并通过FACS进行分析。测定以三次重复进行。所用的Abs:C2B8=利妥昔单抗(嵌合的，非糖改造形式，与商业形式相同)；BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的-见图6糖基化模式)；BHH2-KVlgl(人源化的，糖改造的-见图7糖基化模式)；BHH2_KVlg2 (人源化的，糖改造的-见图8糖基化模式)。注意这种测定不包括任何另外的效应细胞，仅是靶标加抗体或对照。(*)减去单独的PBS的信号。
发明详述
本文所用的术语如本领域通常所用的，除非如下另外指出。
用于本文时，术语抗体意欲包括整个抗体分子，以及具有Fc区域并保留结合特异性的抗体片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性，所述整个抗体分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和多特异性(例如，二特异性)的抗体。还包括人源化，primatized和嵌合的抗体。
用于本文时，术语Fc区域意欲指IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的范围可以轻微变化，人IgG重链Fc区域通常限定为从位点的氨基酸残基延伸到羧基末端一段。
用于本文时，术语“等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域”意欲包括免疫球蛋白的 Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体，所述改变产生置换，添加，或缺失，但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性) 的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸，而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见，例如 Bowie，J. U. et al. , Science 247:1306-10(1990)。
用于本文时，在其最广义上讲，术语抗原结合分子指特异性结合抗原决定簇的分子。更具体地，结合CD20的抗原结合分子是特异性结合35，000道尔顿的细胞表面的非糖基化磷蛋白的分子，所述细胞表面的非糖基化磷蛋白典型地指通常被称为CD20的人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35。所谓“特异性结合”指结合对于抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。
用于本文时，当用在涉及多肽诸如ABMs中时，术语融合的和嵌合的，指这样的多肽，所述多肽包括来自两个或更多异源多肽的氨基酸序列，诸如来自不同物种的抗体的部分。例如，对于嵌合ABMs而言，非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种，包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；最优选嵌合抗体的可变区与重组抗⑶-20抗体的可变区基本相同，所述抗⑶-20抗体具有鼠B-Lyl的可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。
用于本文时，具有"&1TIII活性"的多肽指这样的多肽，所述多肽能够催化以 β -1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-连接的寡糖中的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示类似于但不必须相同于，β (1， 4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在特别的生物测定中所测量的，具有或不具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为β-1， 4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4.1.144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与&1TIII的剂量依赖性相同，但是与&1TIII活性相比， 基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于&1TIII，候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。
用于本文时，术语变体(或类似物)指通过使用，例如重组DNA技术产生的氨基酸插入，缺失，和置换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的，primatized或人源化的抗原结合分子，其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式置换，添加和/或缺失进行修饰，所述方式基本上不影响抗原(例如，CD20)结合亲和性。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化，或通过用共有序列来替代氨基酸来发现确定哪种氨基酸可以被取代，添加，或缺失而不会破坏目标活性的指导。
或者，编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的“丰余性”来合成或选择。各种密码子置换，诸如产生各种限制性位点的沉默改变可以被引入从而优化克隆到质粒或病毒载体中，或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性， 从而改变特性诸如配体结合亲和性，链间亲和性，或降解/更新率。
优选地，氨基酸“置换”是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代的结果，即保守性氨基酸取代。“保守性”氨基酸置换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、 疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；带正电荷(碱性) 的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1到20个氨基酸的范围内，更优选在1-10个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术和测定得到的重组变体的活性，通过系统性在多肽分子中进行氨基酸插入，缺失或置换来实验性地进行确定。
用于本文时，术语人源化用于指来自非人抗原结合分子，例如，鼠抗体的抗原结合分子，其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性，但是在人中具有更少的免疫原性。这可以通过各种方法来实现，所述方法包括(a)将整个非人的可变结构域移植到人恒定区上从而产生嵌合抗体，(b)仅将非人CDRs移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键的构架残基(例如，对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些)，或(c)移植整个非人的可变结构域，但是通过表面残基的取代用人样切片来“遮蔽”它们。这些方法公开于 Jones et al.，Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,81 6851-6855(1984) ；Morrison 禾口 Oi，Adv. Immunol. ,44 :65-92(1988) ；Verhoeyen et al.， Science,239 :1534-1536(1988) ；Padlan, Molec. Immun. ,28 :489-498(1991) ；Padlan, Molec. Immun. ,31(3) :169-217 (1994)，将它们全部并入本文作为参考。在抗体的重链和轻链可变结构域中的每一个通常存在3个互补决定区，或⑶Rs，(⑶R1，⑶R2和⑶R3)，其侧面是抗体的重链和轻链可变结构域的每个中的四个构架亚区域(即，FRl, FR2，FR3，和 FR4) :FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以，见于特别是美国专利号 6，632，927，和公开的美国申请号2003/0175269中，将它们两者全文并入本文作为参考。
类似地，用于本文时，术语primatized用于指来自非灵长类动物抗原结合分子的抗原结合分子，例如，鼠抗体，其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质，但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。
