一种用于水产品中致病菌的多重pcr快速检测方法
专利名称:一种用于水产品中致病菌的多重pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水产品中致病菌的检测，尤其涉及一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，属于微生物检测技术领域：
。
背景技术：
随着经济全球化进程的加快，食品安全也成为当今世界性公共卫生热点，而食源性致病菌是引起食源性疾病的首要因素，对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性致病菌是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌，如沙门氏菌是一种引起食物中毒的重要病原菌之一，在世界上每年造成的经济损失达上亿美元；如近年来受到社会广泛重视和关注的副溶血性弧菌也是引起食物中毒的食源性致病菌之一，尤其在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用含食源性致病菌的食品而引起暴发性食物中毒。而我国是一个水产品大国，水产品中含有大量的食源性致病菌，是引起食源性疾病的食品之一。由于海产品营养丰富、极易受到各种微生物的污染，据相关文献报道，水产品中含有的食源性致病菌种类比较多，常见的致病微生物菌有副溶血性弧菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌属、单核细胞增生李斯特氏菌等。这些食源性致病菌都能引起食源性疾病，其中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌这三种食源性致病菌所引起食源性疾病占很大的比例，因此，这三种食源性致病菌是世界上许多国家水产品进出口中必检的致病菌指标，同样也是我国对水产品的检测中必检的致病菌指标。
现有技术关于对食源致病菌的检验大多沿用传统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期较长，较易出现假阳性和假阴性，而且检测的灵敏度也较低。尤其是在应对突发公共卫生事件时，不能够满足诊断及时、结果准确、敏感性和特异性高的要求。鉴于此，为了能够更快速地实现对食品中的多种致病菌的诊断和监控，各国学者研究出了一些新的观点和方法，如酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)，聚合酶链反应(PCR)等。在上述的检测方法中，PCR技术可以说是20世纪核酸分子生物学领域的一项革命性创举和里程碑，该方法改变了传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增到IO7 IO9倍，大大提高了 DNA的得率；同时，随着热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化热循环仪的成功设计，PCR技术的操作程序大大简化，并很快成为分子生物学和基因工程中的一个强有利的工具。在国外，该技术已广泛地应用于微生物学、生态学、食品卫生学等领域。另外，从理论上讲，只要有限的核酸序列是清楚的，PCR检测技术的应用也必将成为今后我国食品中各种病原菌检测的一个重要方向。
近年来，针对单一致病菌的PCR快速检验方法已经建立起来，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等食源性致病菌的单一PCR快速检测方法。然而在食品生产和流通中， 企业和政府监管部门均需对大批食品进行食品中食源性的致病菌的检测，样本量大、时间急，采用单一致病菌的PCR检测技术和一般方法仍然不能满足这些部门不断发展的需要。 针对上述的问题，研究人员开发出了一种多种致病菌同时检测的多重PCR检测技术。在该项技术中，靶基因的选择和设计合理的引物以及在PCR扩增过程中反应体系中各物质的用量和条件的选择都是至关重要的。
如中国专利申请(公开号CN1603422A)公开了一种沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，具体方法是将沙门氏菌和大肠杆菌(YZU_DSL1)分别采用热裂法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌、产单核细胞李斯特菌采用酶解法DNA模板，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。该方法采用了多重PCR扩增技术进行检测，提高了工作效率，所采用的引物的特异性也较高，但是该方法只能同时检测出沙门氏菌和单核细胞李斯特菌，且在DNA模板的提取过程中不容易确保所提取的DNA模板的纯度等缺点。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种能够同时检测出水产品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三种致病菌的检测速度快、特异性高的多重PCR快速检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种用于水产品中致病菌的多重 PCR快速检测方法，该方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳检测；所述的多重 PCR扩增的反应体系中包括
