一种多重pcr扩增方法及试剂盒的制作方法
专利名称:一种多重pcr扩增方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒。
背景技术：
多重PCR (multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
多重PCR反应中，一般包括以下试剂:两对以上引物对、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及其他佐剂(DMS0、甘油、BSA)，通常为了获得比较好的扩增结果，会对试剂的使用量、PCR扩增的反应条件，例如延伸温度、延伸时间、退火时间、退火温度、PCR循环数等，进行优化。
现有技术中，通常引物的选择遵从简单的规则:引物长度为18_24bp或更长，GC含量为35%-60%，退火温度55°C-58°C或更高。长些的引物(如DMD基因的引物，28_30bp)使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。使用软件Primers来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使用BLAST工具在NCBI序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。
作为PCR重要衍生技术之一，多重PCR有着诸多优势:(I)高效性，减少操作流程，可同时检测多个基因或片段；(2)经济简便性，可大大节约时间和试剂成本。目前该技术已广泛应用于生物技术、检疫和医学检测等领域。然而，由于多重PCR工作原理是在同一 PCR反应体系里加入多对引物同时扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如 形成发卡结构，二聚体结构等。通常，多重PCR反应体系中多重引物浓度为5-12pmol，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率。
例如，申请号为201010153921.3，公开号为101824489A的中国发明专利申请公布说明书公开了一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，其组成包括:DNA聚合酶、dNTP、引物、PCR缓冲液、双蒸水，所述的引物由3对引物组成；具体地，所述三重PCR反应体系，在25 ii L的PCR反应体系中，含有rTaq DNA聚合酶2.0u ； dNTP (2.5mmol/L)2u L ；PCR缓冲液2.5 ii L ;引物P-F和P-R各12pmol、弓丨物A-R和A-F各5pmol、弓丨物E-R和 E-F 各 2.5pmol ;模板 IOOngo 反应程序为:95°C IOmin ；94°C lmin，50°C lmin，72°C 40s,30个循环；72°C IOmin0 (lmol大概为6.02 X IO23个拷贝，lpmol大约为6.02 X IO11个拷贝)
另外，白血病患者的遗传学特征异常复杂多变，包括染色体的易位、缺失、突变、倒位和扩增等。多重RT-PCR技术可在一次实验中同时检测多种常见白血病融合基因，有力地弥补了染色体核型分析的不足，提高了隐匿性易位染色体的检出率。目前，临床常用白血病分子诊断方法主要以Poul Jorgensen为代表的逆转录多重PCR检测方法，此类方法可对临床常见29种融合基因进行检测，一般将反应体系分成八管，每管检测不同类型的融合基因且产物片段大小存在明显差异，依据扩增产物所在反应管位置及片段大小判断融合基因类型。由于在同一反应体系中多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构、二聚体结构等，从而影响扩增效率，这是分为八管进行检测的主要原因，但这亦同时导致了该类检测方法复杂、繁琐，对操作人员相关专业要求较高，难以推广。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒，降低多重PCR反应体系中多重引物的浓度，使引物间的相互作用降低，同时为更多引物对在同一反应体系内工作而不影响扩增效率创造条件。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种多重PCR扩增方法，包括以下步骤:
(A)、以目的基因或目的基因的cDNA为模板，设计公共引物对；以目的基因或目的基因的cDNA为模板，根据所需扩增的片段设计多重引物，所述多重引物包括两对以上特异性引物对；在每一对特异性引物对中的正义引物的5'端连接公共引物对中的正义引物的
端，在每一对特异性引物对中的反义引物的Y端连接公共引物对中的反义引物的Y端，得到带有公共引物的特异性引物对，所有带有公共引物对的特异性引物对构成带有公共引物的多重引物；
所述公共引物设计应遵循两条原则:(I)任何优化的扩增条件下，公共引物与待测模板进行扩增时无特异性产物；(2)当带有公共引物的多重引物扩增得到特异性产物时，公共引物对具有扩增所述特异性产物的能力；
(B)、配置多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括:dNTP、MgCl2, PCR缓冲液、模板DNA、Taq DNA聚合酶，所述多重PCR反应体系还包括:公共引物对、带有公共引物的多重引物，其中，公共引物对的浓度为0.25 0.6 μ mol/L，每一条带有公共引物的特异性引物的浓度 5Χ1(Γ8 5Xl(T1Qy mol/L ；
(C)、按照现有技术，对多重PCR反应进行优化，按照优化后的条件进行PCR扩增。
进一步的技术方案中，对上述扩增产物进行鉴定。
本发明同时要求保护一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，所述多重PCR试剂盒包括:常规多重PCR组件，针对常见白血病融合基因的多重引物；还包括公共引物对，所述公共引物对包括以下核苷酸序列:SEQ ID N0.1:公共引物对中的正义引物5’ -GCATGTATAGAACATAAGGTGTCTC-3’；SEQ ID N0.2:公共引物对中的反义引物 5’ -GAGACACCTTATGTTCTATACATGC-3’。
