芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法
专利名称:芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法
技术领域：
本发明涉及植物的组织培养领域，具体涉及ー种芍药高频胚性愈伤组织分化的培
养基及培养方法。
背景技术：
芍药是我国传统名花，与其他花卉相比，芍药的组织培养难度较大。前人的研究表明，以叶片、叶柄、茎段等为外植体均能诱导愈伤组织，井能分化出芽，但试验取材污染重、愈伤褐化多、芽分化率低，这些研究结果与芍药遗传转化再生体系的要求相差甚远。
中国专利申请《芍药离体组织培养方法》(公开号CN1675992)中公开了ー种培养基1/2MS培养基+V。50mg/L, pH为5. 6。该申请成功之处在于建立了茎尖试管无性繁殖的方法；但不足之处体现在不经过愈伤组织脱分化成苗的过程，未有芽生根的培养基配方，因此在生产和科研上均无应用价值。
王吉凤等的研究结果能诱导出愈伤，并分化出不定芽(王吉凤，李青，孟会.5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究[J].北京林业大学学报，2011，32(3):213-216.)，但仍存在愈伤褐化严重、玻璃化、易碎，芽分化率低，仅有7. 95%，不适宜转基因研究应用的不足。
黄凤兰等的研究结果能诱导出愈伤组织，不定芽诱导率较高，达到每块愈伤组织分化出1. 55个不定芽(黄凤兰，孟凡娟，牛红云，张继星，王莹.芍药遗传转化再生体系的建立[J].东北农业大学学报，2009，40 (6) : 50-57.)。但胚性愈伤分化率同其他植物相比，仍然较低，与转基因研究的要求距离较远。
因此，芍药愈伤组织胚性芽分化率低的技术难题有待解決。
发明内容
为了克服现有技术芍药愈伤组织胚性芽分化率低的不足，本发明提供了一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法，有效地解决了问题。
本发明所采用的技术方案是，一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养方法，包括以下步骤
(I)选材选生长健康、饱满、绿熟的种子；
(2)种胚消毒及分离将种子用75%酒精灭菌30 S，无菌水冲洗干净后0. 1%升汞灭菌8 min，无菌水冲洗干净后浸泡于水中，依次将种皮、胚乳剥离，获得待接的种胚；
(3)培养基配方及培养方法
①愈伤组织分化改良1/2MS基本培养基，添加NAA (0. 5-2. 0)mg/L +TDZ (0. 1-0. 5)mg/L，附加蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L，pH 为 5. 8 ;
培养条件温度25±2°C,暗培养两个月(图1)。
②胚性芽分化改良1/2MS基本培养基，添加TDZ(1. 0-5. 0) mg/L,附加蔗糖100g/L,琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ;[0015]培养条件温度25±2°C，光照强度12001x±1001x，光照时间12h/d(图2_3)。
本发明还公开了用于上述方法的培养基，包括芍药愈伤组织分化培养基芍药胚性芽分化培养基；所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0. 5-2. Omg/L，TDZ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ;所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L，蔗糖100 g/L，琼脂6 g/L，pH为5.8 ;其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO362. 5 mg/L, NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L, KH2PO4 137.5 mg/L、CaCl2 2H20 125mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。
本发明的有益效果体现在
(I)取材方便利用种子作外植体可周年取材，不受季节限制，且初代培养污染率低。
(2)出愈率高，褐化率低该方法在种胚接种I个月后开始脱分化形成愈伤组织，2个月愈伤诱导效率达100%，且其不易褐化、质地致密，符合转基因的要求。
(3)胚性芽的分化率高每个愈伤组织可再分化形成8-16个胚性芽，能够满足转基因研究应用。
图1是种胚形成愈伤组织的照片。
图2是愈伤分化 胚性芽的照片。
图3是胚性芽后期生长情况照片。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并參照数据进ー步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1 :
收集‘紫凤羽’自然成熟的种子，置于冰箱中备用。
(I)取材将供试种子用1% NaClO消毒10 min,自来水冲洗干净，在水中浸泡I天，然后用75%酒精灭菌30 S，0.1%升汞灭菌8 min，无菌水漂洗干净后，置于超净工作台上，依次将种皮、胚乳剥离，用解剖针挑出种胚。
(2)培养基配方
改良1/2MS配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62. 5 mg/L、NH4NO3125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137.5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。
①将种胚先接种于诱导胚性愈伤组织的以下3种培养基中[0033]I)、改良 1/2 MS + NAA 0. 5 mg/L + TDZ 0.1 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L,pH 为 5.8 ；
2)、改良 1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L,pH 为 5.8 ；
3)、改良 1/2 MS + NAA 2.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L,pH 为 5.8 ；
置于25で暗培养2个月，种胚脱分化后均能形成一団不易褐化、质地致密的胚性愈伤组织(图1)。
②将上述愈伤组织转入以下2种培养基中
I)、改良 1/2 MS + TDZ1. 0 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L, pH 为 5. 8，
2)、改良 1/2 MS + TDZ 5. 0 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L, pH 为 5. 8，
置于25 V，光强12001x，光照时间12h/d的条件下进行培养，每块愈伤组织再分化可形成8-16个胚性芽(图2、图3)。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求
范围的各种变型和等效变化。
权利要求
