一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法
专利名称:一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法
技术领域：
本发明涉及利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，属于发酵工程技术领域：
。
技术背景
胆固醇含量升高是引起高血脂的主要原因，而人体胆固醇主要来自自身的合成。 在胆固醇合成过程中，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶使HMG-CoA转变成甲基二羟戊酸，这是胆固醇生物合成中的限速步骤，在HMG-CoA还原酶抑制剂存在条件下，HMG-CoA 还原酶受到抑制，无法正常发挥作用，胆固醇的生成过程受到干扰，从而达到降低血脂的目的。他汀类药物属于HMG-CoA还原酶抑制剂，为降脂药物中的首选药物。
无锡他汀由洛伐他汀经拟无枝酸菌转化产生，是一种新型高效HMG-CoA还原酶抑制剂，抑制作用为洛伐他汀的4倍。中国发明专利公报2010年12月8日公开了一种提高无锡他汀产量的方法，专利申请号201010225950. 6，专利公开号101906446A，该方法利用游离拟无枝酸菌分段发酵，通过两阶段PH控制，提高无锡他汀的产量。其缺点是游离拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性较差，并且对发酵过程中的剪切力等条件较为敏感，这将大大影响分段发酵无锡他汀的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，通过固定化提高拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性以及对发酵条件的敏感度， 并进一步提高无锡他汀产量的发酵工艺。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为
将拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏编号为CGMCC NO. 1149，在专利号为 200410044893. 6的专利申请中进行了保藏)进行固定化处理，利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀，提高拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性，提高无锡他汀的产量，具有较好的操作稳定性，可重复利用。
所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与海藻酸钠溶液按照 2 10的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入CaCl2溶液中，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到固定化细胞。
所述两阶段发酵控制条件为发酵第一阶段，固定化细胞经过4 增殖培养后，按 1. 0-3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵pH为7. 5 ；发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净，加入新鲜转化培养基，按照0. 1-0. 3g/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH为5. 5。
所述拟无枝酸菌可用于多次发酵，用无菌去离子水将上一批发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批发酵，最适发酵批次为5批。
产物I的制备pH 7. 5的转化培养基中加入底物洛伐他汀发酵48h，中间产物I大量生成，离心浓缩，以大孔吸附树脂HP 20为柱填料，甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集 60% 70%甲醇梯度富集的中间产物I的洗脱液，浓缩后微孔膜过滤除菌备用。
洛伐他汀、产物I以及无锡他汀含量的检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测。
HPLC 条件色谱柱 Kromasi 1 C18 (5 μ m，250 X 4. 6mm)；流动相甲醇-0.5% 乙酸 (80 20)；流速 0. 8mL/min ；柱温:25°C ；进样量 20 μ L ；检测波长 237nm。
本发明提出利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，通过对拟无枝酸菌进行固定化处理，并进行多批次分段发酵，将拟无枝酸菌对洛伐他汀的耐受浓度从lg/L 提升到3g/L ；将发酵液中产物I的浓度从0. 55g/L提高到1. 92g/L ；使无锡他汀的产量从 0. 165g/L提高到0. 225g/L，固定化细胞具有较好的操作稳定性，可重复利用。
具体实施方式
实施例1
1、固定化细胞制备
将拟无枝酸菌斜面接到种子培养基，28°C静止培养48h。种子液通过两层擦镜纸过滤，将菌丝体过滤除掉，收集的滤液为孢子种子液。将获得的种子液与20g/L海藻酸钠溶液按照ImL菌悬液/5mL凝胶的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入10g/L的CaCl2溶液中， 注射高度为10cm，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到粒径为3mm左右的固定化细胞。
种子培养基组成为(g/L)=KNO3 1，无水 K2HPO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5， FeSO4 · 7H20 0. 01，可溶性淀粉 20，pH 7. 2-7. 4。
2、发酵生产无锡他汀
以4mL固定化细胞/IOmL转化培养基的接种量接入pH 7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min，30°C培养4 后，按1. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵PH为7. 5;发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净，加入新鲜转化培养基，按照0. lg/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH为 5 · 5 ο
转化培养基组成为(g/L)可溶性淀粉15，Hycase SF 2，玉米浆5。
产物I含量检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测样品， 将产物I峰的峰面积代入已有公式(利用标准曲线计算而得)
计算公式
产物I含量=峰面积*样品稀释倍数*10_6/30. 234 (g/L)
无锡他汀含量检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测样品，将无锡他汀峰的峰面积代入已有公式(利用标准曲线计算而得)
计算公式
无锡他汀含量=峰面积*样品稀释倍数*10_734606 (g/L)
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 76%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 9%。
实施例2
细胞固定化同实施例1。[0031]发酵生产无锡他汀的方法
将4mL固定化细胞接入IOmL的pH7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min， 30°C培养48h，按2. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵48h，生成产物I ；按0. 2g/L的浓度加入产物I溶液，30°C发酵10h。
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 210%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 25%。
