从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法
专利名称:从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，属于生物医药领域。
技术背景
间充质干细胞
mesenchymal stem cells, MSC
是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、 内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
目前，脂肪干细胞的分离主要是从抽取的脂肪组织来源，已有的专利申请目前都是从脂肪组织中提取，例如一种脂肪干细胞的分离培养方法(申请号 CN201010568873.4，公开号CN102002478A)；人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法(申请号CN201010120944. 4，公开号CN102002475A)；—种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用(申请号CN200410084407.3，公开号CN1778905)；从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法(申请号CN201010580537. 1，公开号CN101984049A)。还尚未有人报道从膨胀液中分离脂肪干细胞的专利。
膨胀吸脂是目前在外科吸脂手术中应用的最为广泛一种技术，主要是在手术前灌注超量低渗膨胀液，该液具有止痛、止血、疏松及裂解脂肪细胞的作用。本发明人从临床应用中发现，抽脂过程中获得的膨胀液也含有一定量的脂肪干细胞。这为干细胞的获取提供了新的来源，增添了新的脂肪干细胞来源途径。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液混合液约500ml置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。，将其分装入50ml离心管。(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液放入离心机以1500rpm离心5min。离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀。每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液。(3)细胞的洗涤加入5ml DMEM (不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤。过滤以后的液体以1200rpm离心 3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞。再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次。
(4)细胞培养
将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基。37°C，5%0)2培养。[0007](5)细胞鉴定
对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。
( 6 )对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。
进一步的，步骤1中所述的膨胀液是在IOOOml生理盐水中加入20ml利多卡因和Iml 肾上腺素制备得到的。
进一步的，步骤2所述PBS液的加入量为3 ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。
进一步的，步骤4中接种密度为5000个/cm2，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml ο
进一步的，步骤5中的免疫表型鉴定是指对⑶73，⑶90，⑶105和⑶45，⑶；34， CD14, CDllb, CD19，HLA-DR 进行检测。
进一步的，步骤6中的分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能测试。
本发明上述方案中采用的材料和试剂如下 膨胀液利多卡因20ML/L肾上腺素1ML/L ； 红细胞裂解液Solarbio，北京；
DMEM (不含血清)HyClone，美国；
间充质干细胞培养基Stemcell美国；
抗体BD，美国；
离心管Coring，美国；
移液管Coring，美国；
细胞滤网BD，美国；
移液枪BRAND，德国；
离心机湘麓，湖南；
培养瓶Coring，美国；
细胞培养箱Sanyo，日本；
流式细胞仪，美国。
本发明创造了一种新的脂肪干细胞来源，在细胞形态、免疫表型等方面与脂肪组织来源的间充质干细胞无明显差别。因此，本发明为脂肪干细胞的分离提供了新的途径。
图1脂肪组织来源脂肪干细胞。
图2膨胀液来源脂肪干细胞。
图3细胞生长曲线。
图4细胞分化潜能鉴定一成骨分化实验结果。
图5细胞分化潜能鉴定一成脂分化实验结果。
图6细胞分化潜能鉴定一成软骨分化实验结果。
具体实施方式
实施例
1.膨胀液的获取
抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液混合液约500ml置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，移液枪抽取下层红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。
2.膨胀液的处理
将收集到的膨胀液放入离心机以1500rpm离心5min。离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀。每管用:3ml PBS液悬浮，按1:2的体积比加入红细胞裂解液，室温静置 5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液取沉淀备用。
3.脂肪干细胞的分离
将所得沉淀物用低糖DMEM培养基悬浮，细胞滤器过滤，然后将过滤液体以1200rpm离心:3min，沉淀即为要获取细胞。再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次，去除红细胞裂解液，得到细胞即为目的细胞。
4.脂肪干细胞的培养
将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，加入IOml间充质干细胞培养基，37°C，5%C02培养，4 换液继续培养。
5.细胞鉴定
