一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用的制作方法
专利名称:一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域：
。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产Y-氨基丁酸上的应用。
背景技术：
Y-氨基丁酸(简称GABA)是一种在中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如降血压、保持神经安定、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、保肝利肾等。近年来，GABA的研究和应用受到了广泛的关注。目前，国内外主要采用化学合成法和微生物法制备GABA，化学合成法反应条件剧烈，污染严重；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低，但后处理过程复杂且生产周期长；全细胞转化法合成GABA则可提高底物转化率和产品纯度，且具有节约后处理工序、缩短生产周期及降低环境污染等优点，越来越受到国内外研究者的广泛重视。
本发明课题组专利“一株高效转化L-谷氨酸为Y -氨基丁酸乳酸菌的选育”公开号:101^8679A
公开日:2010. 12. 29，该专利公开了以植物乳杆菌(LP-GB 01-21)为生产菌株，5L发酵罐水平，在pH5. 0乙酸-乙酸钠缓冲液中进行全细胞转化，最终GABA浓度达到 132g/L，摩尔转化率为94. 3%，产量明显高于其他同类菌株，但由于植物乳杆菌是兼性厌氧微生物，培养条件较难控制，GABA的生产效率受培养条件影响较为显著；同时，植物乳杆菌中GAD的表达量受菌体代谢状态的控制，表达量有限，全细胞转化效率仍有待于提高。鉴于此，本研究拟通过构建GAD高表达型重组大肠杆菌，借助大肠杆菌生长迅速、易于高密度培养和GAD表达可以人工调控的优点进行GABA大规模和高效率生产。另外，GAD是生物催化 L-谷氨酸脱羧反应生成Y -氨基丁酸的限速酶，通过对该酶的酶学性质进行研究，即酶的热稳定性、PH稳定性及温度、pH与酶活性的关系，几种金属离子对酶的影响，来确定该酶作用的合适条件指导全细胞转化法合成GABA，并为工业化制备GABA提供了参考依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产GABA重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法，并对重组谷氨酸脱羧酶(GAD)酶学性质进行研究，根据酶学性质的研究结果确定了最优转化条件，为微生物转化L-谷氨酸为Y -氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案提取总Lactobacillus plantarum染色体为模板，根据 GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下
Pl :5，-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下划线为 BamH I 酶切位点)
P2 :5，GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3，(下划线为 Not I 酶切位点)进行 PCR扩增，PCR 扩增条件为94°C，5min 预变性；94°C 50s, 57°C Imin 30s，72°C 2min,35^ 循环；72°C延伸lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化Ε. coli JM109,经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为 T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对T-Ipgad和pET18a(+)进行双酶切，胶回收Ipgad 片段，将其与线性化载体pET48a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，再转化大肠杆菌E. coli BL2KDE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，将符合预期结果的阳性转化子于-80°C冰箱中保藏。
取冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(终浓度为50 μ g/mL)的LB培养基中，37°C 振荡培养过夜，次日转接LB培养基中，IPTG诱导表达，粗酶液采用比色法进行酶活测定，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生lymol GABA所需的酶量，粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。粗酶液经Ni-NTA纯化得到重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究。
通过对重组谷氨酸脱羧酶GAD酶学性质的初步研究，确定了其最适作用温度、最适PH以及具有较强促进作用的金属离子种类及浓度，根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，5L发酵罐水平，对重组菌进行转化产GABA实验。
重组菌摇瓶种子培养基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl 0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下灭菌 IOmin0
