一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法
专利名称:一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法
技术领域：
本发明属于发酵工程领域，尤其是一种聚-L-赖氨酸的生产方法。
背景技术：
ε -聚-L-赖氨酸(ε -PL)是一种微生物源胞外线性多聚物，仅由25_35个L-1ysine残基通过α -羧基和ε-氨基连接而成。1977年，Shima和Sakai首次在Streptomyces albulus NBRC 14147菌株的发酵清液中发现这种氨基酸多聚物。ε -聚-L-赖氨酸是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌甚至某些病毒，抑·菌谱广泛。自从通过小鼠实验证明ε-PL安全性后，日本、韩国、美国等国家将其作为天然食品防腐剂并广泛应用。ε -PL及其衍生物应用范围较广，除可用于食品防腐外，还可以作为抗肥胖剂、药物和基因载体、持水性材料，以及生物芯片和生物电子学中的镀膜材料等。
据检索，发现以下关于ε -聚-L-赖氨酸的专利文献，其中CN1260004公开了一种大量生产ε -聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，该方法通过好气培养菌株Β21021 (FERMΒΡ-5926)并分离纯化所得ε -聚-L-赖氨酸。菌株Β21021是通过对小白链霉菌Iysinopolymerus亚种11011Α-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理而获得的,其对浓度为10mg/mL或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性。CN101285046公开了一种诱变菌株TUST2及利用该诱变菌株生产ε -聚赖氨酸及其盐的方法，是以在中国海南省土壤中分离得到的TUSTl为出发菌株，利用物理和化学诱变方法选育出的菌株TUST2 (CGMCCN0.1986),该菌株对10mg/mL或更高浓度AEC及2mg/mL甘氨酸具有抗性,优化条件下产酸量可达10 30g/L。然后发酵液经离心、过滤和弱酸性阳离子交换树脂等处理后得到分子量分布为4000 6500Da的ε -聚赖氨酸产品。CN101525640公开了一种ε -聚赖氨酸的制备方法，该方法是利用弗吉尼亚链霉菌Υ12，通过一级、二级种子扩大培养，发酵生产ε -聚赖氨酸，提取后得率可达8g/L以上。菌株Y12是出发菌株通过硫酸二乙酯、紫外等诱变方法获得的。CN102086441A公开了一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε -聚赖氨酸及其盐的方法，该方法利用灰褐色链霉菌LS-Hl发酵生产ε -聚赖氨酸，在优化条件下积累量为0.7 20g/L，然后发酵液经离心、离子交换得到ε-聚赖氨酸及其盐。CN101671703公开了一种提高ε -聚-L-赖氨酸产量的新方法,是以Streptomyces diastatochromogenes或Streptomyces albulus为生产菌株,在发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的过程中,产物开始积累以后，向培养基中流加L-赖氨酸以提高产量，然后将发酵液离心、离子交换吸附、脱色、真空干燥后得到ε -聚-L-赖氨酸盐酸盐。
上述专利文件主要集中在ε _聚-L-赖氨酸的生产菌种和发酵工艺上，但都没有研究甘氨酸对其发酵性能的影响，与本专利存在本质区别。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚-L-赖氨酸的生产方法，本发明通过增加外源培养基成分生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，在培养基中含有I 10g/L的甘氨酸，使ε-聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了 20 50%。
本发明实现目的的技术方案是:
—种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，培养基中含有甘氨酸。
而且，所述甘氨酸的浓度为I 10g/L。
而且，所述甘氨酸在培养前期或中期加入。
本发明的优点和积极效果是:
1、本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，甘氨酸可进入叶酸代谢途径，为生物合成过程提供充足的一碳基团，提高菌株合成代谢活力，增加前体L-赖氨酸及ε -聚-L-赖氨酸的合成，使ε -聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了 20 50%。
2、本发明改变了原有的发酵工艺，显著增加了生产菌株代谢活力，提高了ε_聚-L-赖氨酸的产率，从一定程度上增加了其积累量，降低了成本，可用于工业规模的发酵生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
首先需要说明的是:
1.以下实施例所用的白色链霉菌(Streptomyces albulus)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.1986，保藏日期为2007年3月23日。
2.以下实施例所用的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.3145，保藏日期为2009年6月29日。
本发明以上述两菌种为例来说明本发明，但是所用菌种的范围不仅仅限于上述两种，如本发明背景技术中提及的菌种均可以应用于本发明中，由于原理相同，具体操作步骤易于技术人员合理获知，本发明不再举例。
3.在发酵过程中流加L-赖氨酸是采用《一种提高ε -聚-L-赖氨酸产量的新方法》(专利申请号为:200910069517.5，公开号为:CN101671703)中的流加工艺。
4.例I和4叙述的是现有的生产工艺，实施例2和实施例3为与实施例1相对比的创新方法，实施例5和实施例6为与实施例4相对比的创新方法。
实施例1:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，30°C振荡培养30h;然后以6% (V/V)的接种量接入IOOmL发酵培养基(初始pH 6.8)中，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.4g/L。
实施例2:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，培养基中含有甘氨酸3g/L，30°C振荡培养30h ;然后以6% (V/V)的接种量接入IOOmL发酵培养基(初始pH 6.8)中，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.5g/L。
实施例3:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，30°C振荡培养48h，;然后以10% (V/V)的接种量接入含有甘氨酸2g/L的IOOmL发酵培养基中，初始pH 4.5，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.7g/L。
实施例4:一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好气培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04(80g/L)使残糖浓度达到12g/L ;同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；
(3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸为11.9g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