实施例3
细胞固定化同实施例1。
发酵生产无锡他汀的方法
将4mL固定化细胞接入IOmL的pH 7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min， 30°C培养48h，按3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵48h，生成产物I ；按0. 3g/L的浓度加入产物I溶液，30°C发酵10h。
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 250%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 36%。
实施例4
用无菌去离子水将上一批次发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批次发酵。每批次发酵结束后，测定产物I和无锡他汀含量。经过固定化处理的拟无枝酸菌，连续发酵5批后，分段发酵的产物转化率仍然能维持较高的水平，固定化小珠伴有少量的破碎，至第6批发酵结束后，固定化细胞基本上溃散，产物转化率急剧下降， 具体数据见表1。
表1不同发酵批次产物I和无锡他汀含量以及固定化细胞机械强度变化
权利要求
1.一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，其特征在于将拟无枝酸菌细胞进行固定化处理后，采用PH以及发酵时间两阶段发酵控制生产无锡他汀。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与海藻酸钠溶液按照1 5的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入CaCl2溶液中，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到固定化细胞。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与20g/L海藻酸钠溶液按照ImL菌悬液/5mL凝胶的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入10g/L的CaCl2溶液中，注射高度为10cm，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净， 得到粒径为3mm左右的固定化细胞。
4.根据权利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述两阶段发酵控制条件为发酵第一阶段，固定化细胞经过增殖培养后，按1. 0-3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵pH为7. 5 ；发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净， 加入新鲜转化培养基，按照0. 1-0. 3g/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH*5.5。
5.根据权利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌可用于多次发酵， 用无菌去离子水将上一批发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批发酵。
6.根据权利要求
5所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌最适发酵批次为5批。
7.根据权利要求
1-3所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌为孢子种子液。
专利摘要
本发明公开了一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，属于发酵工程技术领域：
。本发明涉及拟无枝酸菌细胞的固定化处理以及固定化细胞多批次分段发酵，结果表明拟无枝酸菌经过固定化处理后，大幅度提高了对底物洛伐他汀的耐受性，提高了无锡他汀的产量，具有较好的操作稳定性，可重复利用。
文档编号C12P17/06GKCN102373249SQ201110316323
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月18日
发明者方慧英, 曹艳辉, 诸葛健, 诸葛斌 申请人:无锡天沁生物技术有限公司, 江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，属于发酵工程技术领域：
。
技术背景
胆固醇含量升高是引起高血脂的主要原因，而人体胆固醇主要来自自身的合成。 在胆固醇合成过程中，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶使HMG-CoA转变成甲基二羟戊酸，这是胆固醇生物合成中的限速步骤，在HMG-CoA还原酶抑制剂存在条件下，HMG-CoA 还原酶受到抑制，无法正常发挥作用，胆固醇的生成过程受到干扰，从而达到降低血脂的目的。他汀类药物属于HMG-CoA还原酶抑制剂，为降脂药物中的首选药物。
无锡他汀由洛伐他汀经拟无枝酸菌转化产生，是一种新型高效HMG-CoA还原酶抑制剂，抑制作用为洛伐他汀的4倍。中国发明专利公报2010年12月8日公开了一种提高无锡他汀产量的方法，专利申请号201010225950. 6，专利公开号101906446A，该方法利用游离拟无枝酸菌分段发酵，通过两阶段PH控制，提高无锡他汀的产量。其缺点是游离拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性较差，并且对发酵过程中的剪切力等条件较为敏感，这将大大影响分段发酵无锡他汀的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，通过固定化提高拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性以及对发酵条件的敏感度， 并进一步提高无锡他汀产量的发酵工艺。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为
将拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏编号为CGMCC NO. 1149，在专利号为 200410044893. 6的专利申请中进行了保藏)进行固定化处理，利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀，提高拟无枝酸菌对底物洛伐他汀的耐受性，提高无锡他汀的产量，具有较好的操作稳定性，可重复利用。
所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与海藻酸钠溶液按照 2 10的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入CaCl2溶液中，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到固定化细胞。
所述两阶段发酵控制条件为发酵第一阶段，固定化细胞经过4 增殖培养后，按 1. 0-3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵pH为7. 5 ；发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净，加入新鲜转化培养基，按照0. 1-0. 3g/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH为5. 5。
所述拟无枝酸菌可用于多次发酵，用无菌去离子水将上一批发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批发酵，最适发酵批次为5批。
产物I的制备pH 7. 5的转化培养基中加入底物洛伐他汀发酵48h，中间产物I大量生成，离心浓缩，以大孔吸附树脂HP 20为柱填料，甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集 60% 70%甲醇梯度富集的中间产物I的洗脱液，浓缩后微孔膜过滤除菌备用。