对分离培养贴壁细胞进行免疫表型CD73，⑶90，CD105和CD45，COM, CD14, CDllb, ⑶19，HLA-DR检测结果表明，细胞传至第五代时，免疫表型⑶73，⑶90，⑶105均呈高表达，而表型⑶45，⑶；34，⑶14，⑶19，HLA-DR均呈现低表达。并且细胞可以向成脂、成骨和成软骨三向分化。这与国际干细胞协会规定的间充质干细胞定义相符。因此，分离细胞确为脂肪间充质干细胞。
与脂肪组织来源间充质干细胞比较。
表1.细胞传至第五代时免疫表型检测结果
权利要求
1.一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。
2.(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液分装入50ml离心管，放入离心机以1500rpm离心 5min。
3.离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀，每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液；(3)细胞的洗涤加入5ml DMEM(不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤，过滤以后的液体以1200rpm离心;3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞，再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次；(4)细胞培养将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基，37°C，5%C02 培养；(5)细胞鉴定对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。
4.(6)对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。
5.如权利要求
1所述的方法，其中步骤1所述的膨胀液是在IOOOml生理盐水中加入 20ml利多卡因和Iml肾上腺素制备得到的。
6.如权利要求
1所述的方法，其中步骤2所述PBS液的加入量为3ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。
7.如权利要求
1-3任一项所述的方法，其中步骤4所述的接种密度为5000个/cm2，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml。
8.如权利要求
1-4任一项所述的方法，其中步骤5所述的免疫表型鉴定是指对CD73， CD90, CD105 和 CD45, CD34，CD14, CDllb, CD19，HLA-DR 进行检测。
9.如权利要求
1-5任一项所述的方法，其中步骤6所述分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向诱导分化，染色观察分化效果。
专利摘要
本发明公开了一种从外科吸脂手术中的膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，提供了一种新的脂肪干细胞来源，在细胞形态、免疫表型等方面与脂肪组织来源的间充质干细胞无明显差别。因此，本发明为脂肪干细胞的分离提供了新的途径。
文档编号C12N5/0775GKCN102329773SQ201110310461
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日
发明者海泉, 郑榆坤 申请人:成都清科生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，属于生物医药领域。
技术背景
间充质干细胞
mesenchymal stem cells, MSC
是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、 内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
目前，脂肪干细胞的分离主要是从抽取的脂肪组织来源，已有的专利申请目前都是从脂肪组织中提取，例如一种脂肪干细胞的分离培养方法(申请号 CN201010568873.4，公开号CN102002478A)；人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法(申请号CN201010120944. 4，公开号CN102002475A)；—种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用(申请号CN200410084407.3，公开号CN1778905)；从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法(申请号CN201010580537. 1，公开号CN101984049A)。还尚未有人报道从膨胀液中分离脂肪干细胞的专利。
膨胀吸脂是目前在外科吸脂手术中应用的最为广泛一种技术，主要是在手术前灌注超量低渗膨胀液，该液具有止痛、止血、疏松及裂解脂肪细胞的作用。本发明人从临床应用中发现，抽脂过程中获得的膨胀液也含有一定量的脂肪干细胞。这为干细胞的获取提供了新的来源，增添了新的脂肪干细胞来源途径。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液混合液约500ml置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。，将其分装入50ml离心管。(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液放入离心机以1500rpm离心5min。离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀。每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液。(3)细胞的洗涤加入5ml DMEM (不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤。过滤以后的液体以1200rpm离心 3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞。再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次。
(4)细胞培养
将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基。37°C，5%0)2培养。[0007](5)细胞鉴定
对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。
