一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法
专利名称:一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种植酸酶活性的测定方法，尤其涉及一种快速、高通量的检测转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中的植酸酶活性方法，属于转基因作物种子植酸酶活性的测定领域。
背景技术：
自1996至2010年，全球转基因作物的种植面积在十五年间增长了 87倍，截止 2010年达到1.48亿公顷，且每年都以10%以上的速度增长。迄今为止，共有59个国家批准种植或进口生物技术作物用于食物和饲料，其中包括四个国家批准了生物技术作物的本地化种植，全世界75%的人口居住在这59个国家。
截至目前所发展的转基因植物中，转基因玉米、大豆、棉花、油菜籽和马铃薯等都与饲料有关，用于动物的日粮中，其中占转基因植物总种植面积80%以上的玉米和大豆在饲料中广泛应用。世界上每年约有4000万吨转基因玉米用于饲喂动物。大豆和豆粕是饲料中的主要蛋白原料，因此用作饲料的转基因大豆也有约7400多万吨。加上棉籽粕和油菜籽粕，每年用于饲料的转基因植物约为1. 2亿吨以上。并且由于转基因技术的快速发展，目前已有60 70%的饲料原料与转基因植物相关，例如抗虫的转基因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于转基因作物发展迅猛，因此对转基因植物及其产品的检测方法也成为当今关注的技术。
玉米为中国的第一大粮食作物。2011年，中国玉米播种面积已达到4. 8亿亩，位居世界第二。中国玉米总需求量的近80%作为饲料，且这个比例还在不断增加。转基因植酸酶玉米于2009年8月获中国农业部颁发的《农业转基因生物安全证书》，获准进行生产应用，它是中国第一例批准生产应用的转基因玉米。转基因植酸酶玉米是以玉米种子作为生物反应器来生产植酸酶，通过生物技术和传统育种方法相结合，将具有自主知识产权的植酸酶基因转化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并稳定遗传的转基因玉米。植酸酶在动物的胃中释放出来而降解饲料中的植酸磷，从而解决了饲料中植酸磷不能被动物吸收利用和导致环境污染等诸多问题。正是由于植酸酶所具有的安全、环保、高效、经济等特点以及很好的社会生态环境效益，因此，在欧洲大部分国家已强制在饲料中使用植酸酶，目前中国市场上的单胃动物饲料中已经有90%添加了植酸酶，植酸酶的推广应用可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。在转基因植酸酶玉米诞生之前，在饲料中广泛使用的植酸酶是通过微生物发酵生产的，而转基因植酸酶玉米使用将更为经济、方便、 有效。按照目前的饲料工业发展现状，预计转植酸酶基因玉米的市场需求量为每年5000万吨(1000单位植酸酶/公斤玉米种子)，应用后可替代饲料中所添加的磷酸氢钙80万吨，减少动物粪便中磷的排除量100万吨并降低饲料成本20亿元。
目前，国际上最常用的酶活性单位定义是在植酸钠浓度为5. Ommol/L、温度37°C、PH值5. 50的条件，每分钟从植酸钠中释放1 μ mol无机磷即为一个植酸酶活性单位，国家标准GB/T 18634-2009也采用同样的定义。植酸酶的活力测定原理是通过一些化学试剂与无机磷产生颜色反应，从而确定无机磷的释放量。现有的测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法有钼-钒酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、Vc-钼蓝法和丙酮-磷钼酸铵法。有研究发现，从灵敏度来说钼-钒酸铵法最好，硫酸亚铁-钼蓝法和Vc-钼蓝法次之，丙酮-磷钼酸铵法最低(黄遵锡，章克昌，徐柔.植酸酶活性测定不同方法的比较研究.饲料工业， 1999,20(12) :20-22.)。但是，丙酮-磷钼酸铵法的稳定性及抗干扰能力是最好的，常被用于测定饲料、发酵产物中的植酸酶活性(陈琛.植酸酶活性测定方法的研究进展.中国饲料，2010，2016-18.)。
公开号为CN 101914508A(发明名称一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法)的中国发明专利公开了一种高通量的测定植酸酶活性的方法，该方法在钼-钒酸铵法测定植酸酶活性的基础上建立微板法测定植酸酶活性的方法，虽然该方法一次能检测较多数量的样品，具有高通量检测的优点，但是该检测方法存在误差较大、稳定性低，变异系数高等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的检测转植酸酶作物植酸酶活性的方法所存在的缺陷，提供一种高通量测定转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶活性的方法，该方法具有检测效率高，误差小，稳定性高，变异系数较小，重复性好等优点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶酶活性或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶酶活性的方法，包括以下步骤
(1)、以磷含量为横坐标，OD415吸光值为纵坐标，建立标准曲线；
(2)、将待检测样品(转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料)中的植酸酶浸提出来，得到转植酸酶作物种子的植酸酶浸提液或添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液；
(3)、将所提取得到的植酸酶浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应；