重组菌发酵培养基(g/L)葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米浆7. 5，NaCl 0.5， K2HPO4O. 1, MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2 X 1(Γ5。pH 6. 5 7. 0、121°C 下灭菌 IOmin0
本发明的有益效果本发明课题组前期通过筛选、诱变获得一株植物乳杆菌，该菌具有较高的谷氨酸脱羧酶酶活，但由于植物乳杆菌是兼性厌氧微生物，培养条件较难控制， 同时，植物乳杆菌中GAD的表达量受菌体代谢状态的控制，表达量有限，本实验克隆了该菌的GAD酶基因，实现了其在大肠肝菌中的异源表达，且表达量高。利用pET28a上的多聚组氨酸标签，粗酶液过镍柱纯化，得到较纯的重组酶GAD，并对该酶的酶学性质进行了初步研究，确定了该酶作用的最适PH、最适温度、及不同金属离子对其作用的影响。为改良全细胞转化工艺提供了可靠的理论依据。
根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，优化后的转化条件为 ρΗ4· 8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、3. 5mmol/L Mg2+，转化温度37°C。在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，转化Mh，转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后，氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为 204. 5g/L,转化率为 97. 92 %。
产品纯度高，转化率高，转化周期短，技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可进行生产，不需购置特殊设备和仪器，易于推广应用。
图1重组质粒pET18a-lpgad的构建；
图 2 重组质粒 pET-28a-lpgad 的酶切验证 Lanel λ HindIII DNA marker ； Lane2pET-28a-lpgad/BamHI g| ；Lane3 pET-28a-lpgad/BamHI+NotI M^W ；Lane4 DS2000 DNA marker ；[0017] 3 Μ GAD ^ Lanel Supernatant of Ε. coli Β 21 ；Lane2 Supernatant of Ε. coli B121with recombinant plasmid pET_28a(+)-Ipgad ;Lane3 Protein markers(kDa)；
4 MM GAD ^ Ni-NTA ^tit Lanel Protein markers (kDa) ；Lane2 Supernatant of E.coliB121 with recombinant plasmid pET-28a(+)-Ipgad ；Lane3 Purified GAD ；
图5重组GAD最适pH (A)及其pH稳定性(B)；
图6重组GAD最适温度㈧及其热稳定性⑶；
图7不同金属离子及EDTA对重组GAD的影响(B)；
图8不同不同浓度Ca2+ (A)、Mg2+⑶对GAD酶活的影响；
图 9 重组 GAD 的 Lineweaver-Burk 作图；
图10氨基酸测定仪测定BL21/pET-28a-lpgad 5L发酵罐转化液中底物与产物的
含量图谱；
具体实施方式
实施例1 重组大肠杆菌BL21/pET-28a-lpgad的构建
根据 NCBI 中植物乳杆菌 Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-III (GI :308044682)全基因组核酸序列32Μ37^ρ中的Ipgad基因序列，设计谷氨酸脱羧酶编码基因的引物
Pl =GAC(GGATCC)ATGGACCAGAAGCTGTTAAC(BamH I)
P2 :GGC(GCGGCCGC)TCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT (Not I)
提取总Lactobacillus plantarum染色体为模板，PCR扩增获得目的基因片段， PCR 扩增条件为 94°C，5min 预变性；94°C 50s, 57°C Imin 30s, 72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体pMDIS-T连接，转化Ε. coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad。 将T-Ipgad用BamHI和Not I进行双酶切，胶回收Ipgad片段，将其与经相同双酶切处理获得的线性化载体pET48a(+)混合，加入T4连接酶，16°C过夜连接，再转化大肠杆菌E. coli BL2KDE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，如图2所示，将符合预期结果的阳性转化子保存在含有20%甘油的LB中，冷冻保存于-80°C。
实施例2 重组谷氨酸脱羧酶的表达及Ni-NTA纯化
取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素(终浓度为50μ g/mL)的LB培养基中， 37°C振荡培养过夜，次日按1 %接种量转接，37°C培养至OD约0. 6-0. 8，加人IPTG至终浓度为0. 5mmol/L, 16°C过夜诱导表达。IPTG诱导后的菌液经超声波破碎细胞，上清液SDS-PAGE 分析，检测到一条分子量约为53kDa的特异性条带，如图3所示。上清液测得比酶活为 8.53U/mg。