在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中，用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义，除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语“互补决定区”("CDR")来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这种特别的区域已经在Kabat et al. , U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)禾口 Chothia et al. ,J. Mol.Biol. 196 :901-917(1987)中进行了描述，将它们并入本文作为参考，其中当针对彼此比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。但是，将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。构成如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRs的适合的氨基酸残基在下面的表I中提出作为比较。构成特定 CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定那一种残基构成特定的CDR。
表1.CDR 定义1
KabatChothiaAbMVh CDRl31-3526-3226-35Vh CDR250-6552-5850-58Vh CDR395-10295-10295-102
权利要求
1.分离的多核苷酸,其包括SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10。
2.分离的多核苷酸，其包括SEQID No:2。
3.分离的多核苷酸，其包括SEQID No:4。
4.分离的多核苷酸，其包括与SEQID NO :2具有至少80%同一性的序列，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
5.分离的多核苷酸，其包括与SEQID NO :4具有至少80%同一性的序列，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
6.分离的多核苷酸，其包括a.编码具有SEQID No 1的序列的多肽的序列；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
7.分离的多核苷酸，其包括a.编码具有SEQID No 3的序列的多肽的序列；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
8.分离的多核苷酸，其包括与SEQID N0:11或SEQ ID NO :12具有至少80%同一性的序列。
9.分离的多核苷酸，其包括a. 一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的VH区域的多肽，或其变体；和b来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
10.分离的多核苷酸，其包括a.一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的V区域的多肽，或其变体；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
专利摘要
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在特定的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，其包括特异于人CD20的嵌合的、primatized或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的ABMs的方法，并且涉及使用这些ABMs治疗疾病的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化的ABMs，所述ABMs具有改善的治疗性质，包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
文档编号C12Q1/68GKCN102373214SQ201110285833
公开日2012年3月14日 申请日期2004年11月5日
发明者C·费拉拉, E·默斯纳, P·乌马纳, P·布伦克尔, T·苏特, U·蓬特纳 申请人:格黎卡特生物技术股份公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体
本发明是国际申请号为PCT/IB2004/003896，国际申请日为2004年11月5日，进入中国国家阶段日期为2006年7月5日，中国申请号为200480039946. 3，发明名称为“具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体”的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在特别的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，包括特异于人⑶20的嵌合的，primatized或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及产生本发明的ABMs的方法，和将这些ABMs用在治疗疾病中的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化作用和具有改善的治疗特性的ABMs，包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
背景领域
免疫系统和抗-⑶20抗体
包括人的脊椎动物的免疫系统，由许多器官和细胞类型组成，它们逐渐发展到准确和特异性识别，结合和破坏入侵的异种微生物(“抗原”)。淋巴细胞对于免疫系统的正确功能是关键的。这些细胞在胸腺，脾和骨髓(成人)中产生并且代表了在成人循环系统中存在的全部白血细胞的约30%。存在淋巴细胞的两个主要的亚群T细胞和B细胞。T细胞对细胞介导的免疫负责，而B细胞对抗体产生(体液免疫)负责。然而，在典型的免疫应答中，T细胞和B细胞相互依赖地发挥作用当T细胞受体与抗原片段结合时，T细胞被激活，所述抗原片段与在抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合物(“MHS”)糖蛋白结合；这种激活导致生物介质(“白介素)的释放，其刺激B细胞分化和产生针对抗原的抗体 (“免疫球蛋白”)。
在宿主中的每种B细胞表达一种特定类型和特异性的抗体，并且不同的B细胞表达特异于不同抗原的抗体。B细胞增殖和抗体产生作为对异源抗原的反应而强化(spike)， 并且一旦异源抗原已经被中和，两者典型地停止(或相当大地减少)。然而，有时候，特定B 细胞增殖将持续不减弱；这种增殖可以导致被称为“B细胞淋巴瘤”的癌症。
T细胞和B细胞都包括细胞表面蛋白，其可以被用作用于分化和鉴定的“标志物”。 一种这样的人B细胞标志物是人B淋巴细胞-局限性分化抗原Bp35，其被称为“⑶20”。⑶20 在早期前B细胞发展中表达并且保持到血浆细胞分化。特异性地，CD20分子可以调节在激活过程中的步骤，所述激活过程是细胞周期起始和分化所必需的，并且通常在肿瘤性转化 (“肿瘤”)B细胞上以非常高的水平表达。因为⑶20在“恶性”B细胞，即那些未减弱的增殖会导致B细胞淋巴瘤的B细胞上以高水平存在，CD20表面抗原具有充当“靶向”B细胞淋巴瘤的候选物的潜能。
本质上，这些靶向可以如下进行概括例如，通过注射将特异于B细胞的⑶20表面抗原的抗体引入患者。这些抗-CD20抗体特异性地结合正常和恶性B细胞两者(表面上)的CD20细胞表面抗原；与CD20表面抗原结合的抗-CD20抗体可以导致肿瘤性转化B细胞的破坏和减少。此外，具有破坏肿瘤的潜能的化学试剂或放射性标记可以与抗-CD20抗体缀合从而使该试剂特异性地“递送”给，例如肿瘤性转化B细胞。无论方法如何，主要的目的是破坏肿瘤具体的方法可以通过所用的具体的抗-CD20抗体来确定，并因此靶向CD20 抗原的可获得的方法可以相当大地改变。
未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是用于治疗癌症的药，如由美国食品和药物管理局(U. S. Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明用于治疗⑶20阳性B细胞，低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(RituXan ;IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,禾口 Genentech Inc. , San Francisco, CA),用于治疗晚期乳腺癌(GrilIo-Lopez，A. -J.，et al.，Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M.M·，Clin. Ther. 21 :309-18(1999))的曲妥单抗(Herceptin ；Genentech Inc,)，用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉姆单抗(Mylotarg ，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑单抗(CAMPATH ，Millenium Pharmaceuticals/ Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效，还依赖于它们突出的安全模式 (Grillo-Lopez, A. -J. , et al. , Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M. M. , Clin. Ther. 21 :309-18 (1999))。尽管在这些药物上所取得的成就，目前在获得更高特异性抗体活性中存在巨大的目标，所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。鼠单克隆抗体，B-Lyl，是另一种已知特异于人CD20的抗体(Poppema, S. ^P Visser, L.，Biotest Bulletin 3 131-139(1987))。