上述技术方案中，所述常规多重PCR组件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、双蒸水。
上述技术方案中，所述针对常见白血病融合基因的多重引物为分别针对E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常规白血病融合基因的特异性引物对。优选的
技术方案中，所述针对常见白血病融合基因的多重引物具体如以下核苷酸序列所示:
权利要求
1.一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，所述多重PCR试剂盒包括:常规多重PCR组件，针对常见白血病融合基因的多重引物；其特征在于，还包括公共引物对，所述公共引物对包括以下核苷酸序列: SEQ ID N0.1:公共引物对中的正义引物 5’-GCATGTATAGAACATAAGG TGTCTC-3’；SEQ IDN0.2:公共引物对中的反义引物 5’ -GAGACACCTTA TGTTCTATACATGC-3’ ； 所述常规多重PCR组件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、双蒸水；所述针对常见白血病融合基因的多重引物为分别针对E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常规白血病融合基因的特异性引物对，所述针对常见白血病融合基因的多重引物具体如以下核苷酸序列所示:
2.根据权利要求
1所述一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，其特征在于，每20yL的PCR反应体系中公共引物的量为5 12pmol。
3.根据权利要求
2所述一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，其特征在于，每20μ L的PCR反应体系中每一条带有公共引物的特异性引物的量为1Χ10_6 1Χ10_8pmol ο
专利摘要
本发明公开了一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒；所述多重PCR扩增方法包括了设计公共引物以及带有公共引物的多重引物的步骤，所述公共引物设计应遵循两条原则(1)任何优化的扩增条件下，公共引物与待测模板进行扩增时无特异性产物；(2)当带有公共引物的多重引物扩增得到特异性产物时，公共引物对具有扩增所述特异性产物的能力；然后配置多重PCR体系进行扩增。本发明由于公共引物的引入，使反应体系内的序列特异性引物对浓度下降4个以上对数级别，如此低浓度的多重引物在同一个反应体系中出现相互作用的几率将大大降低，不仅可解决不同引物对相互干扰这一多重PCR中的技术瓶颈，亦为加入新的引物对、增加检测基因数量创造前提条件。
文档编号C12Q1/68GKCN102352411 B发布类型授权 专利申请号CN 201110298119
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月29日
发明者孙万平, 王伟大, 姚利, 陈燕, 李凯, 陈子兴 申请人:苏州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),
技术领域：
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒。
背景技术：
多重PCR (multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
多重PCR反应中，一般包括以下试剂:两对以上引物对、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及其他佐剂(DMS0、甘油、BSA)，通常为了获得比较好的扩增结果，会对试剂的使用量、PCR扩增的反应条件，例如延伸温度、延伸时间、退火时间、退火温度、PCR循环数等，进行优化。
现有技术中，通常引物的选择遵从简单的规则:引物长度为18_24bp或更长，GC含量为35%-60%，退火温度55°C-58°C或更高。长些的引物(如DMD基因的引物，28_30bp)使反应在更高的退火温度下进行并产生较少的非特异性产物。使用软件Primers来计算熔点并检测可能的引物间的相互作用。使用BLAST工具在NCBI序列数据库中对多对引物进行比对，以检测可能的重复序列。
作为PCR重要衍生技术之一，多重PCR有着诸多优势:(I)高效性，减少操作流程，可同时检测多个基因或片段；(2)经济简便性，可大大节约时间和试剂成本。目前该技术已广泛应用于生物技术、检疫和医学检测等领域。然而，由于多重PCR工作原理是在同一 PCR反应体系里加入多对引物同时扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如 形成发卡结构，二聚体结构等。通常，多重PCR反应体系中多重引物浓度为5-12pmol，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率。
例如，申请号为201010153921.3，公开号为101824489A的中国发明专利申请公布说明书公开了一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒，其组成包括:DNA聚合酶、dNTP、引物、PCR缓冲液、双蒸水，所述的引物由3对引物组成；具体地，所述三重PCR反应体系，在25 ii L的PCR反应体系中，含有rTaq DNA聚合酶2.0u ； dNTP (2.5mmol/L)2u L ；PCR缓冲液2.5 ii L ;引物P-F和P-R各12pmol、弓丨物A-R和A-F各5pmol、弓丨物E-R和 E-F 各 2.5pmol ;模板 IOOngo 反应程序为:95°C IOmin ；94°C lmin，50°C lmin，72°C 40s,30个循环；72°C IOmin0 (lmol大概为6.02 X IO23个拷贝，lpmol大约为6.02 X IO11个拷贝)