将过夜诱导表达的菌液于10000r/min，4°C离心15min，收集菌体，用pH7. 4PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0. 45 μ m滤膜过滤，选用表达载体pET-28a (+)中含有6 ·His-Tag编码序列，过Ni-NTA纯化GAD。纯化后的GAD经SDS-PAGE分析结果见图3， 可看出经过纯化后得到相对单一的条带，如图4所示，基本上可以认为已得到相对较纯的 GAD酶蛋白。纯化后酶液的比酶活达到32. 45U/mg,是纯化前粗酶液酶活的3. 8倍，回收率达 53. 32%。
实施例3 重组谷氨酸脱羧酶酶学性质初步研究
1)最适pH及pH稳定性配制pH3. 6 6. 0的醋酸-醋酸钠反应缓冲液，30°C下将酶液分别与不同PH的反应液混合，测定GAD在不同pH反应体系中的酶活，考察pH对酶促反应的影响。再将一定量的酶液加入到以上不同PH的反应缓冲液中，30°C下分别保温2h， 测定剩余酶活，考察GAD在不同pH条件下的稳定性。
2)最适温度及热稳定性采用pH4. 8的反应缓冲液，分别在20°C，25°C，30°C， 35 V，37 °C，40 V ,45 °C, 50 V ,55 °C, 60 V，65 °C，70 V下测定酶活，研究温度对酶反应的影响。将酶液置于以上不同温度下保温211、411、611、811、1011，测定剩余酶活，考察640在不同温度下的稳定性。
3)不同金属离子及EDTA对酶活的影响在反应液中分别加入终浓度为lmmol/L 的 Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+、Ag+、Al3+、Li2+ 以及 EDTA，30°C 下测定 GAD 酶活，以不加金属离子的反应液作为对照，研究不同金属离子对其酶促反应的影响。另外，对具有明显激活作用的金属离子，配制不同的浓度进行梯度实验测定。
4)Km值及Vmax的测定配制不同浓度的L-谷氨酸钠底物溶液，分别与酶液在 30°C下反应，采用双倒数作图法确定GAD的Km及Vmax值。
酶学性质初步研究表明，最适pH为4. 8，在pH3. 6-5. 2范围内稳定性较好，如图5 所示；最适温度为37°C，20V _40°C范围内，保温10h，相对酶活仍在85%以上，如图6所示； Mn2+、Fe2/ Fe3/ Ag+、Cu2+均对植物乳杆菌GAD的活力有较大的抑制作用，Li+、K+、Na+等对活性影响不明显，Ca2+、Mg2+对该酶有较强的激活作用，如图7所示；如图8所示，2. 5mmol/LCa2+ 时激活作用最明显，相对酶活达1 %，3. 5mmol/L Mg2+对重组酶GAD的激活作用最强，酶活达131% ；根据不同底物浓度与酶促反应的关系，按照米氏方程，采用双倒数作图法，如图9 所示，可以得到 Km 为 9. 21mmol/L, Vmax 为 7. 58mmol/L · min。
实施例4 重组大肠杆菌转化L-谷氨酸产GABA研究
通过对重组谷氨酸脱羧酶GAD酶学性质的初步研究，确定了其最适作用温度、最适PH以及具有较强促进作用的金属离子种类及浓度，根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，优化后的转化条件为pH4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5讓。1/LMg2+，转化温度 37°C。
将斜面保藏的菌种接种至50ml (装液量为10ml)LB培养基中，于旋转式摇床中 37°C、160r/min培养1 进行活化，再以5%的接种量接入500ml摇瓶(装液量为100ml) 种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液，按10%的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37°C、250r/min培养至0D_为0. 6，再向其中添加乳糖至终浓度为lg/L，同时在线控制pH6. 8流加葡萄糖，30°C，诱导发酵14h至0D_ 为13.6。将培养好的菌体进行离心收集，双蒸水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每池投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢， 12h后，投料时间间隔延长到他，在转速250r/min、通气量Ivvm的条件下转化Mh，反应结束后转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为97. 92%，如图10所示。
权利要求
1.本专利构建一株高效转化L-谷氨酸为Y-氨基丁酸诱导型重组大肠杆菌，并对高表达谷氨酸脱羧酶酶学性质进行研究并应用于重组菌转化Y-氨基丁酸条件的优化， 其特征是首次扩增了经多次诱变筛选获得的具有较高谷氨酸脱羧酶活性的植物乳杆菌GB 01-21(保藏号CCTCC M 209102)的谷氨酸脱羧酶编码基因lpgad，构建高产Y -氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad。最终重组菌转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为 97. 92%。
2.根据权利要求