1.一种芍药高频胚性愈伤组织培养方法，包括以下步骤 (1)选材选生长健康、饱满、绿熟的种子； (2)种胚消毒及分离将种子用75%酒精灭菌30S，无菌水冲洗干净后0.1%升汞灭菌8 min，无菌水冲洗干净后浸泡于水中，依次将种皮、胚乳剥离，获得待接的种胚； (3)培养基配方及培养方法 ①愈伤组织分化在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0. 5-2. Omg/L +TDZ0. 1-0. 5mg/L，附加蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH为5. 8制得愈伤组织分化培养基；将种胚接入愈伤组织分化培养基，温度25±2°C，暗培养两个月； ②胚性芽分化在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L,附加蔗糖30g/L，琼月旨6 g/L, pH为5. 8制得胚性芽分化培养基；将经暗培养的组织继续在温度25±2°C，光照强度12001x±1001x，光照时间12h/d下培养； 其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62.5mg/L、NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137. 5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L,其它微量兀素、铁盐与有机成分含量不变。
2.用于权利要求
1所述方法的培养基，其特征在于包括芍药愈伤组织分化培养基和芍药胚性芽分化培养基； 所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA 0. 5-2. Omg/L，TDZ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ; 所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L,蔗糖 30 g/L,琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ; 其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62.5mg/L、NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137. 5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L,其它微量兀素、铁盐与有机成分含量不变。
专利摘要
本发明涉及一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法。所述培养方法，包括选材、种胚消毒及分离、培养基配制及愈伤组织分化和胚性芽分化的步骤。所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0.5-2.0mg/L，TDZ0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH为5.8；所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1.0-5.0mg/L，蔗糖100g/L，琼脂6g/L，pH为5.8。本发明具有取材方便，出愈率高、褐化率低，胚性芽分化率高的优点，能够满足转基因研究应用。
文档编号C12N5/00GKCN102440192 B发布类型授权 专利申请号CN 201110310634
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月14日
发明者陶俊, 赵大球, 薛银芳, 韩晨霞, 葛金涛 申请人:扬州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及植物的组织培养领域，具体涉及ー种芍药高频胚性愈伤组织分化的培
养基及培养方法。
背景技术：
芍药是我国传统名花，与其他花卉相比，芍药的组织培养难度较大。前人的研究表明，以叶片、叶柄、茎段等为外植体均能诱导愈伤组织，井能分化出芽，但试验取材污染重、愈伤褐化多、芽分化率低，这些研究结果与芍药遗传转化再生体系的要求相差甚远。
中国专利申请《芍药离体组织培养方法》(公开号CN1675992)中公开了ー种培养基1/2MS培养基+V。50mg/L, pH为5. 6。该申请成功之处在于建立了茎尖试管无性繁殖的方法；但不足之处体现在不经过愈伤组织脱分化成苗的过程，未有芽生根的培养基配方，因此在生产和科研上均无应用价值。
王吉凤等的研究结果能诱导出愈伤，并分化出不定芽(王吉凤，李青，孟会.5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究[J].北京林业大学学报，2011，32(3):213-216.)，但仍存在愈伤褐化严重、玻璃化、易碎，芽分化率低，仅有7. 95%，不适宜转基因研究应用的不足。
黄凤兰等的研究结果能诱导出愈伤组织，不定芽诱导率较高，达到每块愈伤组织分化出1. 55个不定芽(黄凤兰，孟凡娟，牛红云，张继星，王莹.芍药遗传转化再生体系的建立[J].东北农业大学学报，2009，40 (6) : 50-57.)。但胚性愈伤分化率同其他植物相比，仍然较低，与转基因研究的要求距离较远。
因此，芍药愈伤组织胚性芽分化率低的技术难题有待解決。
发明内容
为了克服现有技术芍药愈伤组织胚性芽分化率低的不足，本发明提供了一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法，有效地解决了问题。
本发明所采用的技术方案是，一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养方法，包括以下步骤
(I)选材选生长健康、饱满、绿熟的种子；
(2)种胚消毒及分离将种子用75%酒精灭菌30 S，无菌水冲洗干净后0. 1%升汞灭菌8 min，无菌水冲洗干净后浸泡于水中，依次将种皮、胚乳剥离，获得待接的种胚；
(3)培养基配方及培养方法
①愈伤组织分化改良1/2MS基本培养基，添加NAA (0. 5-2. 0)mg/L +TDZ (0. 1-0. 5)mg/L，附加蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L，pH 为 5. 8 ;
培养条件温度25±2°C,暗培养两个月(图1)。
②胚性芽分化改良1/2MS基本培养基，添加TDZ(1. 0-5. 0) mg/L,附加蔗糖100g/L,琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ;[0015]培养条件温度25±2°C，光照强度12001x±1001x，光照时间12h/d(图2_3)。
本发明还公开了用于上述方法的培养基，包括芍药愈伤组织分化培养基芍药胚性芽分化培养基；所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0. 5-2. Omg/L，TDZ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ;所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L，蔗糖100 g/L，琼脂6 g/L，pH为5.8 ;其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO362. 5 mg/L, NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L, KH2PO4 137.5 mg/L、CaCl2 2H20 125mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。