许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用，并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合激活Fc受体，并且与抑制性配偶体 FcyRIIB 结合程度最小(Clynes, R. A.，et al.，Nature Medicine 6(4) 443-446 (2000) ；Kalergis, A.M.，和 Ravetch，J. V.，J. Exp. Med. 195(12) :1653-1659 (June 2002)。例如，至少一项研究的结果显示Fc γ RIIIa受体特别地与抗体疗法的功效紧密相关 (Cartron,G. , et al.，Blood99 (3) :754-757 (February 2002))。该研究显示对于Fc γ RIIIa 是纯合的患者，与对于Fc y RIIIa是杂合的患者相比，具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与Fc γ RIIIa的更好的体内结合，其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的 ADCC 活性(Cartron，G.，et al.，Blood99(3) :754-757 (February 200 )。
已经报道了对靶向⑶20表面抗原的各种尝试。据报道，鼠(小鼠)单克隆抗体1F5(抗-⑶20抗体)通过持续的静脉内输注被施用给B细胞淋巴瘤患者。据报道，需要极高水平(> 2克)的1F5来减少循环的肿瘤细胞，并且该结果被描述为“瞬时的”。 Press et al. , “ Monoclonal Antibody 1F5(Anti_CD20)Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas. " Blood 69/2:584-591(1987)。关于该方法的潜在问题是非人单克隆抗体 (即，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能度，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶标细胞。此外，非人单克隆抗体可以被人宿主识别为异源蛋白质；因此重复注射这些异源抗体可以导致免疫应答的诱导，其导致有害的过敏性反应。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体应答，或"HAMA"应答。此外，这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。
报道的提高鼠单克隆抗体有效治疗B细胞疾病的能力的另一种方法是将放射性标记或毒素与抗体结合从而使标记或毒素位于肿瘤位点。例如，上述1F5抗体已经用碘-131(" 131I")进行标记，并且据报道进行了在两个患者中关于生物分布的评价° 见 Eary, J. F. et al. , “ Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8 :1257-1268(1990)；还见，Press，0. W. et al. , “ Treatment of Refractory Non-Hodgkin ' s Lymphoma with Radiolabeled MB-I(Anti-CD37)Antibody " J. Clin. One. 7/8 :1027-1038(1989)(指示用131I-标记的IF_5处理的一个患者获得了“部分应答，，)；Goldenberg, D. M. et al. , “ Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-I3I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J.Clin. One. 9/4 :548-564(1991)(据报道接受多次注射的8个患者中有3个已经发展了 HAMA应答)；Appelbaum, F. R. “ Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin' s Lymphoma" Hem. /One. Clinics of N. A. 5/5 :1013-1025 (1991)(综述文章)；Press, 0. W. et al" Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. “ New England J. Med. 329/17 :1219-12223(1993) (碘-131 标记的抗-CD20 抗体 IF5 和 Bi)；和 Kaminski，M. G. et al “ Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131IAnti-Bl (Anti-CD20) Antibody “ . New England J. Med. 329/7(1993)(碘-131 标记的抗-CD20 抗体 Bl ；下文“Kaminski ”)。毒素(即，化疗试剂诸如多柔比星或丝裂霉素C)也与抗体缀合。见，例如，PCT公布的申请W092/07466(公布于1992年5月14日)。
已经将包括来自两种或更多种不同物种(例如，小鼠和人)的抗体的部分的嵌合抗体发展为“缀合”抗体的备选。例如，Liu，A. Y. et al, “ Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10 :3521-3526 (1987)，描述了定向针对 CD20 抗原的小鼠 / 人嵌合抗体。还见，PCT出版号WO 88/04936。例如，已经批准将利妥昔单抗(RITUXAN )，一种嵌合的抗-CD20抗体用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤。
假定⑶20由B细胞淋巴瘤表达，这种抗原可以充当“靶向”这些淋巴瘤的候选物。 本质上，这种靶向可以如下进行归纳将特异于B细胞上CD20表面抗原的抗体施用于患者。 这些抗-⑶20抗体特异性地结合于正常和恶性B细胞两者(表面上)的⑶20抗原，并且结合在细胞表面上的CD20的抗体导致了肿瘤发生B细胞的破坏和减少。此外，化学试剂，细胞毒素或放射性试剂可以直接或间接连接于抗-⑶20抗体从而使该试剂选择性地“递送” 给CD20抗原表达B细胞。关于这两种方法，主要的目标都是破坏肿瘤。该特异性的方法将取决于所用的特定抗-CD20抗体。因此，显而易见的是靶向CD20抗原的各种方法可以相当大地变化。
该利妥昔单抗(RITUXAN )抗体是遗传改造的嵌合人Υ ι鼠恒定结构域，所述结构域包含定向针对人CD20抗原的单克隆抗体。该嵌合抗体包含人Yl不变结构域并在美国专利号5，736，137 (Andersen et. al.)中以名称“C2B8”进行鉴别，所述专利在1998 年 4 月 17 日被授权，并被转让给 IDEC Pharmaceuticals Corporation。RITUXAN 被批准用于治疗具有复发性或折射性低级或滤泡性，CD20阳性，B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者。体外的作用机制研究已经显示RITUXAN 展示了人补体依赖性细胞毒性(⑶C) (Reff et. al, Blood 83(2) :435-445 (1994))。此外，其显示了测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定中的明显活性。RITUXAN 已经显示具有在胸苷结合测定中的抗增生活性和直接诱导程序性细胞死亡的有限能力，而⑶20抗体则没有显示(Maloney et. al, Blood 88(10) :637a(1996))ο
抗体糖基化
寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性， 对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药物代谢动力学，和特异性生物活性。这些特性可以不仅依赖于寡糖的存在或缺乏，还依赖于寡糖的特异性结构。可以在寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些总结。例如，某些寡糖结构通过与特异性糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除，而其它的可以被抗体结合并且触发不需要的免疫反应。 (Jenkins et al.，Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选宿主，由于它们具有以对于人应用的最相容的形式使蛋白质糖基化的能力。(Cumming et al. , Glycobiology 1 115-30(1991) Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81 (1996))。细菌极少使蛋白质糖基化，并且类似的其它类型的常见宿主，诸如酵母，丝状真菌，昆虫和植物细胞，产生糖基化模式，所述糖基化模式与从血流中快速清除，不理想的免疫相互作用有关，并且在一些特别的情形中，减少生物学活性。在哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是过去的20年间最常用的细胞。除了给出适合的糖基化模式之外，这些细胞容许持续的产生遗传稳定性，高生产性的克隆细胞系。使用无血清培养基，它们可以在简单生物反应器中被培养到高密度，并且容许开发安全和可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾 (BHK)细胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近，还已经测试了来自转基因动物的产物。 (Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
所有的抗体在重链恒定区的保守区域包含糖结构，其中每种同种型都具有N-连接的糖结构的独特阵列，其可变地影响蛋白质排列，分泌或功能活性。(Wright，Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。连接的 N-连接糖的结构取决于加工的程度而相当大地变化，并且可以包括高-甘露糖，多支链以及双触角的复合物寡糖 (Wright, Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。典型地，存在在特定糖基化位点连接的核心寡糖结构的不均勻加工从而使均一的单克隆抗体作为多种糖形存在。类似地，已经显示在抗体糖基化中的主要不同发生在不同细胞系之间，并且在不同培养条件下，甚至观察到对于给定细胞系的微小差异。(Lifely, M. R. et al.，Glycobiology 5(8) :813-22(1995))。
获得潜能的大的增加，同时维持简单的生产过程并潜在地避免明显的，不理想的副作用的一种方式是通过改造它们的寡糖成分增加单克隆抗体的天然的、细胞介导的效应子功能，如在Umafia, P. et al.，Nature Biotechnol. 17 :176-180(1999)和美国专利号6，602，684中所述，将它们全部内容并入作为参考。IgGl型抗体，在癌症的免疫疗法中最常用的抗体是在每个CH2结构域的Asn297具有保守N-连接糖基化位点的糖蛋白。与 Asn297连接的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是
6必要的。(Lifely, M. R.，et al.，Glycobiology5 :813-822(1995) Jefferis, R.，et al.， Immunol Rev.163 :59-76(1998) ；Wright, A.and Morrison, S. L. , Trends Biotechnol. 15 ^-32(1997))。
本发明者在前面显示了 β (l，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“( TΠI”)，其是催化等分寡糖的形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了由改造的CHO细胞产生的抗-成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见 Umana, P. et al. , Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)；和国际公开号 WO 99/54342， 将其全部内容并入作为参考)。抗体chCE7属于未缀合的mAbs的大类，其具有高肿瘤亲和性和特异性，但是当在缺乏&1TIII酶的标准工业化细胞系中生产时，潜能过低而无法进行临床应用(Umana, P.，et al.，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999))。该研究首先显示 ADCC活性的大量增加可以通过将产生抗体的细胞改变为表达&1TIII而获得，其也导致了恒定区(Fe)-关联的，等分的寡糖的比例增加到在天然存在的抗体中发现水平以上，所述寡糖包括等分的，非岩藻糖基化的寡糖。
仍旧存在对于靶向CD20抗原以治疗灵长类动物中的B细胞淋巴瘤的增加的治疗性方法的需要，所述灵长类动物包括，但不限于，人。
发明简述
认识到抗原结合分子(ABMs)的巨大治疗潜能，本发明人开发了生产这些ABMs的方法，所述ABMs具有鼠B-Lyl抗体的结合特异性并且已经进行了糖改造(glycoengineer) 以增加Fc受体结合亲和性和效应子功能。特别地，该方法包括产生重组的，嵌合抗体或其嵌合片段。这些ABMs的功效还通过改变抗体Fc区域的糖基化模式而增加。
因此，在一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括(a)选自由SEQ ID N0. :5， SEQ ID NO. :6 和 SEQ ID NO. :7. (CDRs Vih)组成的组的序列；(b)选自由 SEQ ID N0. :21， SEQ ID NO. :22 和 SEQ ID NO. :23. (CDRs VH_2)和 SEQ ID NO :24 组成的组的序列。在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. :9和SEQ ID NO. 10.(⑶Rs VJ。在一个实施方案中，这些多核苷酸的任一个编码融合的多肽。
在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :2的分离的多核苷酸。在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :4的分离的多核苷酸。在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括选自由 SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ； SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和 SEQ ID No :71组成的组的序列。在另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID No. :75的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，这些多核苷酸编码融合的多肽。
本发明还涉及包括与SEQ ID NO :2具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。在另一个方面，本发明涉及包括与SEQ ID NO :4具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。本发明还涉及包括与选自由SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ；SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和SEQ ID No :71组成的组的序列具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。在另一个方面，本发明涉及包括与SEQ ID N0:75具有至少80%同一性的序列的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。
本发明还涉及包括SEQ ID NO :11(整个重链)的多核苷酸，或与SEQ ID NO: 11具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。本发明还涉及包括SEQ ID NO :12(整个轻链)的多核苷酸，或与SEQ ID而12具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。
本发明还涉及编码具有SEQ ID No. :1的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :1的序列的多肽的序列；和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。本发明还涉及编码具有选自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ； SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；和 SEQ ID No 72组成的组的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有选自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2 组成的组的序列的多肽的序列；和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。
