近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法
专利名称:近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于生物真菌的检测技术范围，具体涉及近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。
背景技术：
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,简称LAMP)是针对靶序列上6个特异性位点，设计2对特殊的引物，并通过具有链置换活性的DNA聚合酶，在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物。现已有技术将LAMP应用于巨细胞病毒，分枝杆菌，沙门菌，巴西副球孢子菌，非洲锥体虫等的检测。其特异性和高效性的关键在于靶基因的选择和引物的设计。
近年来，随着体内留置导管增多，光谱抗生素，免疫抑制剂，糖皮质激素，抗肿瘤化疗药物的广泛使用，及器官移植的广泛开展，真菌血流感染的比例随之增高，念珠菌血症占主导地位。公开号为CN101381775的中国专利申请(申请号200810157907. 3)公开了白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。而近平滑念珠菌的LAMP检测方法尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测试剂盒含有所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物以及环介导等温扩增反应试剂。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，对待检测样品经过培养后提取DNA，得DNA模板，利用权利要求
I所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物进行环介导等温扩增，然后进行判读。
环介导等温扩增的反应体系中混合引物SEQ ID NO I 4各序列的摩尔比为8 : 8 : I : I。
环介导等温扩增的反应体系组成如下20mM pH8. 8的Tris-HCl，IOmM KCL,IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0. I % Triton X-100,3. 6μ I 混合引物，8U bstDNA聚合酶，I. 5 μ IDNA 模板，I. 2mM dNTP, 0. 8M 甜菜碱，加 H2O 至 20 μ I
可以通过浊度、SYBR green I荧光反应的颜色或琼脂糖凝胶电泳的条带形状进行判读。
利用本发明对近平滑念珠菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速的优点。
具体实施方式
本发明关键在于靶基因选择及引物设计。本发明的发明人选择近平滑念珠菌保守序列中的一段特殊序列作为靶基因，在GenBank中查询比对后确定其为近平滑念珠菌所特有。针对此序列,采用primerexplorer V3软件,进行引物设计。软件给出候选引物1000组。最终获得以下2对引物，引物序列为
SEQ ID NO I
5’ -GCCTACCAAAGCAAAGTTTTCAAAA-GAATGAAAAGTGCTTAACTGC-3’ ；
SEQ ID NO 2
5’ -GGCCTGCCAGAGATTAAACTC-CCGTTGTTGAAAGTTTTGAC-3’ ；
SEQ ID NO 3
5， -TAGGTGAACCTGCGGAAG-3，；
SEQ ID NO 4
5， -GATGCGAGAACCAAGAG-3，。
实验证实，使用该组引物检测近平滑念珠菌的特异性和敏感性均较好。
下面通过具体实施方式
对本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法做进一步说明。
I.实验材料
(I)实验菌株的选择
实验菌株有已知近平滑念珠菌的标准菌株及经常规鉴定的念珠菌。并且采用本实验建立的方法对临床血培养瓶中的未知念珠菌进行了检测。
(2)试剂采购
bstDNA聚合酶来自New England Biolabs,甜菜碱来自Sigma公司，溶细胞酶来自Solarbio，引物的合成由生工生物工程有限公司完成。
2. DNA 提取
I)简易法对于纯菌(已知近平滑念珠菌的标准菌株及经常规鉴定的念珠菌)，将新鲜培养的待检菌制成菌悬液，100°c煮沸10分钟，提取上清液，-20°c保存留用。试剂盒法采用MyLab酵母基因组DNA提取试剂盒(北京美莱博医学科技有限公司)，按照厂家的操作说明书提取DNA。
2)血培养瓶中的待检菌，则采用碱洗法提取。具体步骤首先在Iml碱洗液(O. 5MNaOHand O. 05M枸橼酸钠)中加入O. 5ml血培养液，充分混匀后于13000转/秒离心5分钟，弃上清，取沉淀，加入O. 5M Tris-HCl (ρΗ8· 0,0. 5ml)，13000转/秒离心5分钟，再弃上清，取沉淀，加入 Tris-EDTA (O. lml，IOmM Tris-HCl ρΗ8· O 含 ImM EDTA)和溶细胞酶(20 μ 1，