洛伐他汀、产物I以及无锡他汀含量的检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测。
HPLC 条件色谱柱 Kromasi 1 C18 (5 μ m，250 X 4. 6mm)；流动相甲醇-0.5% 乙酸 (80 20)；流速 0. 8mL/min ；柱温:25°C ；进样量 20 μ L ；检测波长 237nm。
本发明提出利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，通过对拟无枝酸菌进行固定化处理，并进行多批次分段发酵，将拟无枝酸菌对洛伐他汀的耐受浓度从lg/L 提升到3g/L ；将发酵液中产物I的浓度从0. 55g/L提高到1. 92g/L ；使无锡他汀的产量从 0. 165g/L提高到0. 225g/L，固定化细胞具有较好的操作稳定性，可重复利用。
具体实施方式
实施例1
1、固定化细胞制备
将拟无枝酸菌斜面接到种子培养基，28°C静止培养48h。种子液通过两层擦镜纸过滤，将菌丝体过滤除掉，收集的滤液为孢子种子液。将获得的种子液与20g/L海藻酸钠溶液按照ImL菌悬液/5mL凝胶的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入10g/L的CaCl2溶液中， 注射高度为10cm，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到粒径为3mm左右的固定化细胞。
种子培养基组成为(g/L)=KNO3 1，无水 K2HPO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5， FeSO4 · 7H20 0. 01，可溶性淀粉 20，pH 7. 2-7. 4。
2、发酵生产无锡他汀
以4mL固定化细胞/IOmL转化培养基的接种量接入pH 7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min，30°C培养4 后，按1. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵PH为7. 5;发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净，加入新鲜转化培养基，按照0. lg/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH为 5 · 5 ο
转化培养基组成为(g/L)可溶性淀粉15，Hycase SF 2，玉米浆5。
产物I含量检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测样品， 将产物I峰的峰面积代入已有公式(利用标准曲线计算而得)
计算公式
产物I含量=峰面积*样品稀释倍数*10_6/30. 234 (g/L)
无锡他汀含量检测方法将发酵结束的发酵液离心，微膜过滤后利用HPLC检测样品，将无锡他汀峰的峰面积代入已有公式(利用标准曲线计算而得)
计算公式
无锡他汀含量=峰面积*样品稀释倍数*10_734606 (g/L)
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 76%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 9%。
实施例2
细胞固定化同实施例1。[0031]发酵生产无锡他汀的方法
将4mL固定化细胞接入IOmL的pH7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min， 30°C培养48h，按2. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵48h，生成产物I ；按0. 2g/L的浓度加入产物I溶液，30°C发酵10h。
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 210%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 25%。
实施例3
细胞固定化同实施例1。
发酵生产无锡他汀的方法
将4mL固定化细胞接入IOmL的pH 7. 5的转化培养基中，回转式摇床llOr/min， 30°C培养48h，按3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵48h，生成产物I ；按0. 3g/L的浓度加入产物I溶液，30°C发酵10h。
发酵结束后，测定产物I含量，其产量比对比技术方法提高了 250%。
发酵结束后，测定无锡他汀含量，其产量比对比技术方法提高了 36%。
实施例4
用无菌去离子水将上一批次发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批次发酵。每批次发酵结束后，测定产物I和无锡他汀含量。经过固定化处理的拟无枝酸菌，连续发酵5批后，分段发酵的产物转化率仍然能维持较高的水平，固定化小珠伴有少量的破碎，至第6批发酵结束后，固定化细胞基本上溃散，产物转化率急剧下降， 具体数据见表1。
表1不同发酵批次产物I和无锡他汀含量以及固定化细胞机械强度变化
权利要求
1.一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，其特征在于将拟无枝酸菌细胞进行固定化处理后，采用PH以及发酵时间两阶段发酵控制生产无锡他汀。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与海藻酸钠溶液按照1 5的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入CaCl2溶液中，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净，得到固定化细胞。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌固定化方法为将培养好的种子菌悬液与20g/L海藻酸钠溶液按照ImL菌悬液/5mL凝胶的比例充分混勻，然后用注射器将其滴入10g/L的CaCl2溶液中，注射高度为10cm，固定lh，滤出小珠，用蒸馏水洗净， 得到粒径为3mm左右的固定化细胞。
4.根据权利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述两阶段发酵控制条件为发酵第一阶段，固定化细胞经过增殖培养后，按1. 0-3. Og/L的浓度加入洛伐他汀溶液，30°C发酵4 生成产物I，发酵pH为7. 5 ；发酵第二阶段，将第一阶段发酵结束的固定化细胞洗净， 加入新鲜转化培养基，按照0. 1-0. 3g/L的的浓度加入产物I溶液，30°C发酵IOh生成无锡他汀，发酵pH*5.5。
5.根据权利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌可用于多次发酵， 用无菌去离子水将上一批发酵结束的固定化细胞冲洗三次，加入新鲜转化培养基，进行下一批发酵。
6.根据权利要求
5所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌最适发酵批次为5批。
7.根据权利要求
1-3所述的方法，其特征在于所述拟无枝酸菌为孢子种子液。
专利摘要
本发明公开了一种利用固定化拟无枝酸菌分段发酵无锡他汀的方法，属于发酵工程技术领域：
。本发明涉及拟无枝酸菌细胞的固定化处理以及固定化细胞多批次分段发酵，结果表明拟无枝酸菌经过固定化处理后，大幅度提高了对底物洛伐他汀的耐受性，提高了无锡他汀的产量，具有较好的操作稳定性，可重复利用。
文档编号C12P17/06GKCN102373249SQ201110316323
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月18日
发明者方慧英, 曹艳辉, 诸葛健, 诸葛斌 申请人:无锡天沁生物技术有限公司, 江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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