一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法
专利名称:一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法
技术领域：
本发明属于食用菌栽培领域，涉及蛹虫草的人工培育方法，特指以活体桑蚕幼虫为寄主栽培蛹虫草的方法。
背景技术：
蛹虫草亦称北冬虫夏草或北虫草，是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌，是寄生于夜蛾科等蛹体上一种虫草。研究表明，蛹虫草有效化学成分的种类及含量与冬虫夏草相同或相似，对人体也具有相同或相似的功能，它们均含有虫草酸、虫草素、虫草多糖、SOD酶和麦角留醇等生物活性物质，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗辐射、降血糖、降血脂和延缓衰老等作用(韦会平等，2004)。
与冬虫夏草相比，蛹虫草对生长环境的要求较低，人工培养可行。国内外已有一些关于蛹虫草栽培技术成果的公开报道。例如在我国公开和授权的专利包括“蛹虫草等虫草的人工培养方法(公开号CN1167825) ”，将蛹虫草菌株接种于以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养基上，或用人工饲料无菌养蚕法得到的蚕蛹上，在适当的环境下培养成具有子实体的蛹虫草；“蚕蛹虫草的人工培育方法(公开号CN1034390) ”，将蛹虫草菌接种于培养基上，置一定的温、湿、光条件下培养，数天后再将经过体表消毒的蚕蛹加入，或将该菌制成菌液，注入蛹体中，然后继续培养，数天后即可获取蚕蛹虫草子实体；“蛹虫草的快速高产人工培育方法(公开号CN1092105) ”，将蛹虫草菌的分生孢子制成孢子悬浊液，用昆虫针或类似物蘸取菌液，刺入蚕蛹，待营养菌丝在体内充分生长，蚕蛹僵硬后，用多孔的材料在其上覆盖一层或将僵蛹插入有孔易保湿的材料上，在适当的温度、湿度、光线下培养即可获取大量的蛹虫草；“蛹虫草菌高产栽培方法(公开号CN1200403) ”，以优质稻米加营养液为培养基，在PH8-8. 5、温度23±2°C，培养蛹虫草子实体，成活率及出子实体率100% ;“蛹虫草的一种高效培育方法(公开号CNlOl 182471) ”，将发酵后形成的蛹虫草菌丝体接种到经过体表消毒处理的蚕蛹或大米培养基上，继续培养，置一定的合适的温度、湿度和必要的通风、光照管理，数天后即可获取大量蛹虫草子实体；“一种蚕蛹虫草的培育方法(公开号CN101215527)”，以家蚕蛹为宿主，人工接种蛹虫草菌，模拟蛹虫草自然生态环境，人工培育而成，接种成功率、接种后的僵化率达95%以上，子实体的长出率达90%以上；“一种活体蚕蛹栽培蛹虫草的方法(公开号CN101720627A) ”，蛹虫草菌种通过注射的方法接入活体蚕蛹体内，在18_25°C的培养室培养10-15天；12天开始增加光照，促进子实体形成。目前有关蛹虫草培育的国内外专利中，主要用蚕蛹、大米和人工合成培养基培育蛹虫草。
大米和人工合成培养基培育的蛹虫草子实体有子座而无菌核，在一定程度上影响了医疗保健功效和商品价值，而用蚕蛹培育的蚕蛹草虽有子座和菌核，但蚕蛹是蚕经过吐丝结茧而产生的，占5龄蚕体质量约40% (w/w)的丝腺蛋白未能被蛹虫草菌利用。5龄桑蚕幼虫体内含有大量具有重要生理活性的物质如黄酮(具有抑菌和抗氧化等作用)和I-脱氧野尻霉素(具有降血糖作用)(贺伟强等，2005)，若能用5龄桑蚕幼虫培育蛹虫草，则能有效提高蛹虫草的药理价值，同时，采用桑蚕幼虫作栽培材料较蚕蛹所需工时短、节省劳动力、成本低，对我国蚕业的综合利用提供了一种新的途径，具有显著的社会和经济效益。
迄今为止，尚未检索到采用桑蚕幼虫培育蛹虫草的专利，仅有少量以研究论文的形式进行报道，如潘中华(2001)用5龄2 7天桑蚕幼虫培育蚕虫草，接种后在22°C进行培养，僵化率为48% 80%，菌种衰退明显；温鲁等(2004)和朱芬娣等(2005)研究了4龄起蚕、5龄起蚕和5龄2 6天的桑蚕幼虫感染蛹虫草菌种情况，结果发现，5龄起蚕至5龄2 4天的桑蚕幼虫感染蛹虫草菌种效果比较理想，僵化率可以达到80%左右。尽管有少量利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的研究报道，然而利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的技术尚不成熟，难以推广，主要存在的缺点为蛹虫草寄主均选择生长时期为4龄 5龄6天的桑蚕幼虫，此生长时期的桑蚕幼虫体内的丝腺蛋白没有完全形成，影响蛹虫草活性物质的积累，此夕卜，因其体内存有大量的肠道微生物，易造成污染，僵化率低；在培养的过程中，有结茧化蛹现象，造成资源浪费。
本发明采用活体熟蚕(此时体内丝腺蛋白最高且无肠道菌)作为寄主，培育蛹虫草，这在国内外尚未见相关报道以及专利公开；同时，本发明采用的培养方法具有桑蚕丝腺 蛋白利用率高、僵化率高(达90%以上)、实验重现性好以及易于操作等优点，适用于大规模栽培，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的问题和缺陷，提供一种利用桑蚕幼虫高效培育蛹虫草的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过选择熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主，在低温麻醉的情况下，接入活化好的蛹虫草菌种，接种结束后，立即放入控温房中进行培养管理，培养结束后，即可获得长有子实体的桑蚕幼虫蛹虫草。
本发明的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，具体包括如下步骤
I.蛹虫草菌种寄主的选择
选择熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
2.蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在19 20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
3.低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在4 6°C环境中)进行低温麻醉20 30min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15 μ L蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
4.培养管理
4. I前期培养管理
先将被接种的熟蚕在19 20°C避光培养3 5h，然后依次在4 6°C避光培养(低温麻醉)5 10h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养(低温麻醉)2 4h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养(低温麻醉)2 4h，在19 20°C避光培养15 20h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