1所述高产Y-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法， 其特征是以植物乳杆菌GB 01-21全基因组为模板，设计一对引物PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因lpgad，构建重组质粒pET18a-lpgad。根据GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下Pl 5' -GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下划线为 BamH I 酶切位点)P2 5' -GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3‘(下划线为 Not I 酶切位点)提取植物乳杆菌GB 01-21染色体为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C，5min预变性； 940C 50s, 57 0C Imin 30s, 72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸 lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体PMD18-T连接，转化E. coli JM109,经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对 T-Ipgad和pET48a(+)进行双酶切，胶回收Ipgad片段，将其与线性化载体pET48a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，构建重组质粒pETj8a-lpgad。
3.根据权利要求
1所述，该重组大肠杆菌的基因表达产物经镍柱纯化后获得重组谷氨酸脱羧酶，大小为53kDa。
4.根据权利要求
1和3所述，重组谷氨酸脱羧酶酶学性质特征在于最适pH为4.8，在 PH3. 6-5. 2范围内稳定性较好；最适温度为37°C，20°C _40°C范围内，保温10h，相对酶活仍在85%以上；2. 5mmol/L Ca2+时激活作用最明显，相对酶活达巧4%，3. 5mmol/L Mg2+对重组酶GAD的激活作用最强，酶活达131 % ；Km为9. 21mmol/L, Vmax为7. 58mmol/L。
5.根据权利要求
1所述酶学性质在指导转化条件优化上的应用，其特征是根据酶学性质的研究结果，将转化体系的温度、PH分别调整至最适值，并向其中添加对重组酶GAD具有促进作用的金属离子，来确定最优转化条件。(1)重组菌摇瓶种子培养基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下灭菌 IOmin0重组菌发酵培养基(g/L)葡萄糖5. 0，蛋白胨10，玉米浆7. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4O. 1， MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2Χ1(Γ5。pH 6· 5 7· 0、121°C下灭菌 lOmin。(2)培养条件将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml) LB培养基中，于旋转式摇床中37°C、160r/min培养1 进行活化，再以5 %的接种量接入500ml摇瓶(装液量为 100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液，按10%的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37°C、250r/min培养至0D_为0. 6， 再向其中添加乳糖至终浓度为lg/L，同时在线控制pH6.8流加葡萄糖，30°C，诱导发酵14h 至 OD6tltl 为 13.6。(3)5L发酵罐重组菌全细胞转化条件为pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5mmol/L Mg2+，转化温度 37°C、250r/min。(4)在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每池投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后，投料时间间隔延长到6h，在转速250r/min、通气量Ivvm的条件下转化Mh，反应结束后转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后，氨基酸自动分测得转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为97. 92%。
专利摘要
一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域：
。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产GABA上的应用。首先，PCR扩增获得植物乳杆菌GB 01-21谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，构建了重组质粒pET-28a-lpgad，并在E.coli BL21(DE3)成功表达，其次，粗酶液采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究，用于指导转化条件的优化。最终5L发酵罐上进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％，为进一步工业化应用打下了良好的基础。
文档编号C12R1/19GKCN102367432SQ201110289796