在另一个方面中，本发明涉及编码具有SEQ ID No. :3的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :3的序列的多肽的序列；和来自除小鼠外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。在另一个方面中，本发明涉及编码具有SEQ ID No. :76的序列的嵌合多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸包括编码具有SEQ ID No. :76的序列的多肽的序列； 和来自除了小鼠之外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的Vh区域的多肽，或其功能变体，和一段序列，所述序列来自除小鼠之外的物种，编码具有抗体Fc区域序列的多肽，或其片段。在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的/区域的多肽，或其功能变体，和一段序列， 所述序列来自除小鼠之外物种，编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
本发明还涉及包括上述分离的多核苷酸的任一种的表达载体，并且涉及包括这样的表达载体的宿主细胞。在另一个方面，本发明涉及包括上述分离的多核苷酸的任一种的宿主细胞。
在一个方面，本发明涉及分离的多肽，其包括(a)选自由SEQ ID NO. 15，SEQ ID NO. :16 和 SEQ ID NO. :17. (CDRs Vh^1)组成的组的序列；(b)选目由 SEQ ID NO. :25，SEQID NO. J6和SEQ ID NO. :27 (CDRs VH_2)；和SEQ ID NO :28组成的组的序列，其中所述多肽是融合多肽。在另一个方面，本发明涉及分离的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO. :18, SEQ ID NO. :19和SEQ ID NO. :20.(⑶Rs Vj，其中所述多肽是融合的多肽。
本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :1的序列，或其变体。本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :3的序列，或其变体。在一个实施方案中，这些多肽的任何一个还包括人Fc区域。本发明还涉及嵌合的多肽，其包括选自由SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ； SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2组成的组的序列，或其变体。本发明还涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :76的序列，或其变体。在一个实施方案中，这些多肽的任何一个还包括人Fc区域。
在另一个方面，本发明涉及这样的多肽，所述多肽包括来自鼠B-Lyl抗体的序列和来自异源多肽的序列，并且涉及包括这样的多肽的抗原结合分子。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是嵌合的。在另一个优选的实施方案中，该抗体是人源化的或primatized。
在另外的方面中，本发明涉及分离的多肽，其包括SEQ ID NO :13，或其变体。在另一个方面中，本发明涉及包括SEQ ID NO :14的分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及ABM，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合⑶20并且是嵌合的。在一个实施方案中，该ABM是抗体或其片段。在另一个实施方案中，ABM是重组抗体，其包括具有选自由 SEQ ID N0. 1 ；SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ； 和SEQ ID No :72组成的组的氨基酸序列的Vh区域。在另一个实施方案中，ABM是重组抗体，其包括具有选自由SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO :76组成的组的氨基酸序列的Vl区域。 在另一个实施方案中，ABM是primatized的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是人源化的重组抗体。在另一个实施方案中，ABM是包括人Fc区域的重组抗体。在另一个实施方案中，上述讨论的ABMs的任一个可以缀合于诸如毒素或放射性标记的部分。
本发明还涉及本发明的ABM，所述ABM具有修饰的寡糖。在一个实施方案中，与未修饰的寡糖相比，修饰的寡糖具有减少的岩藻糖基化。在其它的实施方案中，修饰的寡糖是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，ABM在所述分子的Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化的寡糖或等分的非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，该等分的，非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在一个实施方案中，在所述多肽的Fc区域中，寡糖的至少20%是非岩藻糖基化的或等分的，非岩藻糖基化的。在更优选的实施方案中，寡糖的至少30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%， 65 %，70 %或75 %或更多是非岩藻糖基化的或等分的，非岩藻糖基化的。
本发明还涉及编码上述讨论的ABMs的任一种的多核苷酸，并涉及包括这样的多核苷酸的表达载体和细胞。[0041]本发明还涉及生产ABM的方法，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合⑶20，并且其中所述ABM是嵌合的；所述方法包括(a)在容许编码所述ABM的所述多核苷酸表达的条件下， 在培养基中培养包含编码本发明的ABM的多核苷酸的宿主细胞；和(b)从得到的培养物中回收所述ABM。
在另一个方面，本发明涉及包括本发明的ABM的药物组合物。意欲该药物组合物还可以包含药用载体，佐剂或其组合。
在另一个方面，本发明涉及治疗可通过B细胞消减治疗的疾病的方法。所述方法包括将治疗有效量的本发明的ABM施用给需要其的人受试者。在优选的实施方案中，通过施用ABM来治疗所述疾病，所述ABM是嵌合抗体，或抗体的嵌合片段。
在另一个方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而以足以修饰由该宿主细胞产生的Fc区域中寡糖的量，表达编码具有&1TIII活性的多肽的至少一种核酸，其中所述ABM能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20，并且其中ABM是嵌合的。在一个实施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽。在另一个实施方案中，由宿主细胞产生的ABM是抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，该ABM包括与人IgG的Fc区域等价的区域。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包括鼠B-Lyl抗体的至少一个互补决定区，或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式，其中所述分离的多核苷酸编码融合的多肽。优选地，这种分离的多核苷酸编码作为抗原结合分子的融合多肽。在一个实施方案中，多核苷酸包括鼠B-Lyl抗体的三个互补决定区，或包含所述三个互补决定区的每个的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。在另一个实施方案中，多核苷酸编码嵌合(例如，人源化)抗体的轻链或重链的整个可变区。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括鼠B-Lyl抗体的至少一个互补决定区的抗原组合分子，或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式，并包含来自异源多肽的序列。在一个实施方案中，抗原结合分子包括鼠B-Lyl抗体的三个互补决定区，或包含所述三个互补决定区的每个的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。在另一个方面，抗原结合分子包括抗体轻链或重链的可变区。在一个特别有用的实施方案中， 抗原结合分子是嵌合的，例如人源化的抗体。本发明还涉及制备这些抗原结合分子的方法， 和将这些分子用在治疗疾病中的应用，所述疾病包括B细胞淋巴瘤。
本发明是对II型抗-⑶20抗体进行了改造从而增加其效应子功能诸如ADCC，同时仍旧保持有效的程序性细胞死亡能力的第一个已知实例。因此，本发明涉及改造的II型抗-CD20抗体，其因为所述改造而具有增加的ADCC并且没有丧失诱导程序性细胞死亡的基本能力。在一个实施方案中，II型抗-CD20抗体已经被改造从而具有在Fc区域中的改变的糖基化模式。在特别的实施方案中，改变的糖基化包括在Fc区域中增加水平的的等分的复合残基。在另一个特别的实施方案中，改变的糖基化包括在Fc区域中减少水平的岩藻糖残基。在另一个实施方案中，II型-抗⑶20抗体已经进行了多肽改造。本发明还涉及制备这样的被改造的II型抗体的方法，和涉及使用这些抗体治疗各种B细胞疾病，包括B细胞淋巴瘤的方法。