本发明的有益效果体现在
(I)取材方便利用种子作外植体可周年取材，不受季节限制，且初代培养污染率低。
(2)出愈率高，褐化率低该方法在种胚接种I个月后开始脱分化形成愈伤组织，2个月愈伤诱导效率达100%，且其不易褐化、质地致密，符合转基因的要求。
(3)胚性芽的分化率高每个愈伤组织可再分化形成8-16个胚性芽，能够满足转基因研究应用。
图1是种胚形成愈伤组织的照片。
图2是愈伤分化 胚性芽的照片。
图3是胚性芽后期生长情况照片。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并參照数据进ー步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1 :
收集‘紫凤羽’自然成熟的种子，置于冰箱中备用。
(I)取材将供试种子用1% NaClO消毒10 min,自来水冲洗干净，在水中浸泡I天，然后用75%酒精灭菌30 S，0.1%升汞灭菌8 min，无菌水漂洗干净后，置于超净工作台上，依次将种皮、胚乳剥离，用解剖针挑出种胚。
(2)培养基配方
改良1/2MS配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62. 5 mg/L、NH4NO3125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137.5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变。
①将种胚先接种于诱导胚性愈伤组织的以下3种培养基中[0033]I)、改良 1/2 MS + NAA 0. 5 mg/L + TDZ 0.1 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L,pH 为 5.8 ；
2)、改良 1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L,pH 为 5.8 ；
3)、改良 1/2 MS + NAA 2.0 mg/L + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6.0 g/L,pH 为 5.8 ；
置于25で暗培养2个月，种胚脱分化后均能形成一団不易褐化、质地致密的胚性愈伤组织(图1)。
②将上述愈伤组织转入以下2种培养基中
I)、改良 1/2 MS + TDZ1. 0 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L, pH 为 5. 8，
2)、改良 1/2 MS + TDZ 5. 0 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6. 0 g/L, pH 为 5. 8，
置于25 V，光强12001x，光照时间12h/d的条件下进行培养，每块愈伤组织再分化可形成8-16个胚性芽(图2、图3)。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求
范围的各种变型和等效变化。
权利要求
1.一种芍药高频胚性愈伤组织培养方法，包括以下步骤 (1)选材选生长健康、饱满、绿熟的种子； (2)种胚消毒及分离将种子用75%酒精灭菌30S，无菌水冲洗干净后0.1%升汞灭菌8 min，无菌水冲洗干净后浸泡于水中，依次将种皮、胚乳剥离，获得待接的种胚； (3)培养基配方及培养方法 ①愈伤组织分化在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0. 5-2. Omg/L +TDZ0. 1-0. 5mg/L，附加蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH为5. 8制得愈伤组织分化培养基；将种胚接入愈伤组织分化培养基，温度25±2°C，暗培养两个月； ②胚性芽分化在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L,附加蔗糖30g/L，琼月旨6 g/L, pH为5. 8制得胚性芽分化培养基；将经暗培养的组织继续在温度25±2°C，光照强度12001x±1001x，光照时间12h/d下培养； 其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62.5mg/L、NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137. 5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L,其它微量兀素、铁盐与有机成分含量不变。
2.用于权利要求
1所述方法的培养基，其特征在于包括芍药愈伤组织分化培养基和芍药胚性芽分化培养基； 所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA 0. 5-2. Omg/L，TDZ0. 1-0. 5mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ; 所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1. 0-5. Omg/L,蔗糖 30 g/L,琼脂 6 g/L, pH 为 5. 8 ; 其中改良1/2MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 62.5mg/L、NH4NO3 125 mg/L、MgSO4 7H20 62. 5 mg/L、KH2PO4 137. 5 mg/L、CaCl2 2H20 125 mg/L,其它微量兀素、铁盐与有机成分含量不变。
专利摘要
本发明涉及一种芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法。所述培养方法，包括选材、种胚消毒及分离、培养基配制及愈伤组织分化和胚性芽分化的步骤。所述芍药愈伤组织分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加NAA0.5-2.0mg/L，TDZ0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH为5.8；所述芍药胚性芽分化培养基，是在改良1/2MS基本培养基中添加TDZ1.0-5.0mg/L，蔗糖100g/L，琼脂6g/L，pH为5.8。本发明具有取材方便，出愈率高、褐化率低，胚性芽分化率高的优点，能够满足转基因研究应用。
文档编号C12N5/00GKCN102440192 B发布类型授权 专利申请号CN 201110310634
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月14日
发明者陶俊, 赵大球, 薛银芳, 韩晨霞, 葛金涛 申请人:扬州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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