0)、酶活性测定反应结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线建立的直线回归方程，计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出待检测样品中的植酸酶活性
权利要求
1.一种高通量测定转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)以磷含量为横坐标，OD415吸光值为纵坐标，建立磷标准曲线； (2)将待检测的转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料样品中的植酸酶浸提出来，得到植酸酶浸提液；(3)将植酸酶浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应； (4)酶活性测定反应结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线建立的直线回归方程，计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出待检测样品中的植酸酶活性
2.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的转植酸酶作物种子为转植酸酶玉米、转植酸酶大豆、转植酸酶棉花种子、转植酸酶油菜籽或转植酸酶马铃薯。
3.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中按照以下方法建立标准曲线(a)、制备磷标准溶液；(b)、将磷标准溶液梯度稀释；(C)、将梯度稀释液各取40 μ 1，先加入250 mmol/L的pH值为5. 5的40 μ 1乙酸缓冲液，37° C预热，再加入显色液80 μ 1，37° C保温，最后加入15 mmol/L的40 μ 1植酸钠溶液， 室温静置后，波长415nm处测定样品吸光值，绘制磷标准曲线。
4.按照权利要求
3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的梯度稀释是将标准溶液分别稀释成 1.5625 mmol/L,2. 5000 mmol/L,3. 1250 mmol/L、5.0000 mmol/L、6.2500 mmol/L的溶液。
5.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中按照以下步骤浸提得到植酸酶浸提液(a)将样品研磨后过筛，混勻备用；优选的，所述的过筛是过0.45mm的标准筛； (b)样品浸提向过筛后的样品中加入植酸酶提取缓冲液，震荡、离心，取上清；将上清再次离心，弃沉淀，取上清液，得到转植酸酶作物种子的植酸酶浸提液或添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液。
6.按照权利要求
5所述的方法，其特征在于将所得到的添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液稀释后加入到超滤离心管中离心，弃去下层液体，直到剩余的体积与稀释前的添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液的体积相等为止。
7.按照权利要求
6所述的方法，其特征在于所述的稀释用PH值为5.5的乙酸缓冲液进行稀释，其中，所加入的乙酸缓冲液与饲料样品浸提液的体积比为10 1 ；所述的超滤离心管为截留量为3000道尔顿的超滤离心管。
8.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述酶活性测定反应包括以下步骤取40 μ 1待检测的植酸酶浸提液，加入40 μ 1 ρΗ值为5. 5的250 mmol/L乙酸缓冲液， 37°C预热后再加入40μ 1的15 mmol/L植酸钠溶液，37°C保温，最后加入显色液80 μ 1，室温静置；其中，从加入植酸钠底物开始，控制每个反应时间为30min。
9.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤(4)中酶活性测定反应完毕后，反应液如果出现浑浊，将反应液以4000r/min离心lOmin，吸出上清液再测定吸光值读数；反应液如果没有浑浊，直接将整块96孔微孔板放入微孔板连续波长生物测读仪内测定吸光值读数。
10.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的测定吸光值读数是在415nm处测定吸光值读数。
专利摘要
本发明公开了一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法，该方法包括(1)以磷含量为横坐标，吸光值为纵坐标，建立磷标准曲线；(2)将待检测样品中的植酸酶浸提出来，得到植酸酶的浸提液；(3)将植酸酶的浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应；(4)测定反应溶液的吸光值，对应磷标准曲线建立的直线回归方程计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据酶活计算公式计算出待检测样品的植酸酶活性。准确度和灵敏度试验结果表明，本发明方法测定结果准确性好、误差小、稳定性高、重复性好，变异系数也远低于现有的微板法。本发明检测方法具有高通量、检测效率高、操作简便、成本低、准确性高等优点。
文档编号C12Q1/44GKCN102352406SQ201110326940
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月25日
