一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法
专利名称:一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，涉及调控发酵生产植物生长物质的方法，尤其涉及一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，可靠地确定描述产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的方法。
背景技术：
温度是生物生命活动不可缺少的因素，是影响生命进程的基本因子。像细菌一类的变温生物，本身产热量低，代谢热和环境热比起来所起的作用较小，菌株的体温随着外界环境温度变化而改变。在自然选择和人工选择压力下，大多数细菌不同生态菌株，在一定条件下，都有一个特定的温度适应范围。在一定时空范围内，细菌把这种对温度的适应性，表现为在种群水平上生态学参数的差异，可以通过实验室恒温培养、数学建模来量化菌株的温度特征。
目前，有许多数学模型可以用来作为这种量化的工具。与线性数学模型相比，“温度-发育速率”非线性模型由于在建模过程中，一般都具有较为坚实的生理、生化信息等基础，因而常常被广泛应用。但是在不同条件下，各种数学模型的适应性有着明显的差别。
冠菌素(Coronatine，COR, C18H25NO4)是一种新型高效的生物源植物生长物质，多由丁香假单胞菌属的植物致病菌变种分泌于胞外，能有效促进植物次级代谢产物的生物合成，提高植物抗逆性，活性比茉莉酸高100 10000倍。因此，冠菌素合成有着广阔的市场前景。目前，获得冠菌素的途径主要有化学合成和生物合成。化学合成冠菌素的过程繁杂，得率仅有6.98%，合成费用高。生物合成冠菌素主要通过植物疫病的致病菌发酵产生。冠菌素产生菌株的经典菌株为Pseudomonas syringae pv.glycinea PG4180,早期研究表明经典菌株不能满足工业生产的需求。因此新菌株的选育成为后期研究的基础，但大部分产冠菌素菌株为植物病原菌，获得相对困难，因此对于经典菌株的诱变选育成为研究热点.[0005]张国栋、李召虎和吴慧玲等利用紫外和亚硝基胍等物理化学诱变法提高传统菌株的冠菌素产量。焦睿利用了 Tn5转座子对冠菌素产生菌株丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae.pv.glycinea) PG4180进行诱变；Bender等向hRcC基因中加入抗卡那霉素基因，获得APVl菌种，它可以适应大规模生产冠菌素的温度(26°C)要求，并且菌种没有致病性；吴晓玉等分别以菌株对萘代谢的温度敏感性及对红霉素抗性为筛选标志，依次采用亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、紫外线、吖啶橙与紫外线混合等诱变方式，经系列推理选育，获得产冠菌素能力为100μ g/mL的突变菌株，比野生菌株产量提高了 7.3倍。诚然，紫外诱变与亚甲基胍结合诱变使冠菌素产量得到了一定提高，然而也曝露出了工作量大、效率低的问题，这是传统诱变育种的共同问题，而且无论如何诱变选育，到目前为止，所获得的新菌株耐受温度仍然停留28°C (与野生菌株的冠菌素发酵极限温度一致)，因此要获得适宜工业应用的菌株，筛选耐温新型冠菌素产生菌株极为必要。
申请人:前期成功筛选到一株桑丁香 假单胞菌株(Pseudomonas syringaeP V.mori)M4-13(CGMCC N0.3621)具有产冠菌素特性，且在高温(32°C )下检测到冠菌素的产生(专利公开号CN 101948764A)。这表明温度不仅是冠菌素生物合成关键因素，也是菌株本身生长关键因子，对其温度特征描述、界定与保护成为这方面技术所必须部分，但目前未见确定产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)方法的报道与专利，而目前已经发表的这方面应用论文都没有考虑到模型参数在拟合后的显著性，以及生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度获得的可靠性检测，这往往造成拟合获得的参数不切合实际。
发明内容
解决的技术问题:
针对以上问题，本发明的目的是为了便于调控和优化植物生长物质冠菌素的发酵过程，提供一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法。通过此方法，来描述桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13 (CGMCC N0.3621)生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度。
技术方案:
一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，步骤为:
(I)菌株培养
将菌株在LB固体平板上涂布，32°C培养ld，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养1山将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养ld，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14°C 40°C范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养。
(2)构建菌体浓度-温度生长曲线
每隔Ih取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线。
(3)温度处理点生长速率
以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m(菌体浓度由分光光度法测得，λ =
550)，下列公式:
权利要求
1.一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，其特征在于步骤为: (1)菌株培养: 将保藏号 CGMCC N0.3621 的桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株在LB固体平板上涂布，32°C培养ld，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养Id,将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养ld，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14°C 40°C范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养； (2)构建菌体浓度-温度生长曲线 每隔Ih取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线； (3)温度处理点生长速率 以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m，菌体浓度由分光光度法测得，λ =550，由下列公式:
专利摘要
本发明公开了一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，包括(1)菌株培养，(2)构建菌体浓度-温度生长曲线，(3)温度处理点生长速率，(4)温度速率模型选择与拟合。温度是产冠菌素菌株生长关键因素，也是生产上调控和优化发酵过程的关键因素。本发明提供菌种生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的测定方法，可以稳健地提供菌种种群温度特征，为今后冠菌素菌株选育提供稳健可靠的实用技术。
文档编号C12Q1/02GKCN102517370 B发布类型授权 专利申请号CN 201110343220