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月28日
发明者田灵芝, 饶志明 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域：
。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产Y-氨基丁酸上的应用。
背景技术：
Y-氨基丁酸(简称GABA)是一种在中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如降血压、保持神经安定、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、保肝利肾等。近年来，GABA的研究和应用受到了广泛的关注。目前，国内外主要采用化学合成法和微生物法制备GABA，化学合成法反应条件剧烈，污染严重；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低，但后处理过程复杂且生产周期长；全细胞转化法合成GABA则可提高底物转化率和产品纯度，且具有节约后处理工序、缩短生产周期及降低环境污染等优点，越来越受到国内外研究者的广泛重视。
本发明课题组专利“一株高效转化L-谷氨酸为Y -氨基丁酸乳酸菌的选育”公开号:101^8679A
公开日:2010. 12. 29，该专利公开了以植物乳杆菌(LP-GB 01-21)为生产菌株，5L发酵罐水平，在pH5. 0乙酸-乙酸钠缓冲液中进行全细胞转化，最终GABA浓度达到 132g/L，摩尔转化率为94. 3%，产量明显高于其他同类菌株，但由于植物乳杆菌是兼性厌氧微生物，培养条件较难控制，GABA的生产效率受培养条件影响较为显著；同时，植物乳杆菌中GAD的表达量受菌体代谢状态的控制，表达量有限，全细胞转化效率仍有待于提高。鉴于此，本研究拟通过构建GAD高表达型重组大肠杆菌，借助大肠杆菌生长迅速、易于高密度培养和GAD表达可以人工调控的优点进行GABA大规模和高效率生产。另外，GAD是生物催化 L-谷氨酸脱羧反应生成Y -氨基丁酸的限速酶，通过对该酶的酶学性质进行研究，即酶的热稳定性、PH稳定性及温度、pH与酶活性的关系，几种金属离子对酶的影响，来确定该酶作用的合适条件指导全细胞转化法合成GABA，并为工业化制备GABA提供了参考依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产GABA重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法，并对重组谷氨酸脱羧酶(GAD)酶学性质进行研究，根据酶学性质的研究结果确定了最优转化条件，为微生物转化L-谷氨酸为Y -氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案提取总Lactobacillus plantarum染色体为模板，根据 GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下
Pl :5，-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下划线为 BamH I 酶切位点)
P2 :5，GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3，(下划线为 Not I 酶切位点)进行 PCR扩增，PCR 扩增条件为94°C，5min 预变性；94°C 50s, 57°C Imin 30s，72°C 2min,35^ 循环；72°C延伸lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化Ε. coli JM109,经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为 T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对T-Ipgad和pET18a(+)进行双酶切，胶回收Ipgad 片段，将其与线性化载体pET48a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，再转化大肠杆菌E. coli BL2KDE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，将符合预期结果的阳性转化子于-80°C冰箱中保藏。
取冻管保藏的菌种接种至含卡那霉素(终浓度为50 μ g/mL)的LB培养基中，37°C 振荡培养过夜，次日转接LB培养基中，IPTG诱导表达，粗酶液采用比色法进行酶活测定，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生lymol GABA所需的酶量，粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。粗酶液经Ni-NTA纯化得到重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究。
通过对重组谷氨酸脱羧酶GAD酶学性质的初步研究，确定了其最适作用温度、最适PH以及具有较强促进作用的金属离子种类及浓度，根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，5L发酵罐水平，对重组菌进行转化产GABA实验。
重组菌摇瓶种子培养基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl 0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下灭菌 IOmin0