4. 2中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95 %，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，一般为3 5d。随后进入后期培养管理。
4. 3后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为200 400Lx;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间以子实体成熟前期即可，一般为40 50d。
本发明的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法的优点和有益效果是
I.首次利用熟蚕培育蛹虫草，技术工艺简便，易于规模化栽培。
2.前期培养管理中，采用“低温麻醉培养”方法使桑蚕接种成功率得到极大的提高，其僵化率达到90% 100%，子实体长出率达到85% 100%，该方法的栽培成功率均高于文献报道的方法(针对利用桑蚕幼虫培育蛹虫草而言)。
3.与用桑蚕蛹培育的蛹虫草相比，用熟蚕培育的蛹虫草中水溶性蛋白质、多糖、虫草酸、虫草素和腺苷分别提高了 7. 4% 10. 1%、3.4% 4.5%、1.0% 2.6%、0.9%
3.0%和 O. 9% 2. 3%。
图I利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的工艺流程；
图2蛹虫草外观形态的照片(a.实施例I条件下培育的蛹虫草，b.实施例2条件下培育的蛹虫草，c.实施例3条件下培育的蛹虫草)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例I
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在19°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种[0036]将熟蚕放在冰块上(或在4°C环境中)进行低温麻醉20min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
(4)培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在19 °C避光培养5h，然后依次在4°C避光培养(低温麻醉)IOh，在19 °C避光培养12h，在4 °C避光培养(低温麻醉)4h，在19 °C避光培养12h，在4 °C避光培养(低温麻醉)4h，在19°C避光培养20h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为19°C，湿度为85%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，约为5d。随后进入后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为200LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为19°C，湿度为85%，培养时间以子实体成熟前期即可，约为50d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2a所示；其僵化率达到90 %，子实体长出率达到85 % ;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
实施例2
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在5°C环境中)进行低温麻醉25min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
(4)培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在20°C避光培养4h，然后依次在5°C避光培养(低温麻醉)8h，在20°C避光培养llh，在5°C避光培养(低温麻醉)3h，在20°C避光培养llh，在5°C避光培养(低温麻醉)3h，在20°C避光培养18h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为200C，湿度为90%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，为4d。随后进入
后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为300LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为20°C，湿度为90%，培养时间以子实体成熟前期即可，约为45d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2b所示；其僵化率达到100%，子实体长出率达到100%;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
实施例3
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在6°C环境中)进行低温麻醉30min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
⑷培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在20°C避光培养3h，然后依次在6°C避光培养(低温麻醉)5h，在20°C避光培养10h，在6°C避光培养(低温麻醉)2h，在20°C避光培养10h，在6°C避光培养(低温麻醉)2h，在20°C避光培养15h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为20°C，湿度为95%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，约为3d。随后进入后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为400LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为20°C，湿度为95%，培养时间以子实体成熟前期即可，一般为40d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2c所示；其僵化率达到95%，子实体长出率达到93%;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