本发明的宿主细胞可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，CHO细胞，BHK细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER. C6细胞或杂交瘤细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括编码鼠B-Lyl抗体的/区域或其变体的多核苷酸和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包括转染的多核苷酸，其包括编码鼠 B-Lyl抗体的Vh区域或其变体的多核苷酸和编码等价于人免疫球蛋白的Fc区域的区域的序列。
在另一个方面，本发明涉及这样的宿主细胞，其产生由于修饰了其寡糖而显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能的ABM。在一个实施方案中，增加的结合亲和性针对Fc受体，特别地针对Fc YRIIIA受体。本文考虑的效应子功能可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，增加的Fc-介导的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞引发。
在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞包括至少一个编码具有&1TIII活性的多肽的核酸，其与组成型启动子元件可操作地连接。
在另一个方面中，本发明涉及在宿主细胞中产生ABM的方法，其包括(a)在容许所述ABM产生和容许在所述ABM的Fc区域上存在的寡糖的修饰的条件下，培养这样的宿主细胞，所述宿主细胞被改造从而表达至少一个编码具有&1TIII活性的融合多肽的多核苷酸；和(b)分离所述ABM ；其中所述ABM能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20并且其中所述 ABM是嵌合的。在一个实施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽，优选地包括&1TIII 的催化结构域和异源高尔基体定居(resident)多肽的高尔基体定位结构域，所述定位结构域选自由下列组成的组甘露糖苷酶II的定位结构域，β (1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶 K "GnTI")的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，β (1，2)-Ν-乙酰葡糖胺转移酶 IK "GnTII")的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在另一个方面，本发明涉及改进由宿主细胞产生的抗-CD20 ABM的糖基化模式的方法，所述方法包括向该宿主细胞引入至少一个本发明的核酸或表达载体。在一个实施方案中，该ABM是抗体或其片段；优选地包括IgG的Fc区域。或者，多肽是融合蛋白质，其包括等价于人IgG的Fc区域的区域。
在一个方面，本发明涉及重组的，嵌合抗体，或其片段，其能够与鼠B-Lyl抗体竞争结合CD20并具有减少的岩藻糖基化。
在另一个方面，本发明涉及通过使用融合多肽，来改进本发明的重组抗体或其片段的糖基化的方法，所述融合多肽具有&1ΤΙΙΙ活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结合域。在一个实施方案中，本发明的融合多肽包括&1ΤΙΙΙ的催化结构域。在另一个实施方案中，高尔基体定位结构域选自由下列组成的组甘露糖苷酶II的定位结构域，&ιΤΙ的定位结构域，甘露糖苷酶I的定位结构域，&1ΤΙΙ的定位结构域，和α 1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。优选地，该高尔基体定位结构域来自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及产生具有修饰的寡糖的重组的，嵌合的抗体或其片段，其中所述修饰的寡糖与未修饰的寡糖相比具有减少的岩藻糖基化。按照本发明，这些修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的，嵌合的抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的等分的，非岩藻糖基化的寡糖。在一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，等分的，非岩藻糖基化的寡糖是复合的。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及产生重组的，嵌合的抗体或其片段，其在所述多肽的Fc区域中具有至少20 %的寡糖，所述寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。在优选的实施方案中，在所述多肽的Fc区域中至少30% 的寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。在另一个优选的实施方案中，其中在所述多肽的Fc区域中，至少35%的寡糖是等分的，非岩藻糖基化的。
在另一个方面，本发明涉及重组的，嵌合的抗体或其片段，其由于其寡糖的修饰而显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在一个实施方案中，增加的结合亲和性针对Fc激活受体。在另一个实施方案中，Fc受体是Fc γ激活受体，特别地 Fc γ RIIIA受体。本文考虑的效应子功能可以选自这样的组，所述组包括，但不限于，增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡；增加的树突细胞成熟；和增加的T细胞引发。
在另一个方面，本发明涉及重组的，嵌合的抗体片段，其具有鼠B-Lyl抗体的结合特异性并包含Fc区域，所述抗体片段被进行了改造从而具有由本发明的方法的任一个所产生的增加的效应子功能。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :1的序列的多肽和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方法所产生的增加的效应子功能。
在另一个方面，本发明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :3的序列的多肽和等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域，并且所述融合蛋白被改造从而具有由本发明的任一方法所产生的增加的效应子功能。
在一方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的重组的嵌合的抗体，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的重组的嵌合的抗体片段，和药用载体。在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包括由本发明的任一方法所产生的融合蛋白和药用载体。
本发明还涉及治疗可通过B细胞消减来治疗的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的通过本发明的方法的任一种产生的重组的，嵌合抗体或其片段施用于需要其的人受试者。
附图简述
图1鼠B-Lyl的Vh区域的核苷酸(SEQ ID NO 2)和氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。
图2鼠B-Lyl的Vl区域的核苷酸(SEQ ID NO 4)和氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。
图3利妥昔单丨充 (0)和ch_B_Lyl ( Δ )与在feiji B-淋巴瘤细胞上的⑶20的结
口 O
图4在下列三种不同种类的FCYRIIIa-158V/F基因型的全血中，利妥昔单抗 (0)和ch-B_Lyl ( Δ )导致的B细胞消减㈧来自对于较低亲和性受体纯合的F/F供体的全血；(B)来自对于亲和性受体是杂合的F/V供体的全血；和(C)来自对于较高亲和性受体纯合的V/V供体的全血。
图5嵌合的，抗-⑶20抗体的重链的核苷酸(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQID NO 13)。
图6嵌合的，抗-⑶20抗体的轻链的核苷酸(SEQ ID NO 12)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。
图7鼠B-Lyl抗体CDRs的核苷酸和氨基酸序列。(A) Vh区域的预期CDRs。(B)Vl 区域的预期⑶Rs。
图8糖改造的，嵌合B-Lyl抗体的MALDI-T0F模式。(A)详述特异性峰的百分比的表；(B)糖改造的嵌合B-Lyl的光谱；(C)用Endo-H处理的糖改造的嵌合B-Lyl的光谱。