DNA 模板0.02 0. 5 μ 1/μ 1 ;10XPCR buffer :0. 1 1·0μ 1/μ 1 ；dNTPs 180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4· Ommol/μ 1 ； Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙门氏菌引物 100 200ymol/L ；副溶血性菌引物:100 200ymol/L ；单核细胞增生性李斯特氏菌引物200 400 μ mol/L ；所述的沙门氏菌引物上游为5，-TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，，下游为:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游为:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游为:5，-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，；所述的单核细胞增生李斯特氏菌引物的上游为5'-TAA TTT AATTTT CCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游为5’ -CTT TCG TTA TAA TGTCTG GCT TTA TCG A-3，。
本发明的上述一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，所述的多重 PCR扩增还包括扩增反应条件，所述的扩增反应条件为95°C变性15min后进行循环程序， 所述的循环程序为94°C变性30秒，46°C 50°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，循环35次， 再在72°C下延伸补足10分钟。
本发明的上述一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法中多重PCR扩增的反应体系中所述的dNIPs是用于DNA半保留复制的主要原料，所述的dNIPs表示为dATP、 dTTP、dCTP、dGTP四种脱氧核苷酸的混合物，表示四种脱氧核苷酸的用量相同，均为180 220 μ mol/L，使用时四种脱氧核苷酸的浓度要相等，即等摩尔配制成dNIPs混合物，当任何一种脱氧核苷酸的浓度不同于其它几种时，不管是偏高或偏低，都会引起错酸，影响PCR扩增的质量。所述的Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有很大的影响，如果Mg2+的浓度过低， 则会使PCR扩增的特异性降低，而且还会影响Taq酶的活性，影响PCR扩增反应的产物，而在本发明的范围内能够保证PCR扩增的特异性和产量，能够保证最终的电泳检测的稳定性，使条带清晰。本发明的上述三对引物是针对沙门氏菌、副溶血性菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种菌中各自的毒力因子所设计的引物，沙门氏菌、副溶血性菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种菌的基因序列是本领域的公知常识，可以在基因库里得到这三种菌的基因序列。其中沙门氏菌的主要毒力因子是invA，是沙门氏菌的致病基因片段之一，invA 基因比较保守，能够作为靶基因，具有针对性强的优点，最终得到的扩增产物片段的长度为 213bPo但是对于以毒力因子invA为靶基因，本领域普通的PCR扩增中所用的引物是上游为5，-ATC GGC GTT ATC CCTTTC TCT GGT G-3，，下游为5，-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A-3’，且扩增产物的片段的长度为4%bp，采用该引物对应用到本发明的多重PCR 扩增中效果不佳，不利于本发明的实现。本发明针对副溶血性弧菌选用的目的基因irgB是副溶血性弧菌致病的主要毒力因子，也具有较好的保守性，对于副溶血性弧菌的PCR扩增， 常规的方法是采用toxR为靶基因，且所用的引物的上游为5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3，，下游为5'-ATACGA CTG CTT CGT CTC ATG-3，，扩增片段的长度为368bp。针对单核细胞增生李斯特氏菌选用PrfA为目的基因，具有较好的标记性，有利于本发明的电泳检测分析。本发明所用的沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌三种菌的引物序列和扩增产物及所用的目的基因可以通过表1看出
表1:
权利要求
1.一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，该方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增；对扩增产物进行电泳检测；所述的多重PCR扩增包括多重PCR扩增反应体系，所述的多重PCR 扩增反应体系包括DNA 模板0. 02 0. 5 μ 1/μ 1 ； 10 X PCR buffer :0. 1 1. 0 μ 1/μ 1 ；dNTPs :180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4. Ommol/μ 1 ；Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙门氏菌引物:100 200μπιΟ1/1;副溶血性菌引物100 200μπιΟ1/1;单核细胞增生性李斯特氏菌引物 200 400 μ mol/L ；所述的沙门氏菌引物上游为5，_TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，， 下游为:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游为:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游为5'-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，;所述的单核增生李斯特氏菌引物的上游为5，-TAA TTT MT TTTCCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游为5，_CTT TCG TTA TAA TGT CTGGCT TTA TCG A-3’。