表I蛹虫草中不同活性物质的比较分析
权利要求
1.一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)寄主的选择选择躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色的熟蚕为寄主； (2)蛹虫草菌种的制备利用生长状态良好的新鲜蛹虫草子实体置于斜面培养基上复壮菌种，待菌丝体见光转黄后刮取斜面培养基上的菌丝体，用无菌水制成菌悬液； (3)接种将所述熟蚕先用冰块或在4 6°C环境中低温麻醉20 30min，然后用注射器在熟蚕的皮下组织中注射15 μ L蛹虫草菌悬液； (4)前期培养管理将步骤(3)接种的熟蚕在19 20°C避光培养3 5h，然后依次在4 6°C避光培养5 10h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养2 4h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养2 4h，在19 20°C避光培养15 20h;然后，将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中捡出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖后进行蛹虫草的中期培养管理； (5)中期培养管理将经步骤(4)培养的熟蚕继续避光培养，通过覆盖黑布的方法遮光；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间为3 5d，随后进入后期培养管理； (6)后期培养管理将经步骤(5)培养的熟蚕在光照的条件下培养，光照强度为200 400Lx，培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间为40 50d。
2.根据权利要求
I所述的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(I)所述的熟蚕为5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫。
3.根据权利要求
I所述的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的菌悬液的浓度为O. Img/μ L0
专利摘要
本发明涉及一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的新方法，该方法是以活体桑熟蚕为寄主，采用注射的方法接种蛹虫草菌，并通过促使桑蚕休眠的方法提高接种成功率，采用本发明的方法后，桑蚕幼虫的僵化率达到90％～100％，子实体长出率达到85％～100％；此外，该方法培育的蛹虫草中的水溶性蛋白质、多糖、虫草酸、虫草素和腺苷含量均比蚕蛹培育的蛹虫草的高。
文档编号A01G1/04GKCN102440149 B发布类型授权 专利申请号CN 201110306713
公开日2013年1月23日 申请日期2011年10月10日
发明者贾俊强, 桂仲争, 吴琼英 申请人:江苏科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (4),
技术领域：
本发明属于食用菌栽培领域，涉及蛹虫草的人工培育方法，特指以活体桑蚕幼虫为寄主栽培蛹虫草的方法。
背景技术：
蛹虫草亦称北冬虫夏草或北虫草，是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌，是寄生于夜蛾科等蛹体上一种虫草。研究表明，蛹虫草有效化学成分的种类及含量与冬虫夏草相同或相似，对人体也具有相同或相似的功能，它们均含有虫草酸、虫草素、虫草多糖、SOD酶和麦角留醇等生物活性物质，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抗辐射、降血糖、降血脂和延缓衰老等作用(韦会平等，2004)。
与冬虫夏草相比，蛹虫草对生长环境的要求较低，人工培养可行。国内外已有一些关于蛹虫草栽培技术成果的公开报道。例如在我国公开和授权的专利包括“蛹虫草等虫草的人工培养方法(公开号CN1167825) ”，将蛹虫草菌株接种于以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养基上，或用人工饲料无菌养蚕法得到的蚕蛹上，在适当的环境下培养成具有子实体的蛹虫草；“蚕蛹虫草的人工培育方法(公开号CN1034390) ”，将蛹虫草菌接种于培养基上，置一定的温、湿、光条件下培养，数天后再将经过体表消毒的蚕蛹加入，或将该菌制成菌液，注入蛹体中，然后继续培养，数天后即可获取蚕蛹虫草子实体；“蛹虫草的快速高产人工培育方法(公开号CN1092105) ”，将蛹虫草菌的分生孢子制成孢子悬浊液，用昆虫针或类似物蘸取菌液，刺入蚕蛹，待营养菌丝在体内充分生长，蚕蛹僵硬后，用多孔的材料在其上覆盖一层或将僵蛹插入有孔易保湿的材料上，在适当的温度、湿度、光线下培养即可获取大量的蛹虫草；“蛹虫草菌高产栽培方法(公开号CN1200403) ”，以优质稻米加营养液为培养基，在PH8-8. 5、温度23±2°C，培养蛹虫草子实体，成活率及出子实体率100% ;“蛹虫草的一种高效培育方法(公开号CNlOl 182471) ”，将发酵后形成的蛹虫草菌丝体接种到经过体表消毒处理的蚕蛹或大米培养基上，继续培养，置一定的合适的温度、湿度和必要的通风、光照管理，数天后即可获取大量蛹虫草子实体；“一种蚕蛹虫草的培育方法(公开号CN101215527)”，以家蚕蛹为宿主，人工接种蛹虫草菌，模拟蛹虫草自然生态环境，人工培育而成，接种成功率、接种后的僵化率达95%以上，子实体的长出率达90%以上；“一种活体蚕蛹栽培蛹虫草的方法(公开号CN101720627A) ”，蛹虫草菌种通过注射的方法接入活体蚕蛹体内，在18_25°C的培养室培养10-15天；12天开始增加光照，促进子实体形成。目前有关蛹虫草培育的国内外专利中，主要用蚕蛹、大米和人工合成培养基培育蛹虫草。
大米和人工合成培养基培育的蛹虫草子实体有子座而无菌核，在一定程度上影响了医疗保健功效和商品价值，而用蚕蛹培育的蚕蛹草虽有子座和菌核，但蚕蛹是蚕经过吐丝结茧而产生的，占5龄蚕体质量约40% (w/w)的丝腺蛋白未能被蛹虫草菌利用。5龄桑蚕幼虫体内含有大量具有重要生理活性的物质如黄酮(具有抑菌和抗氧化等作用)和I-脱氧野尻霉素(具有降血糖作用)(贺伟强等，2005)，若能用5龄桑蚕幼虫培育蛹虫草，则能有效提高蛹虫草的药理价值，同时，采用桑蚕幼虫作栽培材料较蚕蛹所需工时短、节省劳动力、成本低，对我国蚕业的综合利用提供了一种新的途径，具有显著的社会和经济效益。