( 6 )对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。
进一步的，步骤1中所述的膨胀液是在IOOOml生理盐水中加入20ml利多卡因和Iml 肾上腺素制备得到的。
进一步的，步骤2所述PBS液的加入量为3 ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。
进一步的，步骤4中接种密度为5000个/cm2，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml ο
进一步的，步骤5中的免疫表型鉴定是指对⑶73，⑶90，⑶105和⑶45，⑶；34， CD14, CDllb, CD19，HLA-DR 进行检测。
进一步的，步骤6中的分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能测试。
本发明上述方案中采用的材料和试剂如下 膨胀液利多卡因20ML/L肾上腺素1ML/L ； 红细胞裂解液Solarbio，北京；
DMEM (不含血清)HyClone，美国；
间充质干细胞培养基Stemcell美国；
抗体BD，美国；
离心管Coring，美国；
移液管Coring，美国；
细胞滤网BD，美国；
移液枪BRAND，德国；
离心机湘麓，湖南；
培养瓶Coring，美国；
细胞培养箱Sanyo，日本；
流式细胞仪，美国。
本发明创造了一种新的脂肪干细胞来源，在细胞形态、免疫表型等方面与脂肪组织来源的间充质干细胞无明显差别。因此，本发明为脂肪干细胞的分离提供了新的途径。
图1脂肪组织来源脂肪干细胞。
图2膨胀液来源脂肪干细胞。
图3细胞生长曲线。
图4细胞分化潜能鉴定一成骨分化实验结果。
图5细胞分化潜能鉴定一成脂分化实验结果。
图6细胞分化潜能鉴定一成软骨分化实验结果。
具体实施方式
实施例
1.膨胀液的获取
抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液混合液约500ml置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，移液枪抽取下层红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。
2.膨胀液的处理
将收集到的膨胀液放入离心机以1500rpm离心5min。离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀。每管用:3ml PBS液悬浮，按1:2的体积比加入红细胞裂解液，室温静置 5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液取沉淀备用。
3.脂肪干细胞的分离
将所得沉淀物用低糖DMEM培养基悬浮，细胞滤器过滤，然后将过滤液体以1200rpm离心:3min，沉淀即为要获取细胞。再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次，去除红细胞裂解液，得到细胞即为目的细胞。
4.脂肪干细胞的培养
将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，加入IOml间充质干细胞培养基，37°C，5%C02培养，4 换液继续培养。
5.细胞鉴定
对分离培养贴壁细胞进行免疫表型CD73，⑶90，CD105和CD45，COM, CD14, CDllb, ⑶19，HLA-DR检测结果表明，细胞传至第五代时，免疫表型⑶73，⑶90，⑶105均呈高表达，而表型⑶45，⑶；34，⑶14，⑶19，HLA-DR均呈现低表达。并且细胞可以向成脂、成骨和成软骨三向分化。这与国际干细胞协会规定的间充质干细胞定义相符。因此，分离细胞确为脂肪间充质干细胞。
与脂肪组织来源间充质干细胞比较。
表1.细胞传至第五代时免疫表型检测结果
权利要求
1.一种从膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，由以下步骤组成(1)膨胀液的收集抽脂前向所要抽取部位灌注过量低渗膨胀液，然后将抽脂过程中获取的脂肪与膨胀液置于室温下放置lOmin，待脂肪与膨胀液完全分离后，用移液枪吸取黄色脂肪下面部分的红色液体，即为含有脂肪干细胞的膨胀液。
2.(2)膨胀液的处理将收集到的膨胀液分装入50ml离心管，放入离心机以1500rpm离心 5min。
3.离心吸取弃掉离心管上面部分的液体，收集沉淀，每管用PBS液悬浮，加入红细胞裂解液室温静置5分钟，以1200rpm离心3min，弃上清液；(3)细胞的洗涤加入5ml DMEM(不含血清)将沉淀吹散，细胞滤器过滤，过滤以后的液体以1200rpm离心;3min，沉淀即为要获取的脂肪间充质干细胞，再加入DMEM (不含血清)重复以上的操作洗涤3次；(4)细胞培养将获取细胞接种至75cm2细胞培养瓶内，接种，加入间充质干细胞培养基，37°C，5%C02 培养；(5)细胞鉴定对分离培养的细胞与脂肪来源干细胞进行形态学、免疫表型鉴定并进行比较。
4.(6)对膨胀液来源脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨三向分化潜能鉴定。
5.如权利要求
1所述的方法，其中步骤1所述的膨胀液是在IOOOml生理盐水中加入 20ml利多卡因和Iml肾上腺素制备得到的。
6.如权利要求
1所述的方法，其中步骤2所述PBS液的加入量为3ml，红细胞裂解液加入的体积量为沉淀和PBS液总体积的1-2倍。
7.如权利要求
1-3任一项所述的方法，其中步骤4所述的接种密度为5000个/cm2，间充质干细胞培养基的加入量为10 ml。
8.如权利要求
1-4任一项所述的方法，其中步骤5所述的免疫表型鉴定是指对CD73， CD90, CD105 和 CD45, CD34，CD14, CDllb, CD19，HLA-DR 进行检测。
9.如权利要求
1-5任一项所述的方法，其中步骤6所述分化潜能鉴定是对分离细胞进行成脂、成骨和成软骨三向诱导分化，染色观察分化效果。
专利摘要
本发明公开了一种从外科吸脂手术中的膨胀液中分离脂肪间充质干细胞的方法，提供了一种新的脂肪干细胞来源，在细胞形态、免疫表型等方面与脂肪组织来源的间充质干细胞无明显差别。因此，本发明为脂肪干细胞的分离提供了新的途径。
文档编号C12N5/0775GKCN102329773SQ201110310461
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日
发明者海泉, 郑榆坤 申请人:成都清科生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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