实施例5:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种含有甘氨酸(3g/L) 300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好氧培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04(80g/L)使残糖浓度达到12g/L ;同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；
(3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸12.9g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
实施例6:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种含有甘氨酸(3g/L) 300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好氧培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4) 2S04(80g/L)，使残糖浓度达到12g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L);同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；[0045](3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸15.2g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥 ，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
权利要求
1.一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，其特征在于:培养基中含有甘氨酸；所述甘氨酸的浓度为2或3 g/L,米用的菌种为白色链霉菌(Streptomyces albulus)CGMCC N0.1986和淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) CGMCC N0.3145。
2.根据权利要求
1所述的ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，其特征在于:所述甘氨酸在培养前期或中期加入。
专利摘要
本发明涉及一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，培养基中含有1～10g/L的甘氨酸，所述甘氨酸在培养前期或中期加入。本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，甘氨酸可进入叶酸代谢途径，为生物合成过程提供充足的一碳基团，提高菌株合成代谢活力，增加前体L-赖氨酸及ε-聚-L-赖氨酸的合成，使ε-聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了20～50％。
文档编号C12R1/525GKCN102363797 B发布类型授权 专利申请号CN 201110333684
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月28日
发明者贾士儒, 王甜, 谭之磊, 韩培培, 戴玉杰, 钟成, 宋帅, 张雪 申请人:天津科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),
技术领域：
本发明属于发酵工程领域，尤其是一种聚-L-赖氨酸的生产方法。
背景技术：
ε -聚-L-赖氨酸(ε -PL)是一种微生物源胞外线性多聚物，仅由25_35个L-1ysine残基通过α -羧基和ε-氨基连接而成。1977年，Shima和Sakai首次在Streptomyces albulus NBRC 14147菌株的发酵清液中发现这种氨基酸多聚物。ε -聚-L-赖氨酸是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌甚至某些病毒，抑·菌谱广泛。自从通过小鼠实验证明ε-PL安全性后，日本、韩国、美国等国家将其作为天然食品防腐剂并广泛应用。ε -PL及其衍生物应用范围较广，除可用于食品防腐外，还可以作为抗肥胖剂、药物和基因载体、持水性材料，以及生物芯片和生物电子学中的镀膜材料等。
据检索，发现以下关于ε -聚-L-赖氨酸的专利文献，其中CN1260004公开了一种大量生产ε -聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，该方法通过好气培养菌株Β21021 (FERMΒΡ-5926)并分离纯化所得ε -聚-L-赖氨酸。菌株Β21021是通过对小白链霉菌Iysinopolymerus亚种11011Α-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理而获得的,其对浓度为10mg/mL或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性。CN101285046公开了一种诱变菌株TUST2及利用该诱变菌株生产ε -聚赖氨酸及其盐的方法，是以在中国海南省土壤中分离得到的TUSTl为出发菌株，利用物理和化学诱变方法选育出的菌株TUST2 (CGMCCN0.1986),该菌株对10mg/mL或更高浓度AEC及2mg/mL甘氨酸具有抗性,优化条件下产酸量可达10 30g/L。然后发酵液经离心、过滤和弱酸性阳离子交换树脂等处理后得到分子量分布为4000 6500Da的ε -聚赖氨酸产品。CN101525640公开了一种ε -聚赖氨酸的制备方法，该方法是利用弗吉尼亚链霉菌Υ12，通过一级、二级种子扩大培养，发酵生产ε -聚赖氨酸，提取后得率可达8g/L以上。菌株Y12是出发菌株通过硫酸二乙酯、紫外等诱变方法获得的。CN102086441A公开了一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε -聚赖氨酸及其盐的方法，该方法利用灰褐色链霉菌LS-Hl发酵生产ε -聚赖氨酸，在优化条件下积累量为0.7 20g/L，然后发酵液经离心、离子交换得到ε-聚赖氨酸及其盐。CN101671703公开了一种提高ε -聚-L-赖氨酸产量的新方法,是以Streptomyces diastatochromogenes或Streptomyces albulus为生产菌株,在发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的过程中,产物开始积累以后，向培养基中流加L-赖氨酸以提高产量，然后将发酵液离心、离子交换吸附、脱色、真空干燥后得到ε -聚-L-赖氨酸盐酸盐。
上述专利文件主要集中在ε _聚-L-赖氨酸的生产菌种和发酵工艺上，但都没有研究甘氨酸对其发酵性能的影响，与本专利存在本质区别。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚-L-赖氨酸的生产方法，本发明通过增加外源培养基成分生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，在培养基中含有I 10g/L的甘氨酸，使ε-聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了 20 50%。
本发明实现目的的技术方案是:
—种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，培养基中含有甘氨酸。
而且，所述甘氨酸的浓度为I 10g/L。
而且，所述甘氨酸在培养前期或中期加入。
本发明的优点和积极效果是:
1、本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，甘氨酸可进入叶酸代谢途径，为生物合成过程提供充足的一碳基团，提高菌株合成代谢活力，增加前体L-赖氨酸及ε -聚-L-赖氨酸的合成，使ε -聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了 20 50%。
2、本发明改变了原有的发酵工艺，显著增加了生产菌株代谢活力，提高了ε_聚-L-赖氨酸的产率，从一定程度上增加了其积累量，降低了成本，可用于工业规模的发酵生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
首先需要说明的是:
1.以下实施例所用的白色链霉菌(Streptomyces albulus)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.1986，保藏日期为2007年3月23日。
2.以下实施例所用的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.3145，保藏日期为2009年6月29日。
本发明以上述两菌种为例来说明本发明，但是所用菌种的范围不仅仅限于上述两种，如本发明背景技术中提及的菌种均可以应用于本发明中，由于原理相同，具体操作步骤易于技术人员合理获知，本发明不再举例。
3.在发酵过程中流加L-赖氨酸是采用《一种提高ε -聚-L-赖氨酸产量的新方法》(专利申请号为:200910069517.5，公开号为:CN101671703)中的流加工艺。
4.例I和4叙述的是现有的生产工艺，实施例2和实施例3为与实施例1相对比的创新方法，实施例5和实施例6为与实施例4相对比的创新方法。
实施例1:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，30°C振荡培养30h;然后以6% (V/V)的接种量接入IOOmL发酵培养基(初始pH 6.8)中，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.4g/L。
实施例2:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，培养基中含有甘氨酸3g/L，30°C振荡培养30h ;然后以6% (V/V)的接种量接入IOOmL发酵培养基(初始pH 6.8)中，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.5g/L。
实施例3:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
在IOOmL培养基中接入I 2环淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的孢子，30°C振荡培养48h，;然后以10% (V/V)的接种量接入含有甘氨酸2g/L的IOOmL发酵培养基中，初始pH 4.5，30°C培养72h。发酵过程中，ε -聚-L-赖氨酸最高产量为0.7g/L。
实施例4:一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好气培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04(80g/L)使残糖浓度达到12g/L ;同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；
(3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸为11.9g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
实施例5:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种含有甘氨酸(3g/L) 300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好氧培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04(80g/L)使残糖浓度达到12g/L ;同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；
(3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸12.9g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
实施例6:
一种ε -聚-L-赖氨酸的生产方法，步骤如下:
(I)在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种含有甘氨酸(3g/L) 300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30°C培养，待DO降至30%时自动控制为30%，好氧培养120h，空气流速为4.0 6.0L/min ；
(2)当pH降至6.0左右时，流加氨水(氨水的浓度10 30 % g/mL)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH4) 2S04(80g/L)，使残糖浓度达到12g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L);同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右；[0045](3)培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε -聚-L-赖氨酸15.2g/L ；
(4)离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附以及洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥 ，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。
权利要求
1.一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，其特征在于:培养基中含有甘氨酸；所述甘氨酸的浓度为2或3 g/L,米用的菌种为白色链霉菌(Streptomyces albulus)CGMCC N0.1986和淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) CGMCC N0.3145。
2.根据权利要求
1所述的ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，其特征在于:所述甘氨酸在培养前期或中期加入。
专利摘要
本发明涉及一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，培养基中含有1～10g/L的甘氨酸，所述甘氨酸在培养前期或中期加入。本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，甘氨酸可进入叶酸代谢途径，为生物合成过程提供充足的一碳基团，提高菌株合成代谢活力，增加前体L-赖氨酸及ε-聚-L-赖氨酸的合成，使ε-聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了20～50％。
文档编号C12R1/525GKCN102363797 B发布类型授权 专利申请号CN 201110333684
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月28日
发明者贾士儒, 王甜, 谭之磊, 韩培培, 戴玉杰, 钟成, 宋帅, 张雪 申请人:天津科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),
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