图9不同的人源化的抗-⑶20抗体与Raji B细胞的结合。在B-HH2构建体和 B-HL8和B-HLll构建体之间的差异存在于构架1和2区域中，其中所有的三个⑶Rs是相同的。B-HL8和B-HLll的FRl和FR2序列来自人VH3类，而完整的B-HH2构架是人VHl来源的。B-HLll是具有单一突变GlulGln的B-HL8的衍生物，其中Gln是B-HH2构建体的氨基酸残基。这意味着GlulGln交换没有改变结合亲和性或强度。在B-HH2和B-HL8之间的其它差异是14FR残基，其中一个或多个将影响该抗体的抗原结合行为。
图10在Raji靶细胞上的人源化的抗-⑶20抗体BHL4-KV1的结合。通过用人种系序列VH1_45的FRl替换B-HH2的FRl，该B-HL4构建体来源自B-HH2抗体。该构建体显示大大减少的抗原结合能力，尽管在FRl中的仅三个位点上具有不同的氨基酸。这些残基位于按照Kabat编号方式的位点2，14，和30处。其中，位点30似乎是最有影响的位点，因为其是⑶Rl的Chothia限定的部分。
图11.在B-HH1，B-HH2，B_HH3和母体抗体B-Iyl之间的结合行为的比较。该数据显示所有的Abs显示相似的EC50值，但是与变体B-HH2和B-HH3相比，B-HHl构建体以更低的强度/化学计量结合。B-HHl可以通过其部分人⑶Rl和⑶R2区域(Kabat定义)，以及在位点28 (Kabat编号方式)上的Ala/Thr多态性，与B-HH2和B-HH3区分。这显示位点观，完整的⑶R1，和/或完整的⑶R2的任一对于抗体/抗原相互作用是重要的。
图12B-HL1，B-HHljP B-Iyl母体抗体的比较。该数据显示在B-HLl构建体中的任何结合活性的缺乏，和与B-Iyl相比，大约一半的B-HHl结合强度/化学计量。B-HLl以及B-HHl两者，基于来自人VHl类的受体构架进行设计。在其它的差异中，B-HLl的位点 71 (Kabat编号方式)构建体是显著的差异，显示其对于抗原结合的推定的重要性。
图13抗-CD20抗体与其抗原的capaicty的荧光细胞计量(Fluorocytometric) 分析。该数据显示B-HL2和B-HL3构建体没有显示CD-20结合活性。
图14在Z-138MCL细胞上的抗-⑶20抗体的程序性细胞死亡。
图15抗-⑶20抗体导致程序性细胞死亡。测定详述将切105细胞/孔接种在M 孔板(5x105细胞/ml)的培养基中。将用于阴性对照的IOmg的各个Ab，PBS或5mM喜树碱(CPT)阳性对照加入孔中。将样品温育ο/η (16小时)，用ArmV-FITC染色，并通过FACS 进行分析。测定以三次重复进行(*)减去对于单独的PBS的信号(单独的PBS对于PR-I 和Ζ-138细胞分别给出8%和2%的ArmV+)。所用的抗体是C2B8 (嵌合的，非糖改造的)； BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的)。注意该测定不包括任何另外的效应细胞，仅是靶加上抗体或对照。
图16以免疫效应细胞造成的抗-⑶20抗体的靶细胞杀伤。测定详述在过夜温育的正常全血细胞中的B细胞消减和通过FACS分析⑶19+/⑶3+。使用PBMCs作为效应物的ADCC，4小时温育，25 1的效应物靶标比率，通过钙荧光素-保留相对于去污剂-裂解 (100% )和无Ab的裂解(0% )测量的靶标杀伤。所用的抗体:C2B8(嵌合的，非糖改造形式)；BHH2-KVl-Wt (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)；BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)。
图17未修饰的，非糖改造的BHH2-KV1人源化的IgGl B-Iyl抗-人⑶20抗体的 PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。
图18糖改造的BHH2_KVlgl人源化的IgGlB-Iyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有β_1， 4-Ν-乙酰葡糖胺转移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因的共表达来进行。
图19糖改造的BHH2_KVlg2人源化的IgGl B-Iyl抗-人CD20抗体的PNGaseF-释放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通过在宿主细胞中的抗体基因和编码具有 β-1，4-Ν-乙酰葡糖胺转移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因以及编码具有高尔基体 α -甘露糖苷酶II催化活性的酶的基因的共表达来进行。
图20非糖改造和糖改造的抗体与在重组CHO-⑶16细胞表面展示上的人 Fc γ RIIIa受体的结合。
图21非-Fc改造的和Fc改造的抗-⑶20抗体对Z-138MCL细胞造成的程序性细胞死亡。测定详述将切105细胞/孔接种在对孔板(5x105细胞/ml)的培养基中。将用于阴性对照的IOmg的各个Ab，PBS加入孔中。将样品温育ο/η (16小时)，用ArmV-FITC染色，并通过FACS进行分析。测定以三次重复进行。所用的Abs:C2B8=利妥昔单抗(嵌合的，非糖改造形式，与商业形式相同)；BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的-见图6糖基化模式)；BHH2-KVlgl(人源化的，糖改造的-见图7糖基化模式)；BHH2_KVlg2 (人源化的，糖改造的-见图8糖基化模式)。注意这种测定不包括任何另外的效应细胞，仅是靶标加抗体或对照。(*)减去单独的PBS的信号。
发明详述
本文所用的术语如本领域通常所用的，除非如下另外指出。
用于本文时，术语抗体意欲包括整个抗体分子，以及具有Fc区域并保留结合特异性的抗体片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性，所述整个抗体分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和多特异性(例如，二特异性)的抗体。还包括人源化，primatized和嵌合的抗体。
用于本文时，术语Fc区域意欲指IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的范围可以轻微变化，人IgG重链Fc区域通常限定为从位点的氨基酸残基延伸到羧基末端一段。
用于本文时，术语“等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域”意欲包括免疫球蛋白的 Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体，所述改变产生置换，添加，或缺失，但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性) 的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸，而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见，例如 Bowie，J. U. et al. , Science 247:1306-10(1990)。
用于本文时，在其最广义上讲，术语抗原结合分子指特异性结合抗原决定簇的分子。更具体地，结合CD20的抗原结合分子是特异性结合35，000道尔顿的细胞表面的非糖基化磷蛋白的分子，所述细胞表面的非糖基化磷蛋白典型地指通常被称为CD20的人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35。所谓“特异性结合”指结合对于抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。
用于本文时，当用在涉及多肽诸如ABMs中时，术语融合的和嵌合的，指这样的多肽，所述多肽包括来自两个或更多异源多肽的氨基酸序列，诸如来自不同物种的抗体的部分。例如，对于嵌合ABMs而言，非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种，包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；最优选嵌合抗体的可变区与重组抗⑶-20抗体的可变区基本相同，所述抗⑶-20抗体具有鼠B-Lyl的可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。
用于本文时，具有"&1TIII活性"的多肽指这样的多肽，所述多肽能够催化以 β -1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-连接的寡糖中的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽，所述多肽显示类似于但不必须相同于，β (1， 4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性，如在特别的生物测定中所测量的，具有或不具有剂量依赖性，按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB)，其也被称为β-1， 4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4.1.144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中，其不需要与&1TIII的剂量依赖性相同，但是与&1TIII活性相比， 基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即，相对于&1TIII，候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少，并且优选地，不超过约10倍更少的活性，并且最优选地，不超过约三倍更少的活性)。