迄今为止，尚未检索到采用桑蚕幼虫培育蛹虫草的专利，仅有少量以研究论文的形式进行报道，如潘中华(2001)用5龄2 7天桑蚕幼虫培育蚕虫草，接种后在22°C进行培养，僵化率为48% 80%，菌种衰退明显；温鲁等(2004)和朱芬娣等(2005)研究了4龄起蚕、5龄起蚕和5龄2 6天的桑蚕幼虫感染蛹虫草菌种情况，结果发现，5龄起蚕至5龄2 4天的桑蚕幼虫感染蛹虫草菌种效果比较理想，僵化率可以达到80%左右。尽管有少量利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的研究报道，然而利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的技术尚不成熟，难以推广，主要存在的缺点为蛹虫草寄主均选择生长时期为4龄 5龄6天的桑蚕幼虫，此生长时期的桑蚕幼虫体内的丝腺蛋白没有完全形成，影响蛹虫草活性物质的积累，此夕卜，因其体内存有大量的肠道微生物，易造成污染，僵化率低；在培养的过程中，有结茧化蛹现象，造成资源浪费。
本发明采用活体熟蚕(此时体内丝腺蛋白最高且无肠道菌)作为寄主，培育蛹虫草，这在国内外尚未见相关报道以及专利公开；同时，本发明采用的培养方法具有桑蚕丝腺 蛋白利用率高、僵化率高(达90%以上)、实验重现性好以及易于操作等优点，适用于大规模栽培，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的问题和缺陷，提供一种利用桑蚕幼虫高效培育蛹虫草的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过选择熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主，在低温麻醉的情况下，接入活化好的蛹虫草菌种，接种结束后，立即放入控温房中进行培养管理，培养结束后，即可获得长有子实体的桑蚕幼虫蛹虫草。
本发明的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，具体包括如下步骤
I.蛹虫草菌种寄主的选择
选择熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
2.蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在19 20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
3.低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在4 6°C环境中)进行低温麻醉20 30min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15 μ L蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
4.培养管理
4. I前期培养管理
先将被接种的熟蚕在19 20°C避光培养3 5h，然后依次在4 6°C避光培养(低温麻醉)5 10h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养(低温麻醉)2 4h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养(低温麻醉)2 4h，在19 20°C避光培养15 20h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
4. 2中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95 %，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，一般为3 5d。随后进入后期培养管理。
4. 3后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为200 400Lx;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间以子实体成熟前期即可，一般为40 50d。
本发明的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法的优点和有益效果是
I.首次利用熟蚕培育蛹虫草，技术工艺简便，易于规模化栽培。
2.前期培养管理中，采用“低温麻醉培养”方法使桑蚕接种成功率得到极大的提高，其僵化率达到90% 100%，子实体长出率达到85% 100%，该方法的栽培成功率均高于文献报道的方法(针对利用桑蚕幼虫培育蛹虫草而言)。
3.与用桑蚕蛹培育的蛹虫草相比，用熟蚕培育的蛹虫草中水溶性蛋白质、多糖、虫草酸、虫草素和腺苷分别提高了 7. 4% 10. 1%、3.4% 4.5%、1.0% 2.6%、0.9%
3.0%和 O. 9% 2. 3%。
图I利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的工艺流程；
图2蛹虫草外观形态的照片(a.实施例I条件下培育的蛹虫草，b.实施例2条件下培育的蛹虫草，c.实施例3条件下培育的蛹虫草)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例I
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在19°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种[0036]将熟蚕放在冰块上(或在4°C环境中)进行低温麻醉20min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
(4)培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在19 °C避光培养5h，然后依次在4°C避光培养(低温麻醉)IOh，在19 °C避光培养12h，在4 °C避光培养(低温麻醉)4h，在19 °C避光培养12h，在4 °C避光培养(低温麻醉)4h，在19°C避光培养20h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为19°C，湿度为85%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，约为5d。随后进入后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为200LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为19°C，湿度为85%，培养时间以子实体成熟前期即可，约为50d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2a所示；其僵化率达到90 %，子实体长出率达到85 % ;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
实施例2