重组菌发酵培养基(g/L)葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米浆7. 5，NaCl 0.5， K2HPO4O. 1, MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2 X 1(Γ5。pH 6. 5 7. 0、121°C 下灭菌 IOmin0
本发明的有益效果本发明课题组前期通过筛选、诱变获得一株植物乳杆菌，该菌具有较高的谷氨酸脱羧酶酶活，但由于植物乳杆菌是兼性厌氧微生物，培养条件较难控制， 同时，植物乳杆菌中GAD的表达量受菌体代谢状态的控制，表达量有限，本实验克隆了该菌的GAD酶基因，实现了其在大肠肝菌中的异源表达，且表达量高。利用pET28a上的多聚组氨酸标签，粗酶液过镍柱纯化，得到较纯的重组酶GAD，并对该酶的酶学性质进行了初步研究，确定了该酶作用的最适PH、最适温度、及不同金属离子对其作用的影响。为改良全细胞转化工艺提供了可靠的理论依据。
根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，优化后的转化条件为 ρΗ4· 8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、3. 5mmol/L Mg2+，转化温度37°C。在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，转化Mh，转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后，氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为 204. 5g/L,转化率为 97. 92 %。
产品纯度高，转化率高，转化周期短，技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可进行生产，不需购置特殊设备和仪器，易于推广应用。
图1重组质粒pET18a-lpgad的构建；
图 2 重组质粒 pET-28a-lpgad 的酶切验证 Lanel λ HindIII DNA marker ； Lane2pET-28a-lpgad/BamHI g| ；Lane3 pET-28a-lpgad/BamHI+NotI M^W ；Lane4 DS2000 DNA marker ；[0017] 3 Μ GAD ^ Lanel Supernatant of Ε. coli Β 21 ；Lane2 Supernatant of Ε. coli B121with recombinant plasmid pET_28a(+)-Ipgad ;Lane3 Protein markers(kDa)；
4 MM GAD ^ Ni-NTA ^tit Lanel Protein markers (kDa) ；Lane2 Supernatant of E.coliB121 with recombinant plasmid pET-28a(+)-Ipgad ；Lane3 Purified GAD ；
图5重组GAD最适pH (A)及其pH稳定性(B)；
图6重组GAD最适温度㈧及其热稳定性⑶；
图7不同金属离子及EDTA对重组GAD的影响(B)；
图8不同不同浓度Ca2+ (A)、Mg2+⑶对GAD酶活的影响；
图 9 重组 GAD 的 Lineweaver-Burk 作图；
图10氨基酸测定仪测定BL21/pET-28a-lpgad 5L发酵罐转化液中底物与产物的
含量图谱；
具体实施方式
实施例1 重组大肠杆菌BL21/pET-28a-lpgad的构建
根据 NCBI 中植物乳杆菌 Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-III (GI :308044682)全基因组核酸序列32Μ37^ρ中的Ipgad基因序列，设计谷氨酸脱羧酶编码基因的引物
Pl =GAC(GGATCC)ATGGACCAGAAGCTGTTAAC(BamH I)
P2 :GGC(GCGGCCGC)TCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT (Not I)
提取总Lactobacillus plantarum染色体为模板，PCR扩增获得目的基因片段， PCR 扩增条件为 94°C，5min 预变性；94°C 50s, 57°C Imin 30s, 72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体pMDIS-T连接，转化Ε. coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad。 将T-Ipgad用BamHI和Not I进行双酶切，胶回收Ipgad片段，将其与经相同双酶切处理获得的线性化载体pET48a(+)混合，加入T4连接酶，16°C过夜连接，再转化大肠杆菌E. coli BL2KDE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，如图2所示，将符合预期结果的阳性转化子保存在含有20%甘油的LB中，冷冻保存于-80°C。
实施例2 重组谷氨酸脱羧酶的表达及Ni-NTA纯化
取冻管保藏的重组子接种至含卡那霉素(终浓度为50μ g/mL)的LB培养基中， 37°C振荡培养过夜，次日按1 %接种量转接，37°C培养至OD约0. 6-0. 8，加人IPTG至终浓度为0. 5mmol/L, 16°C过夜诱导表达。IPTG诱导后的菌液经超声波破碎细胞，上清液SDS-PAGE 分析，检测到一条分子量约为53kDa的特异性条带，如图3所示。上清液测得比酶活为 8.53U/mg。