用于本文时，术语变体(或类似物)指通过使用，例如重组DNA技术产生的氨基酸插入，缺失，和置换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的，primatized或人源化的抗原结合分子，其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式置换，添加和/或缺失进行修饰，所述方式基本上不影响抗原(例如，CD20)结合亲和性。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化，或通过用共有序列来替代氨基酸来发现确定哪种氨基酸可以被取代，添加，或缺失而不会破坏目标活性的指导。
或者，编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的“丰余性”来合成或选择。各种密码子置换，诸如产生各种限制性位点的沉默改变可以被引入从而优化克隆到质粒或病毒载体中，或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性， 从而改变特性诸如配体结合亲和性，链间亲和性，或降解/更新率。
优选地，氨基酸“置换”是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代的结果，即保守性氨基酸取代。“保守性”氨基酸置换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、 疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；带正电荷(碱性) 的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1到20个氨基酸的范围内，更优选在1-10个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术和测定得到的重组变体的活性，通过系统性在多肽分子中进行氨基酸插入，缺失或置换来实验性地进行确定。
用于本文时，术语人源化用于指来自非人抗原结合分子，例如，鼠抗体的抗原结合分子，其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性，但是在人中具有更少的免疫原性。这可以通过各种方法来实现，所述方法包括(a)将整个非人的可变结构域移植到人恒定区上从而产生嵌合抗体，(b)仅将非人CDRs移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键的构架残基(例如，对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些)，或(c)移植整个非人的可变结构域，但是通过表面残基的取代用人样切片来“遮蔽”它们。这些方法公开于 Jones et al.，Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,81 6851-6855(1984) ；Morrison 禾口 Oi，Adv. Immunol. ,44 :65-92(1988) ；Verhoeyen et al.， Science,239 :1534-1536(1988) ；Padlan, Molec. Immun. ,28 :489-498(1991) ；Padlan, Molec. Immun. ,31(3) :169-217 (1994)，将它们全部并入本文作为参考。在抗体的重链和轻链可变结构域中的每一个通常存在3个互补决定区，或⑶Rs，(⑶R1，⑶R2和⑶R3)，其侧面是抗体的重链和轻链可变结构域的每个中的四个构架亚区域(即，FRl, FR2，FR3，和 FR4) :FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以，见于特别是美国专利号 6，632，927，和公开的美国申请号2003/0175269中，将它们两者全文并入本文作为参考。
类似地，用于本文时，术语primatized用于指来自非灵长类动物抗原结合分子的抗原结合分子，例如，鼠抗体，其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质，但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。
在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中，用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义，除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语“互补决定区”("CDR")来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这种特别的区域已经在Kabat et al. , U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)禾口 Chothia et al. ,J. Mol.Biol. 196 :901-917(1987)中进行了描述，将它们并入本文作为参考，其中当针对彼此比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。但是，将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。构成如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRs的适合的氨基酸残基在下面的表I中提出作为比较。构成特定 CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定那一种残基构成特定的CDR。
表1.CDR 定义1
KabatChothiaAbMVh CDRl31-3526-3226-35Vh CDR250-6552-5850-58Vh CDR395-10295-10295-102
权利要求
1.分离的多核苷酸,其包括SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10。
2.分离的多核苷酸，其包括SEQID No:2。
3.分离的多核苷酸，其包括SEQID No:4。
4.分离的多核苷酸，其包括与SEQID NO :2具有至少80%同一性的序列，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
5.分离的多核苷酸，其包括与SEQID NO :4具有至少80%同一性的序列，其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
6.分离的多核苷酸，其包括a.编码具有SEQID No 1的序列的多肽的序列；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
7.分离的多核苷酸，其包括a.编码具有SEQID No 3的序列的多肽的序列；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
8.分离的多核苷酸，其包括与SEQID N0:11或SEQ ID NO :12具有至少80%同一性的序列。
9.分离的多核苷酸，其包括a. 一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的VH区域的多肽，或其变体；和b来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
10.分离的多核苷酸，其包括a.一段序列，所述序列编码具有鼠B-Lyl抗体的V区域的多肽，或其变体；和b.来自除小鼠以外的物种的序列，所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽，或其片段。
专利摘要
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在特定的实施方案中，本发明涉及重组单克隆抗体，其包括特异于人CD20的嵌合的、primatized或人源化的抗体。此外，本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子，和包括这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的ABMs的方法，并且涉及使用这些ABMs治疗疾病的方法。此外，本发明涉及具有修饰的糖基化的ABMs，所述ABMs具有改善的治疗性质，包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
文档编号C12Q1/68GKCN102373214SQ201110285833
公开日2012年3月14日 申请日期2004年11月5日
发明者C·费拉拉, E·默斯纳, P·乌马纳, P·布伦克尔, T·苏特, U·蓬特纳 申请人:格黎卡特生物技术股份公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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