另外，白血病患者的遗传学特征异常复杂多变，包括染色体的易位、缺失、突变、倒位和扩增等。多重RT-PCR技术可在一次实验中同时检测多种常见白血病融合基因，有力地弥补了染色体核型分析的不足，提高了隐匿性易位染色体的检出率。目前，临床常用白血病分子诊断方法主要以Poul Jorgensen为代表的逆转录多重PCR检测方法，此类方法可对临床常见29种融合基因进行检测，一般将反应体系分成八管，每管检测不同类型的融合基因且产物片段大小存在明显差异，依据扩增产物所在反应管位置及片段大小判断融合基因类型。由于在同一反应体系中多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构、二聚体结构等，从而影响扩增效率，这是分为八管进行检测的主要原因，但这亦同时导致了该类检测方法复杂、繁琐，对操作人员相关专业要求较高，难以推广。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒，降低多重PCR反应体系中多重引物的浓度，使引物间的相互作用降低，同时为更多引物对在同一反应体系内工作而不影响扩增效率创造条件。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种多重PCR扩增方法，包括以下步骤:
(A)、以目的基因或目的基因的cDNA为模板，设计公共引物对；以目的基因或目的基因的cDNA为模板，根据所需扩增的片段设计多重引物，所述多重引物包括两对以上特异性引物对；在每一对特异性引物对中的正义引物的5'端连接公共引物对中的正义引物的
端，在每一对特异性引物对中的反义引物的Y端连接公共引物对中的反义引物的Y端，得到带有公共引物的特异性引物对，所有带有公共引物对的特异性引物对构成带有公共引物的多重引物；
所述公共引物设计应遵循两条原则:(I)任何优化的扩增条件下，公共引物与待测模板进行扩增时无特异性产物；(2)当带有公共引物的多重引物扩增得到特异性产物时，公共引物对具有扩增所述特异性产物的能力；
(B)、配置多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括:dNTP、MgCl2, PCR缓冲液、模板DNA、Taq DNA聚合酶，所述多重PCR反应体系还包括:公共引物对、带有公共引物的多重引物，其中，公共引物对的浓度为0.25 0.6 μ mol/L，每一条带有公共引物的特异性引物的浓度 5Χ1(Γ8 5Xl(T1Qy mol/L ；
(C)、按照现有技术，对多重PCR反应进行优化，按照优化后的条件进行PCR扩增。
进一步的技术方案中，对上述扩增产物进行鉴定。
本发明同时要求保护一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，所述多重PCR试剂盒包括:常规多重PCR组件，针对常见白血病融合基因的多重引物；还包括公共引物对，所述公共引物对包括以下核苷酸序列:SEQ ID N0.1:公共引物对中的正义引物5’ -GCATGTATAGAACATAAGGTGTCTC-3’；SEQ ID N0.2:公共引物对中的反义引物 5’ -GAGACACCTTATGTTCTATACATGC-3’。
上述技术方案中，所述常规多重PCR组件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、双蒸水。
上述技术方案中，所述针对常见白血病融合基因的多重引物为分别针对E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常规白血病融合基因的特异性引物对。优选的
技术方案中，所述针对常见白血病融合基因的多重引物具体如以下核苷酸序列所示:
权利要求
1.一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，所述多重PCR试剂盒包括:常规多重PCR组件，针对常见白血病融合基因的多重引物；其特征在于，还包括公共引物对，所述公共引物对包括以下核苷酸序列: SEQ ID N0.1:公共引物对中的正义引物 5’-GCATGTATAGAACATAAGG TGTCTC-3’；SEQ IDN0.2:公共引物对中的反义引物 5’ -GAGACACCTTA TGTTCTATACATGC-3’ ； 所述常规多重PCR组件包括:cDNA模板、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、双蒸水；所述针对常见白血病融合基因的多重引物为分别针对E2A/PBX1、TEL/AML1、SIL/TAL1、TLS/ERG、HOXll常规白血病融合基因的特异性引物对，所述针对常见白血病融合基因的多重引物具体如以下核苷酸序列所示:
2.根据权利要求
1所述一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，其特征在于，每20yL的PCR反应体系中公共引物的量为5 12pmol。
3.根据权利要求
2所述一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，其特征在于，每20μ L的PCR反应体系中每一条带有公共引物的特异性引物的量为1Χ10_6 1Χ10_8pmol ο
专利摘要
本发明公开了一种多重PCR扩增方法以及用于多重PCR扩增的试剂盒；所述多重PCR扩增方法包括了设计公共引物以及带有公共引物的多重引物的步骤，所述公共引物设计应遵循两条原则(1)任何优化的扩增条件下，公共引物与待测模板进行扩增时无特异性产物；(2)当带有公共引物的多重引物扩增得到特异性产物时，公共引物对具有扩增所述特异性产物的能力；然后配置多重PCR体系进行扩增。本发明由于公共引物的引入，使反应体系内的序列特异性引物对浓度下降4个以上对数级别，如此低浓度的多重引物在同一个反应体系中出现相互作用的几率将大大降低，不仅可解决不同引物对相互干扰这一多重PCR中的技术瓶颈，亦为加入新的引物对、增加检测基因数量创造前提条件。
文档编号C12Q1/68GKCN102352411 B发布类型授权 专利申请号CN 201110298119
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月29日
发明者孙万平, 王伟大, 姚利, 陈燕, 李凯, 陈子兴 申请人:苏州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),
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