将过夜诱导表达的菌液于10000r/min，4°C离心15min，收集菌体，用pH7. 4PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0. 45 μ m滤膜过滤，选用表达载体pET-28a (+)中含有6 ·His-Tag编码序列，过Ni-NTA纯化GAD。纯化后的GAD经SDS-PAGE分析结果见图3， 可看出经过纯化后得到相对单一的条带，如图4所示，基本上可以认为已得到相对较纯的 GAD酶蛋白。纯化后酶液的比酶活达到32. 45U/mg,是纯化前粗酶液酶活的3. 8倍，回收率达 53. 32%。
实施例3 重组谷氨酸脱羧酶酶学性质初步研究
1)最适pH及pH稳定性配制pH3. 6 6. 0的醋酸-醋酸钠反应缓冲液，30°C下将酶液分别与不同PH的反应液混合，测定GAD在不同pH反应体系中的酶活，考察pH对酶促反应的影响。再将一定量的酶液加入到以上不同PH的反应缓冲液中，30°C下分别保温2h， 测定剩余酶活，考察GAD在不同pH条件下的稳定性。
2)最适温度及热稳定性采用pH4. 8的反应缓冲液，分别在20°C，25°C，30°C， 35 V，37 °C，40 V ,45 °C, 50 V ,55 °C, 60 V，65 °C，70 V下测定酶活，研究温度对酶反应的影响。将酶液置于以上不同温度下保温211、411、611、811、1011，测定剩余酶活，考察640在不同温度下的稳定性。
3)不同金属离子及EDTA对酶活的影响在反应液中分别加入终浓度为lmmol/L 的 Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+、Ag+、Al3+、Li2+ 以及 EDTA，30°C 下测定 GAD 酶活，以不加金属离子的反应液作为对照，研究不同金属离子对其酶促反应的影响。另外，对具有明显激活作用的金属离子，配制不同的浓度进行梯度实验测定。
4)Km值及Vmax的测定配制不同浓度的L-谷氨酸钠底物溶液，分别与酶液在 30°C下反应，采用双倒数作图法确定GAD的Km及Vmax值。
酶学性质初步研究表明，最适pH为4. 8，在pH3. 6-5. 2范围内稳定性较好，如图5 所示；最适温度为37°C，20V _40°C范围内，保温10h，相对酶活仍在85%以上，如图6所示； Mn2+、Fe2/ Fe3/ Ag+、Cu2+均对植物乳杆菌GAD的活力有较大的抑制作用，Li+、K+、Na+等对活性影响不明显，Ca2+、Mg2+对该酶有较强的激活作用，如图7所示；如图8所示，2. 5mmol/LCa2+ 时激活作用最明显，相对酶活达1 %，3. 5mmol/L Mg2+对重组酶GAD的激活作用最强，酶活达131% ；根据不同底物浓度与酶促反应的关系，按照米氏方程，采用双倒数作图法，如图9 所示，可以得到 Km 为 9. 21mmol/L, Vmax 为 7. 58mmol/L · min。
实施例4 重组大肠杆菌转化L-谷氨酸产GABA研究
通过对重组谷氨酸脱羧酶GAD酶学性质的初步研究，确定了其最适作用温度、最适PH以及具有较强促进作用的金属离子种类及浓度，根据酶学性质的研究结果，对全细胞转化条件进行优化，优化后的转化条件为pH4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5讓。1/LMg2+，转化温度 37°C。
将斜面保藏的菌种接种至50ml (装液量为10ml)LB培养基中，于旋转式摇床中 37°C、160r/min培养1 进行活化，再以5%的接种量接入500ml摇瓶(装液量为100ml) 种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液，按10%的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37°C、250r/min培养至0D_为0. 6，再向其中添加乳糖至终浓度为lg/L，同时在线控制pH6. 8流加葡萄糖，30°C，诱导发酵14h至0D_ 为13.6。将培养好的菌体进行离心收集，双蒸水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每池投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢， 12h后，投料时间间隔延长到他，在转速250r/min、通气量Ivvm的条件下转化Mh，反应结束后转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为97. 92%，如图10所示。
权利要求
1.本专利构建一株高效转化L-谷氨酸为Y-氨基丁酸诱导型重组大肠杆菌，并对高表达谷氨酸脱羧酶酶学性质进行研究并应用于重组菌转化Y-氨基丁酸条件的优化， 其特征是首次扩增了经多次诱变筛选获得的具有较高谷氨酸脱羧酶活性的植物乳杆菌GB 01-21(保藏号CCTCC M 209102)的谷氨酸脱羧酶编码基因lpgad，构建高产Y -氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad。最终重组菌转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为 97. 92%。
2.根据权利要求