2.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的多重PCR扩增还包括扩增反应条件，所述的扩增反应条件为95°C变性15min 后进行循环程序，所述的循环程序为94°C变性30秒，46°C 50°C退火lmin，72 V延伸 lmin，循环35次，再在72°C下延伸补足IOmin0
3.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法， 其特征在于所述的沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的活化、培养，通过以下方法实现的i、在无菌条件下，将脑心浸液培养基加入装有菌粉的西林瓶中，使充分悬浮后，得菌悬液，然后取菌悬液接种于营养肉汤琼脂培养基上，在35°C 40°C的条件下，活化培养20 26小时，得到一级菌种；ii、用接种针挑取一环上述活化后的单菌落的一级菌种至营养肉汤液体培养基中，放入摇床，控制温度在35°C 40°C的条件下，培养20 沈小时，得到相应细菌的菌液。
4.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的副溶血性弧菌的活化、培养，通过以下方法实现的a、在无菌条件下，将3%NaCl碱性蛋白水加入装有菌粉的西林瓶中，使充分悬浮后，得菌悬液，然后取菌悬液接种于营养肉汤琼脂培养基上，在35°C 40°C的条件下，活化培养 20 沈小时，得到一级菌种；b、用接种针挑取一环上述活化后的单菌落的一级菌种至营养肉汤液体培养基中，放入摇床，控制温度在35°C 40°C的条件下，培养20 沈小时，得相应细菌的菌液。
5.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括提取试剂盒，所述的提取试剂盒包括缓冲液GA ；缓冲液GB ；缓冲液GD ；漂洗液PW ；洗脱缓冲液TE ；蛋白酶K ；吸附柱CB3。
6.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括以下步骤A、取细菌培养液样品1.0 5. OmL，控制转速为IOOOOrpm的条件下，离心1 lOmin， 去上清液，得菌体沉淀物；B、向菌体沉淀物中加入缓冲液GA悬浮菌体沉淀物；C、再加入蛋白酶K溶液，使混合均勻，加入缓冲液GB，在70°C条件下保温5 15min，再加入无水乙醇，使混合均勻；D、再将步骤C所得的混合液加入到收集管中，加入吸附柱CB3,离心，去除废液，再加入缓冲液⑶，控制转速为12000rpm的条件下，离心15 30秒，去除废液，得到的吸附柱CB3 ；E、将步骤D中得到的吸附柱CB3放入到收集管中，再加入漂洗液PW，控制转速为 12000rpm的条件下，离心15 30秒，去除废液，得到的吸附柱CB3 ；F、将上述的吸附柱( 放入另一离心管中，再加入洗脱缓冲液TE，室温下放置1 IOmin,离心，得到DNA模板提取物。
7.根据权利要求
6所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于在提取单核细胞增生李斯特氏菌DNA模板时，步骤A之后首先将溶菌酶加入菌体沉淀物中进行破壁处理，再省略过步骤B的操作，直接依次进行步骤C及之后的操作过程最终得到单核增生李斯特氏菌DNA模板提取物。
8.根据权利要求
6所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于步骤C中所述的蛋白酶K溶液的加入量为18 22 μ 1 ；所述的缓冲液GB的加入量为 200 ~ 250 μ I0
9.根据权利要求
6或7或8所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板提取物的DNA纯度0拟60/0D280值为1. 6 1. 9。
10.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的扩增产物进行电泳检测包括用0. 5XTBE缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用紫外透射检测仪检测电泳结果。
专利摘要
本发明涉及一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，属于微生物检测技术领域：
。本发明的方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳检测；所述的多重PCR扩增的反应体系中包括DNA模板、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、沙门氏菌引物、副溶血性菌引物、单核细胞增生性李斯特氏菌引物。该方法具有能够同时检测出水产品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三种致病菌，且所需检测时间短，电流检测拖带少，特异性条带清晰及灵敏度高的优点。
文档编号C12Q1/04GKCN102329877SQ201110311334
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日