O.5mg/ml)于30°C存放I小时，再于100°C加热I小时，冰冻溶解两次，最后于13000转/秒离心15分钟，取上清_20°C保存留用。
3. LAMP 步骤
(I)引物配制将所有引物配置为ΙΟμΜ使用液，再将SEQ ID NO I 4按8 8 I I比例配制为混合引物。
(2)反应体系反应体系总计 20 μ I。包括20mM pH8. 8 的 Tris-HCl，IOmM KCL,IOmM (NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. 1% TritonX-100, 3. 6 μ I 混合引物，8U bstDNA 聚合酶，I. 5μ IDNA 模板，I. 2mM dNTP, O. 8M 甜菜碱，加 H2O 至 20 μ I。
⑶LAMP反应将内含20 μ I反应体系的反应管于64°C恒温模块加热60分钟，然后再加热至80°C 10分钟，将bstDNA聚合酶灭活。
(4)结果判读由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果，反应后管内清澈者为阴性，管内浑浊或有白色沉淀者为阳性；也可在反应结束后于反应管中加入荧光物质SYBR green I,荧光物质由橙色变为绿色即为反应阳性；将反应产物于琼脂糖凝胶电泳，跑出阶梯状条带者即为反应阳性，无条带者为阴性。
该方法具有以下优点
(I)敏感性高按照试剂盒法提取酵母DNA，使其在终反应体系中具有相当于101个真菌细胞的DNA量即可获得阳性结果。
(2)快速检测从纯菌落DNA提取，至结果判读只需大约2小时。
(3)特异性强此实验引物仅对近平滑念珠菌进行特异性扩增，经平行试验检测白念珠菌，热带念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，新型隐球菌，乳酒酵母菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，均为阴性结果。
(4)所需仪器简单主要仪器设备仅需一恒温加热模块或一恒温水浴箱即可。
需要说明的是，由于敏感性极高，要确保操作规范，防止污染，以避免结果发生假阳性。
本发明的效果还得到了大量临床病例的验证，下面进行举例说明。
例1，男性，45岁，临床诊断为梗阻性黄疸、胆囊癌术后，其血培养标本在血培养仪报告阳性后，转种沙保若培养基培养2天后，取纯菌落于O. 45% NaCl液(PH5. 5-7. 2)配制为(1.8-2. 2)麦氏单位菌悬液，选用Vitek II YST鉴定卡，按相关操作规程操作Vitek II仪器后，于24小时后诊断为近平滑念珠菌感染。我们则在血培养仪报告阳性，涂片显示为真菌感染后，直接从血培养瓶中提取DNA，用本发明提供的近平滑念珠菌特异性引物(序列分别如SEQ ID NO I 4所示)，采用上述LAMP方法检测其DNA，反应结束后，于反应试管中加入SYBR green I，结果显色为绿色，据此确定为近平滑念珠菌感染，从提取DNA到LAMP反应和判读用时4 5小时。
例2，男性，84岁，临床诊断为脑梗死，其血培养标本在血培养仪报告阳性后，经沙保若培养基培养3天后，取单个菌落转种于CHROMagar念珠菌显色培养基和玉米-吐温80培养基，结果显色培养基显示为蓝色，玉米-吐温显示假菌丝，诊断为热带念珠菌。同例1，我们于血培养仪报告阳性，涂片显示为真菌感染后，直接于血培养瓶中提取DNA，用LAMP方法进行检测，反应结果为阴性，即可排除近平滑念珠菌感染。
权利要求
1.近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其特征在于，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
2.近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求
I所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物以及环介导等温扩增反应试剂。
专利摘要
本发明提供了近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。利用本发明对近平滑念珠菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作简便的优点。
文档编号C12N15/11GKCN102312010 B发布类型授权 专利申请号CN 201110303598
公开日2013年2月20日 申请日期2011年10月9日
发明者沈定霞, 王凯飞, 刘朝军, 叶丽艳, 郭玲, 张有江 申请人:中国人民解放军总医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),
技术领域：