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在5°C环境中)进行低温麻醉25min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
(4)培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在20°C避光培养4h，然后依次在5°C避光培养(低温麻醉)8h，在20°C避光培养llh，在5°C避光培养(低温麻醉)3h，在20°C避光培养llh，在5°C避光培养(低温麻醉)3h，在20°C避光培养18h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为200C，湿度为90%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，为4d。随后进入
后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为300LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为20°C，湿度为90%，培养时间以子实体成熟前期即可，约为45d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2b所示；其僵化率达到100%，子实体长出率达到100%;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
实施例3
(I)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在20°C避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为O. Img/μ L(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在6°C环境中)进行低温麻醉30min，然后通过喷雾的方法用75%酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15yL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
⑷培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在20°C避光培养3h，然后依次在6°C避光培养(低温麻醉)5h，在20°C避光培养10h，在6°C避光培养(低温麻醉)2h，在20°C避光培养10h，在6°C避光培养(低温麻醉)2h，在20°C避光培养15h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为20°C，湿度为95%，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，约为3d。随后进入后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为400LX ;培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为20°C，湿度为95%，培养时间以子实体成熟前期即可，一般为40d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2 5cm，每条桑蚕躯体上生长3 10个子实体，其外观形态如图2c所示；其僵化率达到95%，子实体长出率达到93%;水溶性蛋白、多糖、虫草素、虫草酸和腺苷等活性物质的含量见表I。
表I蛹虫草中不同活性物质的比较分析
权利要求
1.一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)寄主的选择选择躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色的熟蚕为寄主； (2)蛹虫草菌种的制备利用生长状态良好的新鲜蛹虫草子实体置于斜面培养基上复壮菌种，待菌丝体见光转黄后刮取斜面培养基上的菌丝体，用无菌水制成菌悬液； (3)接种将所述熟蚕先用冰块或在4 6°C环境中低温麻醉20 30min，然后用注射器在熟蚕的皮下组织中注射15 μ L蛹虫草菌悬液； (4)前期培养管理将步骤(3)接种的熟蚕在19 20°C避光培养3 5h，然后依次在4 6°C避光培养5 10h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养2 4h，在19 20°C避光培养10 12h，在4 6°C避光培养2 4h，在19 20°C避光培养15 20h;然后，将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中捡出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖后进行蛹虫草的中期培养管理； (5)中期培养管理将经步骤(4)培养的熟蚕继续避光培养，通过覆盖黑布的方法遮光；培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间为3 5d，随后进入后期培养管理； (6)后期培养管理将经步骤(5)培养的熟蚕在光照的条件下培养，光照强度为200 400Lx，培养温度为19 20°C，湿度为85% 95%，培养时间为40 50d。
2.根据权利要求
I所述的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(I)所述的熟蚕为5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫。
3.根据权利要求
I所述的利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的菌悬液的浓度为O. Img/μ L0
专利摘要
本发明涉及一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的新方法，该方法是以活体桑熟蚕为寄主，采用注射的方法接种蛹虫草菌，并通过促使桑蚕休眠的方法提高接种成功率，采用本发明的方法后，桑蚕幼虫的僵化率达到90％～100％，子实体长出率达到85％～100％；此外，该方法培育的蛹虫草中的水溶性蛋白质、多糖、虫草酸、虫草素和腺苷含量均比蚕蛹培育的蛹虫草的高。
文档编号A01G1/04GKCN102440149 B发布类型授权 专利申请号CN 201110306713
公开日2013年1月23日 申请日期2011年10月10日
发明者贾俊强, 桂仲争, 吴琼英 申请人:江苏科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (4),
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