发明者伍宁丰, 初晓宇, 姚斌, 杨文竹, 范云六, 陈茹梅 申请人:中国农业科学院生物技术研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及一种植酸酶活性的测定方法，尤其涉及一种快速、高通量的检测转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中的植酸酶活性方法，属于转基因作物种子植酸酶活性的测定领域。
背景技术：
自1996至2010年，全球转基因作物的种植面积在十五年间增长了 87倍，截止 2010年达到1.48亿公顷，且每年都以10%以上的速度增长。迄今为止，共有59个国家批准种植或进口生物技术作物用于食物和饲料，其中包括四个国家批准了生物技术作物的本地化种植，全世界75%的人口居住在这59个国家。
截至目前所发展的转基因植物中，转基因玉米、大豆、棉花、油菜籽和马铃薯等都与饲料有关，用于动物的日粮中，其中占转基因植物总种植面积80%以上的玉米和大豆在饲料中广泛应用。世界上每年约有4000万吨转基因玉米用于饲喂动物。大豆和豆粕是饲料中的主要蛋白原料，因此用作饲料的转基因大豆也有约7400多万吨。加上棉籽粕和油菜籽粕，每年用于饲料的转基因植物约为1. 2亿吨以上。并且由于转基因技术的快速发展，目前已有60 70%的饲料原料与转基因植物相关，例如抗虫的转基因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于转基因作物发展迅猛，因此对转基因植物及其产品的检测方法也成为当今关注的技术。
玉米为中国的第一大粮食作物。2011年，中国玉米播种面积已达到4. 8亿亩，位居世界第二。中国玉米总需求量的近80%作为饲料，且这个比例还在不断增加。转基因植酸酶玉米于2009年8月获中国农业部颁发的《农业转基因生物安全证书》，获准进行生产应用，它是中国第一例批准生产应用的转基因玉米。转基因植酸酶玉米是以玉米种子作为生物反应器来生产植酸酶，通过生物技术和传统育种方法相结合，将具有自主知识产权的植酸酶基因转化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并稳定遗传的转基因玉米。植酸酶在动物的胃中释放出来而降解饲料中的植酸磷，从而解决了饲料中植酸磷不能被动物吸收利用和导致环境污染等诸多问题。正是由于植酸酶所具有的安全、环保、高效、经济等特点以及很好的社会生态环境效益，因此，在欧洲大部分国家已强制在饲料中使用植酸酶，目前中国市场上的单胃动物饲料中已经有90%添加了植酸酶，植酸酶的推广应用可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。在转基因植酸酶玉米诞生之前，在饲料中广泛使用的植酸酶是通过微生物发酵生产的，而转基因植酸酶玉米使用将更为经济、方便、 有效。按照目前的饲料工业发展现状，预计转植酸酶基因玉米的市场需求量为每年5000万吨(1000单位植酸酶/公斤玉米种子)，应用后可替代饲料中所添加的磷酸氢钙80万吨，减少动物粪便中磷的排除量100万吨并降低饲料成本20亿元。
目前，国际上最常用的酶活性单位定义是在植酸钠浓度为5. Ommol/L、温度37°C、PH值5. 50的条件，每分钟从植酸钠中释放1 μ mol无机磷即为一个植酸酶活性单位，国家标准GB/T 18634-2009也采用同样的定义。植酸酶的活力测定原理是通过一些化学试剂与无机磷产生颜色反应，从而确定无机磷的释放量。现有的测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法有钼-钒酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、Vc-钼蓝法和丙酮-磷钼酸铵法。有研究发现，从灵敏度来说钼-钒酸铵法最好，硫酸亚铁-钼蓝法和Vc-钼蓝法次之，丙酮-磷钼酸铵法最低(黄遵锡，章克昌，徐柔.植酸酶活性测定不同方法的比较研究.饲料工业， 1999,20(12) :20-22.)。但是，丙酮-磷钼酸铵法的稳定性及抗干扰能力是最好的，常被用于测定饲料、发酵产物中的植酸酶活性(陈琛.植酸酶活性测定方法的研究进展.中国饲料，2010，2016-18.)。
公开号为CN 101914508A(发明名称一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法)的中国发明专利公开了一种高通量的测定植酸酶活性的方法，该方法在钼-钒酸铵法测定植酸酶活性的基础上建立微板法测定植酸酶活性的方法，虽然该方法一次能检测较多数量的样品，具有高通量检测的优点，但是该检测方法存在误差较大、稳定性低，变异系数高等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的检测转植酸酶作物植酸酶活性的方法所存在的缺陷，提供一种高通量测定转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶活性的方法，该方法具有检测效率高，误差小，稳定性高，变异系数较小，重复性好等优点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶酶活性或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶酶活性的方法，包括以下步骤
(1)、以磷含量为横坐标，OD415吸光值为纵坐标，建立标准曲线；
(2)、将待检测样品(转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料)中的植酸酶浸提出来，得到转植酸酶作物种子的植酸酶浸提液或添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液；
(3)、将所提取得到的植酸酶浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应；