本发明属于生物真菌的检测技术范围，具体涉及近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。
背景技术：
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,简称LAMP)是针对靶序列上6个特异性位点，设计2对特殊的引物，并通过具有链置换活性的DNA聚合酶，在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物。现已有技术将LAMP应用于巨细胞病毒，分枝杆菌，沙门菌，巴西副球孢子菌，非洲锥体虫等的检测。其特异性和高效性的关键在于靶基因的选择和引物的设计。
近年来，随着体内留置导管增多，光谱抗生素，免疫抑制剂，糖皮质激素，抗肿瘤化疗药物的广泛使用，及器官移植的广泛开展，真菌血流感染的比例随之增高，念珠菌血症占主导地位。公开号为CN101381775的中国专利申请(申请号200810157907. 3)公开了白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。而近平滑念珠菌的LAMP检测方法尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测试剂盒含有所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物以及环介导等温扩增反应试剂。
本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，对待检测样品经过培养后提取DNA，得DNA模板，利用权利要求
I所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物进行环介导等温扩增，然后进行判读。
环介导等温扩增的反应体系中混合引物SEQ ID NO I 4各序列的摩尔比为8 : 8 : I : I。
环介导等温扩增的反应体系组成如下20mM pH8. 8的Tris-HCl，IOmM KCL,IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0. I % Triton X-100,3. 6μ I 混合引物，8U bstDNA聚合酶，I. 5 μ IDNA 模板，I. 2mM dNTP, 0. 8M 甜菜碱，加 H2O 至 20 μ I
可以通过浊度、SYBR green I荧光反应的颜色或琼脂糖凝胶电泳的条带形状进行判读。
利用本发明对近平滑念珠菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速的优点。
具体实施方式
本发明关键在于靶基因选择及引物设计。本发明的发明人选择近平滑念珠菌保守序列中的一段特殊序列作为靶基因，在GenBank中查询比对后确定其为近平滑念珠菌所特有。针对此序列,采用primerexplorer V3软件,进行引物设计。软件给出候选引物1000组。最终获得以下2对引物，引物序列为
SEQ ID NO I
5’ -GCCTACCAAAGCAAAGTTTTCAAAA-GAATGAAAAGTGCTTAACTGC-3’ ；
SEQ ID NO 2
5’ -GGCCTGCCAGAGATTAAACTC-CCGTTGTTGAAAGTTTTGAC-3’ ；
SEQ ID NO 3
5， -TAGGTGAACCTGCGGAAG-3，；
SEQ ID NO 4
5， -GATGCGAGAACCAAGAG-3，。
实验证实，使用该组引物检测近平滑念珠菌的特异性和敏感性均较好。
下面通过具体实施方式
对本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测方法做进一步说明。
I.实验材料
(I)实验菌株的选择
实验菌株有已知近平滑念珠菌的标准菌株及经常规鉴定的念珠菌。并且采用本实验建立的方法对临床血培养瓶中的未知念珠菌进行了检测。
(2)试剂采购
bstDNA聚合酶来自New England Biolabs,甜菜碱来自Sigma公司，溶细胞酶来自Solarbio，引物的合成由生工生物工程有限公司完成。
2. DNA 提取
I)简易法对于纯菌(已知近平滑念珠菌的标准菌株及经常规鉴定的念珠菌)，将新鲜培养的待检菌制成菌悬液，100°c煮沸10分钟，提取上清液，-20°c保存留用。试剂盒法采用MyLab酵母基因组DNA提取试剂盒(北京美莱博医学科技有限公司)，按照厂家的操作说明书提取DNA。
2)血培养瓶中的待检菌，则采用碱洗法提取。具体步骤首先在Iml碱洗液(O. 5MNaOHand O. 05M枸橼酸钠)中加入O. 5ml血培养液，充分混匀后于13000转/秒离心5分钟，弃上清，取沉淀，加入O. 5M Tris-HCl (ρΗ8· 0,0. 5ml)，13000转/秒离心5分钟，再弃上清，取沉淀，加入 Tris-EDTA (O. lml，IOmM Tris-HCl ρΗ8· O 含 ImM EDTA)和溶细胞酶(20 μ 1，
O.5mg/ml)于30°C存放I小时，再于100°C加热I小时，冰冻溶解两次，最后于13000转/秒离心15分钟，取上清_20°C保存留用。