发明者夏慧丽 申请人:台州市质量技术监督检测研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及一种水产品中致病菌的检测，尤其涉及一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，属于微生物检测技术领域：
。
背景技术：
随着经济全球化进程的加快，食品安全也成为当今世界性公共卫生热点，而食源性致病菌是引起食源性疾病的首要因素，对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性致病菌是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌，如沙门氏菌是一种引起食物中毒的重要病原菌之一，在世界上每年造成的经济损失达上亿美元；如近年来受到社会广泛重视和关注的副溶血性弧菌也是引起食物中毒的食源性致病菌之一，尤其在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用含食源性致病菌的食品而引起暴发性食物中毒。而我国是一个水产品大国，水产品中含有大量的食源性致病菌，是引起食源性疾病的食品之一。由于海产品营养丰富、极易受到各种微生物的污染，据相关文献报道，水产品中含有的食源性致病菌种类比较多，常见的致病微生物菌有副溶血性弧菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌属、单核细胞增生李斯特氏菌等。这些食源性致病菌都能引起食源性疾病，其中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌这三种食源性致病菌所引起食源性疾病占很大的比例，因此，这三种食源性致病菌是世界上许多国家水产品进出口中必检的致病菌指标，同样也是我国对水产品的检测中必检的致病菌指标。
现有技术关于对食源致病菌的检验大多沿用传统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期较长，较易出现假阳性和假阴性，而且检测的灵敏度也较低。尤其是在应对突发公共卫生事件时，不能够满足诊断及时、结果准确、敏感性和特异性高的要求。鉴于此，为了能够更快速地实现对食品中的多种致病菌的诊断和监控，各国学者研究出了一些新的观点和方法，如酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)，聚合酶链反应(PCR)等。在上述的检测方法中，PCR技术可以说是20世纪核酸分子生物学领域的一项革命性创举和里程碑，该方法改变了传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增到IO7 IO9倍，大大提高了 DNA的得率；同时，随着热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化热循环仪的成功设计，PCR技术的操作程序大大简化，并很快成为分子生物学和基因工程中的一个强有利的工具。在国外，该技术已广泛地应用于微生物学、生态学、食品卫生学等领域。另外，从理论上讲，只要有限的核酸序列是清楚的，PCR检测技术的应用也必将成为今后我国食品中各种病原菌检测的一个重要方向。
近年来，针对单一致病菌的PCR快速检验方法已经建立起来，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等食源性致病菌的单一PCR快速检测方法。然而在食品生产和流通中， 企业和政府监管部门均需对大批食品进行食品中食源性的致病菌的检测，样本量大、时间急，采用单一致病菌的PCR检测技术和一般方法仍然不能满足这些部门不断发展的需要。 针对上述的问题，研究人员开发出了一种多种致病菌同时检测的多重PCR检测技术。在该项技术中，靶基因的选择和设计合理的引物以及在PCR扩增过程中反应体系中各物质的用量和条件的选择都是至关重要的。
如中国专利申请(公开号CN1603422A)公开了一种沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，具体方法是将沙门氏菌和大肠杆菌(YZU_DSL1)分别采用热裂法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌、产单核细胞李斯特菌采用酶解法DNA模板，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。该方法采用了多重PCR扩增技术进行检测，提高了工作效率，所采用的引物的特异性也较高，但是该方法只能同时检测出沙门氏菌和单核细胞李斯特菌，且在DNA模板的提取过程中不容易确保所提取的DNA模板的纯度等缺点。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种能够同时检测出水产品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三种致病菌的检测速度快、特异性高的多重PCR快速检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种用于水产品中致病菌的多重 PCR快速检测方法，该方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳检测；所述的多重 PCR扩增的反应体系中包括