0)、酶活性测定反应结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线建立的直线回归方程，计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出待检测样品中的植酸酶活性
权利要求
1.一种高通量测定转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)以磷含量为横坐标，OD415吸光值为纵坐标，建立磷标准曲线； (2)将待检测的转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料样品中的植酸酶浸提出来，得到植酸酶浸提液；(3)将植酸酶浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应； (4)酶活性测定反应结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线建立的直线回归方程，计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出待检测样品中的植酸酶活性
2.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的转植酸酶作物种子为转植酸酶玉米、转植酸酶大豆、转植酸酶棉花种子、转植酸酶油菜籽或转植酸酶马铃薯。
3.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中按照以下方法建立标准曲线(a)、制备磷标准溶液；(b)、将磷标准溶液梯度稀释；(C)、将梯度稀释液各取40 μ 1，先加入250 mmol/L的pH值为5. 5的40 μ 1乙酸缓冲液，37° C预热，再加入显色液80 μ 1，37° C保温，最后加入15 mmol/L的40 μ 1植酸钠溶液， 室温静置后，波长415nm处测定样品吸光值，绘制磷标准曲线。
4.按照权利要求
3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的梯度稀释是将标准溶液分别稀释成 1.5625 mmol/L,2. 5000 mmol/L,3. 1250 mmol/L、5.0000 mmol/L、6.2500 mmol/L的溶液。
5.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中按照以下步骤浸提得到植酸酶浸提液(a)将样品研磨后过筛，混勻备用；优选的，所述的过筛是过0.45mm的标准筛； (b)样品浸提向过筛后的样品中加入植酸酶提取缓冲液，震荡、离心，取上清；将上清再次离心，弃沉淀，取上清液，得到转植酸酶作物种子的植酸酶浸提液或添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液。
6.按照权利要求
5所述的方法，其特征在于将所得到的添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液稀释后加入到超滤离心管中离心，弃去下层液体，直到剩余的体积与稀释前的添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液的体积相等为止。
7.按照权利要求
6所述的方法，其特征在于所述的稀释用PH值为5.5的乙酸缓冲液进行稀释，其中，所加入的乙酸缓冲液与饲料样品浸提液的体积比为10 1 ；所述的超滤离心管为截留量为3000道尔顿的超滤离心管。
8.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述酶活性测定反应包括以下步骤取40 μ 1待检测的植酸酶浸提液，加入40 μ 1 ρΗ值为5. 5的250 mmol/L乙酸缓冲液， 37°C预热后再加入40μ 1的15 mmol/L植酸钠溶液，37°C保温，最后加入显色液80 μ 1，室温静置；其中，从加入植酸钠底物开始，控制每个反应时间为30min。
9.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于步骤(4)中酶活性测定反应完毕后，反应液如果出现浑浊，将反应液以4000r/min离心lOmin，吸出上清液再测定吸光值读数；反应液如果没有浑浊，直接将整块96孔微孔板放入微孔板连续波长生物测读仪内测定吸光值读数。
10.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的测定吸光值读数是在415nm处测定吸光值读数。
专利摘要
本发明公开了一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法，该方法包括(1)以磷含量为横坐标，吸光值为纵坐标，建立磷标准曲线；(2)将待检测样品中的植酸酶浸提出来，得到植酸酶的浸提液；(3)将植酸酶的浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应；(4)测定反应溶液的吸光值，对应磷标准曲线建立的直线回归方程计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据酶活计算公式计算出待检测样品的植酸酶活性。准确度和灵敏度试验结果表明，本发明方法测定结果准确性好、误差小、稳定性高、重复性好，变异系数也远低于现有的微板法。本发明检测方法具有高通量、检测效率高、操作简便、成本低、准确性高等优点。
文档编号C12Q1/44GKCN102352406SQ201110326940
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月25日
发明者伍宁丰, 初晓宇, 姚斌, 杨文竹, 范云六, 陈茹梅 申请人:中国农业科学院生物技术研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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