3. LAMP 步骤
(I)引物配制将所有引物配置为ΙΟμΜ使用液，再将SEQ ID NO I 4按8 8 I I比例配制为混合引物。
(2)反应体系反应体系总计 20 μ I。包括20mM pH8. 8 的 Tris-HCl，IOmM KCL,IOmM (NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. 1% TritonX-100, 3. 6 μ I 混合引物，8U bstDNA 聚合酶，I. 5μ IDNA 模板，I. 2mM dNTP, O. 8M 甜菜碱，加 H2O 至 20 μ I。
⑶LAMP反应将内含20 μ I反应体系的反应管于64°C恒温模块加热60分钟，然后再加热至80°C 10分钟，将bstDNA聚合酶灭活。
(4)结果判读由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果，反应后管内清澈者为阴性，管内浑浊或有白色沉淀者为阳性；也可在反应结束后于反应管中加入荧光物质SYBR green I,荧光物质由橙色变为绿色即为反应阳性；将反应产物于琼脂糖凝胶电泳，跑出阶梯状条带者即为反应阳性，无条带者为阴性。
该方法具有以下优点
(I)敏感性高按照试剂盒法提取酵母DNA，使其在终反应体系中具有相当于101个真菌细胞的DNA量即可获得阳性结果。
(2)快速检测从纯菌落DNA提取，至结果判读只需大约2小时。
(3)特异性强此实验引物仅对近平滑念珠菌进行特异性扩增，经平行试验检测白念珠菌，热带念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，新型隐球菌，乳酒酵母菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，均为阴性结果。
(4)所需仪器简单主要仪器设备仅需一恒温加热模块或一恒温水浴箱即可。
需要说明的是，由于敏感性极高，要确保操作规范，防止污染，以避免结果发生假阳性。
本发明的效果还得到了大量临床病例的验证，下面进行举例说明。
例1，男性，45岁，临床诊断为梗阻性黄疸、胆囊癌术后，其血培养标本在血培养仪报告阳性后，转种沙保若培养基培养2天后，取纯菌落于O. 45% NaCl液(PH5. 5-7. 2)配制为(1.8-2. 2)麦氏单位菌悬液，选用Vitek II YST鉴定卡，按相关操作规程操作Vitek II仪器后，于24小时后诊断为近平滑念珠菌感染。我们则在血培养仪报告阳性，涂片显示为真菌感染后，直接从血培养瓶中提取DNA，用本发明提供的近平滑念珠菌特异性引物(序列分别如SEQ ID NO I 4所示)，采用上述LAMP方法检测其DNA，反应结束后，于反应试管中加入SYBR green I，结果显色为绿色，据此确定为近平滑念珠菌感染，从提取DNA到LAMP反应和判读用时4 5小时。
例2，男性，84岁，临床诊断为脑梗死，其血培养标本在血培养仪报告阳性后，经沙保若培养基培养3天后，取单个菌落转种于CHROMagar念珠菌显色培养基和玉米-吐温80培养基，结果显色培养基显示为蓝色，玉米-吐温显示假菌丝，诊断为热带念珠菌。同例1，我们于血培养仪报告阳性，涂片显示为真菌感染后，直接于血培养瓶中提取DNA，用LAMP方法进行检测，反应结果为阴性，即可排除近平滑念珠菌感染。
权利要求
1.近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其特征在于，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
2.近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求
I所述的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物以及环介导等温扩增反应试剂。
专利摘要
本发明提供了近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物和试剂盒及检测方法。本发明提供的近平滑念珠菌环介导等温扩增的快速检测引物，包括一对内引物和一对外引物，其中，所述的一对内引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，所述的一对外引物的序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。利用本发明对近平滑念珠菌进行检测具有敏感性高、特异性强、检测快速、操作简便的优点。
文档编号C12N15/11GKCN102312010 B发布类型授权 专利申请号CN 201110303598
公开日2013年2月20日 申请日期2011年10月9日
发明者沈定霞, 王凯飞, 刘朝军, 叶丽艳, 郭玲, 张有江 申请人:中国人民解放军总医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),
最新回复(0)