DNA 模板0.02 0. 5 μ 1/μ 1 ;10XPCR buffer :0. 1 1·0μ 1/μ 1 ；dNTPs 180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4· Ommol/μ 1 ； Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙门氏菌引物 100 200ymol/L ；副溶血性菌引物:100 200ymol/L ；单核细胞增生性李斯特氏菌引物200 400 μ mol/L ；所述的沙门氏菌引物上游为5，-TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，，下游为:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游为:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游为:5，-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，；所述的单核细胞增生李斯特氏菌引物的上游为5'-TAA TTT AATTTT CCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游为5’ -CTT TCG TTA TAA TGTCTG GCT TTA TCG A-3，。
本发明的上述一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，所述的多重 PCR扩增还包括扩增反应条件，所述的扩增反应条件为95°C变性15min后进行循环程序， 所述的循环程序为94°C变性30秒，46°C 50°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，循环35次， 再在72°C下延伸补足10分钟。
本发明的上述一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法中多重PCR扩增的反应体系中所述的dNIPs是用于DNA半保留复制的主要原料，所述的dNIPs表示为dATP、 dTTP、dCTP、dGTP四种脱氧核苷酸的混合物，表示四种脱氧核苷酸的用量相同，均为180 220 μ mol/L，使用时四种脱氧核苷酸的浓度要相等，即等摩尔配制成dNIPs混合物，当任何一种脱氧核苷酸的浓度不同于其它几种时，不管是偏高或偏低，都会引起错酸，影响PCR扩增的质量。所述的Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有很大的影响，如果Mg2+的浓度过低， 则会使PCR扩增的特异性降低，而且还会影响Taq酶的活性，影响PCR扩增反应的产物，而在本发明的范围内能够保证PCR扩增的特异性和产量，能够保证最终的电泳检测的稳定性，使条带清晰。本发明的上述三对引物是针对沙门氏菌、副溶血性菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种菌中各自的毒力因子所设计的引物，沙门氏菌、副溶血性菌和单核细胞增生性李斯特氏菌三种菌的基因序列是本领域的公知常识，可以在基因库里得到这三种菌的基因序列。其中沙门氏菌的主要毒力因子是invA，是沙门氏菌的致病基因片段之一，invA 基因比较保守，能够作为靶基因，具有针对性强的优点，最终得到的扩增产物片段的长度为 213bPo但是对于以毒力因子invA为靶基因，本领域普通的PCR扩增中所用的引物是上游为5，-ATC GGC GTT ATC CCTTTC TCT GGT G-3，，下游为5，-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A-3’，且扩增产物的片段的长度为4%bp，采用该引物对应用到本发明的多重PCR 扩增中效果不佳，不利于本发明的实现。本发明针对副溶血性弧菌选用的目的基因irgB是副溶血性弧菌致病的主要毒力因子，也具有较好的保守性，对于副溶血性弧菌的PCR扩增， 常规的方法是采用toxR为靶基因，且所用的引物的上游为5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3，，下游为5'-ATACGA CTG CTT CGT CTC ATG-3，，扩增片段的长度为368bp。针对单核细胞增生李斯特氏菌选用PrfA为目的基因，具有较好的标记性，有利于本发明的电泳检测分析。本发明所用的沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌三种菌的引物序列和扩增产物及所用的目的基因可以通过表1看出
表1:
权利要求
1.一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，该方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增；对扩增产物进行电泳检测；所述的多重PCR扩增包括多重PCR扩增反应体系，所述的多重PCR 扩增反应体系包括DNA 模板0. 02 0. 5 μ 1/μ 1 ； 10 X PCR buffer :0. 1 1. 0 μ 1/μ 1 ；dNTPs :180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4. Ommol/μ 1 ；Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙门氏菌引物:100 200μπιΟ1/1;副溶血性菌引物100 200μπιΟ1/1;单核细胞增生性李斯特氏菌引物 200 400 μ mol/L ；所述的沙门氏菌引物上游为5，_TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，， 下游为:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游为:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游为5'-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，;所述的单核增生李斯特氏菌引物的上游为5，-TAA TTT MT TTTCCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游为5，_CTT TCG TTA TAA TGT CTGGCT TTA TCG A-3’。