公开日2013年8月7日 申请日期2011年11月3日
发明者王俊, 吴福安, 梁垚, 成杰 申请人:江苏科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，涉及调控发酵生产植物生长物质的方法，尤其涉及一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，可靠地确定描述产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的方法。
背景技术：
温度是生物生命活动不可缺少的因素，是影响生命进程的基本因子。像细菌一类的变温生物，本身产热量低，代谢热和环境热比起来所起的作用较小，菌株的体温随着外界环境温度变化而改变。在自然选择和人工选择压力下，大多数细菌不同生态菌株，在一定条件下，都有一个特定的温度适应范围。在一定时空范围内，细菌把这种对温度的适应性，表现为在种群水平上生态学参数的差异，可以通过实验室恒温培养、数学建模来量化菌株的温度特征。
目前，有许多数学模型可以用来作为这种量化的工具。与线性数学模型相比，“温度-发育速率”非线性模型由于在建模过程中，一般都具有较为坚实的生理、生化信息等基础，因而常常被广泛应用。但是在不同条件下，各种数学模型的适应性有着明显的差别。
冠菌素(Coronatine，COR, C18H25NO4)是一种新型高效的生物源植物生长物质，多由丁香假单胞菌属的植物致病菌变种分泌于胞外，能有效促进植物次级代谢产物的生物合成，提高植物抗逆性，活性比茉莉酸高100 10000倍。因此，冠菌素合成有着广阔的市场前景。目前，获得冠菌素的途径主要有化学合成和生物合成。化学合成冠菌素的过程繁杂，得率仅有6.98%，合成费用高。生物合成冠菌素主要通过植物疫病的致病菌发酵产生。冠菌素产生菌株的经典菌株为Pseudomonas syringae pv.glycinea PG4180,早期研究表明经典菌株不能满足工业生产的需求。因此新菌株的选育成为后期研究的基础，但大部分产冠菌素菌株为植物病原菌，获得相对困难，因此对于经典菌株的诱变选育成为研究热点.[0005]张国栋、李召虎和吴慧玲等利用紫外和亚硝基胍等物理化学诱变法提高传统菌株的冠菌素产量。焦睿利用了 Tn5转座子对冠菌素产生菌株丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae.pv.glycinea) PG4180进行诱变；Bender等向hRcC基因中加入抗卡那霉素基因，获得APVl菌种，它可以适应大规模生产冠菌素的温度(26°C)要求，并且菌种没有致病性；吴晓玉等分别以菌株对萘代谢的温度敏感性及对红霉素抗性为筛选标志，依次采用亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、紫外线、吖啶橙与紫外线混合等诱变方式，经系列推理选育，获得产冠菌素能力为100μ g/mL的突变菌株，比野生菌株产量提高了 7.3倍。诚然，紫外诱变与亚甲基胍结合诱变使冠菌素产量得到了一定提高，然而也曝露出了工作量大、效率低的问题，这是传统诱变育种的共同问题，而且无论如何诱变选育，到目前为止，所获得的新菌株耐受温度仍然停留28°C (与野生菌株的冠菌素发酵极限温度一致)，因此要获得适宜工业应用的菌株，筛选耐温新型冠菌素产生菌株极为必要。
申请人:前期成功筛选到一株桑丁香 假单胞菌株(Pseudomonas syringaeP V.mori)M4-13(CGMCC N0.3621)具有产冠菌素特性，且在高温(32°C )下检测到冠菌素的产生(专利公开号CN 101948764A)。这表明温度不仅是冠菌素生物合成关键因素，也是菌株本身生长关键因子，对其温度特征描述、界定与保护成为这方面技术所必须部分，但目前未见确定产冠菌素菌株生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)方法的报道与专利，而目前已经发表的这方面应用论文都没有考虑到模型参数在拟合后的显著性，以及生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度获得的可靠性检测，这往往造成拟合获得的参数不切合实际。
发明内容
解决的技术问题:
针对以上问题，本发明的目的是为了便于调控和优化植物生长物质冠菌素的发酵过程，提供一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法。通过此方法，来描述桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13 (CGMCC N0.3621)生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度。
技术方案:
一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，步骤为:
(I)菌株培养
将菌株在LB固体平板上涂布，32°C培养ld，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养1山将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养ld，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14°C 40°C范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养。
(2)构建菌体浓度-温度生长曲线
每隔Ih取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线。
(3)温度处理点生长速率
以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m(菌体浓度由分光光度法测得，λ =
550)，下列公式:
权利要求
1.一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，其特征在于步骤为: (1)菌株培养: 将保藏号 CGMCC N0.3621 的桑丁香假单胞菌株(Pseudomonas syringae pv.mori)M4-13菌株在LB固体平板上涂布，32°C培养ld，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养Id,将菌液稀释20000倍，再次涂布，挑单菌落于LB液体培养基中32°C试管培养ld，将菌液转移到含有200mL发酵培养基的500mL摇瓶内，在14°C 40°C范围内选取不同温度条件下，摇床280r/min培养； (2)构建菌体浓度-温度生长曲线 每隔Ih取3mL发酵液并回注液体培养基3mL，于550nm处分光光度计法测定菌液吸光度，绘制菌株在不同培养温度下的生长曲线，建立菌体浓度-温度生长曲线； (3)温度处理点生长速率 以菌体浓度-温度生长曲线对数期的斜率m，菌体浓度由分光光度法测得，λ =550，由下列公式:
专利摘要
本发明公开了一种产冠菌素菌株生长发育关键温度的测定方法，包括(1)菌株培养，(2)构建菌体浓度-温度生长曲线，(3)温度处理点生长速率，(4)温度速率模型选择与拟合。温度是产冠菌素菌株生长关键因素，也是生产上调控和优化发酵过程的关键因素。本发明提供菌种生长发育关键温度(生长起始温度、最适生长和高温致死临界温度)的测定方法，可以稳健地提供菌种种群温度特征，为今后冠菌素菌株选育提供稳健可靠的实用技术。
文档编号C12Q1/02GKCN102517370 B发布类型授权 专利申请号CN 201110343220
公开日2013年8月7日 申请日期2011年11月3日
发明者王俊, 吴福安, 梁垚, 成杰 申请人:江苏科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),
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