1所述高产Y-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法， 其特征是以植物乳杆菌GB 01-21全基因组为模板，设计一对引物PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因lpgad，构建重组质粒pET18a-lpgad。根据GeneBank公布的植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因组序列设计引物如下Pl 5' -GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下划线为 BamH I 酶切位点)P2 5' -GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3‘(下划线为 Not I 酶切位点)提取植物乳杆菌GB 01-21染色体为模板，进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C，5min预变性； 940C 50s, 57 0C Imin 30s, 72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸 lOmin。所得片段经胶回收后与克隆载体PMD18-T连接，转化E. coli JM109,经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-Lpgad，采用相同限制性内切酶分别对 T-Ipgad和pET48a(+)进行双酶切，胶回收Ipgad片段，将其与线性化载体pET48a(+)混合，在T4连接酶的作用下过夜连接，构建重组质粒pETj8a-lpgad。
3.根据权利要求
1所述，该重组大肠杆菌的基因表达产物经镍柱纯化后获得重组谷氨酸脱羧酶，大小为53kDa。
4.根据权利要求
1和3所述，重组谷氨酸脱羧酶酶学性质特征在于最适pH为4.8，在 PH3. 6-5. 2范围内稳定性较好；最适温度为37°C，20°C _40°C范围内，保温10h，相对酶活仍在85%以上；2. 5mmol/L Ca2+时激活作用最明显，相对酶活达巧4%，3. 5mmol/L Mg2+对重组酶GAD的激活作用最强，酶活达131 % ；Km为9. 21mmol/L, Vmax为7. 58mmol/L。
5.根据权利要求
1所述酶学性质在指导转化条件优化上的应用，其特征是根据酶学性质的研究结果，将转化体系的温度、PH分别调整至最适值，并向其中添加对重组酶GAD具有促进作用的金属离子，来确定最优转化条件。(1)重组菌摇瓶种子培养基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下灭菌 IOmin0重组菌发酵培养基(g/L)葡萄糖5. 0，蛋白胨10，玉米浆7. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4O. 1， MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2Χ1(Γ5。pH 6· 5 7· 0、121°C下灭菌 lOmin。(2)培养条件将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml) LB培养基中，于旋转式摇床中37°C、160r/min培养1 进行活化，再以5 %的接种量接入500ml摇瓶(装液量为 100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液，按10%的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先于37°C、250r/min培养至0D_为0. 6， 再向其中添加乳糖至终浓度为lg/L，同时在线控制pH6.8流加葡萄糖，30°C，诱导发酵14h 至 OD6tltl 为 13.6。(3)5L发酵罐重组菌全细胞转化条件为pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5mmol/L Mg2+，转化温度 37°C、250r/min。(4)在优化后的转化条件下，以50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每池投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后，投料时间间隔延长到6h，在转速250r/min、通气量Ivvm的条件下转化Mh，反应结束后转化液离心取上清，加入15%的三氯乙酸终止反应，取Iml进行适当稀释后，氨基酸自动分测得转化液中产物GABA浓度为204. 5g/L，转化率为97. 92%。
专利摘要
一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建方法及其应用，属于发酵工程中生物技术领域：
。具体涉及一种构建遗传工程菌的方法、重组酶酶学性质研究及其在转化L-谷氨酸产GABA上的应用。首先，PCR扩增获得植物乳杆菌GB 01-21谷氨酸脱羧酶(GAD)基因，构建了重组质粒pET-28a-lpgad，并在E.coli BL21(DE3)成功表达，其次，粗酶液采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD，并对其酶学性质进行初步研究，用于指导转化条件的优化。最终5L发酵罐上进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％，为进一步工业化应用打下了良好的基础。
文档编号C12R1/19GKCN102367432SQ201110289796
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月28日
发明者田灵芝, 饶志明 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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