2.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的多重PCR扩增还包括扩增反应条件，所述的扩增反应条件为95°C变性15min 后进行循环程序，所述的循环程序为94°C变性30秒，46°C 50°C退火lmin，72 V延伸 lmin，循环35次，再在72°C下延伸补足IOmin0
3.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法， 其特征在于所述的沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的活化、培养，通过以下方法实现的i、在无菌条件下，将脑心浸液培养基加入装有菌粉的西林瓶中，使充分悬浮后，得菌悬液，然后取菌悬液接种于营养肉汤琼脂培养基上，在35°C 40°C的条件下，活化培养20 26小时，得到一级菌种；ii、用接种针挑取一环上述活化后的单菌落的一级菌种至营养肉汤液体培养基中，放入摇床，控制温度在35°C 40°C的条件下，培养20 沈小时，得到相应细菌的菌液。
4.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的副溶血性弧菌的活化、培养，通过以下方法实现的a、在无菌条件下，将3%NaCl碱性蛋白水加入装有菌粉的西林瓶中，使充分悬浮后，得菌悬液，然后取菌悬液接种于营养肉汤琼脂培养基上，在35°C 40°C的条件下，活化培养 20 沈小时，得到一级菌种；b、用接种针挑取一环上述活化后的单菌落的一级菌种至营养肉汤液体培养基中，放入摇床，控制温度在35°C 40°C的条件下，培养20 沈小时，得相应细菌的菌液。
5.根据权利要求
1或2所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括提取试剂盒，所述的提取试剂盒包括缓冲液GA ；缓冲液GB ；缓冲液GD ；漂洗液PW ；洗脱缓冲液TE ；蛋白酶K ；吸附柱CB3。
6.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括以下步骤A、取细菌培养液样品1.0 5. OmL，控制转速为IOOOOrpm的条件下，离心1 lOmin， 去上清液，得菌体沉淀物；B、向菌体沉淀物中加入缓冲液GA悬浮菌体沉淀物；C、再加入蛋白酶K溶液，使混合均勻，加入缓冲液GB，在70°C条件下保温5 15min，再加入无水乙醇，使混合均勻；D、再将步骤C所得的混合液加入到收集管中，加入吸附柱CB3,离心，去除废液，再加入缓冲液⑶，控制转速为12000rpm的条件下，离心15 30秒，去除废液，得到的吸附柱CB3 ；E、将步骤D中得到的吸附柱CB3放入到收集管中，再加入漂洗液PW，控制转速为 12000rpm的条件下，离心15 30秒，去除废液，得到的吸附柱CB3 ；F、将上述的吸附柱( 放入另一离心管中，再加入洗脱缓冲液TE，室温下放置1 IOmin,离心，得到DNA模板提取物。
7.根据权利要求
6所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于在提取单核细胞增生李斯特氏菌DNA模板时，步骤A之后首先将溶菌酶加入菌体沉淀物中进行破壁处理，再省略过步骤B的操作，直接依次进行步骤C及之后的操作过程最终得到单核增生李斯特氏菌DNA模板提取物。
8.根据权利要求
6所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于步骤C中所述的蛋白酶K溶液的加入量为18 22 μ 1 ；所述的缓冲液GB的加入量为 200 ~ 250 μ I0
9.根据权利要求
6或7或8所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的DNA模板提取物的DNA纯度0拟60/0D280值为1. 6 1. 9。
10.根据权利要求
1所述的一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的扩增产物进行电泳检测包括用0. 5XTBE缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用紫外透射检测仪检测电泳结果。
专利摘要
本发明涉及一种用于水产品中致病菌的多重PCR快速检测方法，属于微生物检测技术领域：
。本发明的方法包括对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的活化、培养；DNA模板的提取；多重PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳检测；所述的多重PCR扩增的反应体系中包括DNA模板、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、沙门氏菌引物、副溶血性菌引物、单核细胞增生性李斯特氏菌引物。该方法具有能够同时检测出水产品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三种致病菌，且所需检测时间短，电流检测拖带少，特异性条带清晰及灵敏度高的优点。
文档编号C12Q1/04GKCN102329877SQ201110311334
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日
发明者夏慧丽 申请人:台州市质量技术监督检测研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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