一种用于表达猪ifitm3基因的转基因猪的培育方法
专利名称:一种用于表达猪ifitm3基因的转基因猪的培育方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术和抗病育种领域。具体涉及一种具有抵抗动物病毒性疾病的转基因猪的培育方法，通过手工体细胞核移植技术制备表达猪源干扰素诱导跨膜蛋白 3 (swine interferon induced transmembrane 3，sIFITM3)基因的转基因猪。
背景技术：
动物传染病流行是严重制约我国养殖业持续发展的主要原因，其流行的三个基本环节是传染源、传播途径和易感动物。控制传染源、切断传播途径和提高易感动物的抗病能力是动物传染病防控的基本措施，其中提高易感动物的抗病能力是根本。提高易感动物抗病能力主要途径是疫苗免疫和抗病育种。虽然疫苗免疫目前在保护易感动物方面发挥了重要的作用，但是仍然存在诸多的缺点，譬如(1)对易变的RNA病毒免疫效果不佳，如2009 年至今的亚洲口蹄疫，导致日本顶级宫崎牛几乎灭绝，其一定程度上是由于病毒出现较大的变异，疫苗免疫效果不佳或无效；( 存在生物安全隐患，如2007年英国发生两起口蹄疫就是由于疫苗加工厂病毒逃逸；C3)疫苗免疫的高成本疫苗从研发到应用的周期很长，而且需要随着病原的变异不断更新换代；大多数疫苗需要逐个动物多次接种，物力和人力成本均很高。通过抗病育种途径提高猪的抗病力，是避免养猪生产遭受疾病困扰的一种很有前景的方法(袁树楷等，2007)，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。
常规育种技术对抗病等复杂性状的分析较困难、选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对抗病品种的需求。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。如果将疫苗免疫和抗病育种结合起来，必将有助于动物疫病控制和保障人类的健康。随着人类对动物传染病危害认识越来越深刻，目前国内外许多科学工作者都认识到了抗病育种的迫切性，通过现代分子技术阐明抗病力的遗传机理并结合分子育种进行抗病育种已经成为可能。越来越多的抗病育种候选基因被发掘并利用，1992年德国慕尼黑大学的Brem小组首次培育出小鼠流感抗性基因Mxl的转基因猪(MUller et al.，1992)。1994年Clements等将Visna病毒的衣壳蛋白基因(eve)转入绵羊，获得了对该病毒抗病能力明显提高的转基因羊。2000年，Kerr等将溶葡球菌酶基因转入小鼠乳腺中，获得抗乳腺炎转基因小鼠。后来，相继培育出抗乳房炎的转基因牛(Donovan et al.，2005)和山羊(Maga et al.，2006)。 此外，在抗牛海绵状脑病和羊瘙痒病转基因动物研究方面也取得了显著进展。1993年，瑞士的Wfeissmann小组培育出对羊瘙痒病有抗性的PrP敲除小鼠(Bueler H et al.，1993)。 后来，不同的科学家运用基因打靶技术相继培育出抗羊瘙痒病的克隆羊(Denning et al., 2001 ；Golding et al.，2006)和抗牛海绵状脑病的克隆牛(Kuroiwa et al.，2004 ；Golding et al.，2006 ；Richt et al. ,2007)
干扰素诱导跨膜基因(interferon induced transmembrane, IFITM)属于干扰素刺激基因(interferon stimulated genes, ISGs)中一类较小的分子，包括IFITM 1 3，
3IFITM5 和 IFITM6，(Martensen et al. ,2004 ；Fredy Siegrist et al.，2011)。IFITMs 参与早期发育、细胞间黏着与分化、宿主免疫防御反应以及天然免疫相关的生物过程等功能 (Saitou M et al. ,2002 ；Siegrist F, et al. ,2011) Brass 等利用 RNAi 库筛选鉴定出 IFITMl 3为病毒的限制因子，主要影响病毒进入细胞阶段来有效抑制流感病毒、水疱性口炎病毒和WNV等虫媒病毒复制，其中IFITM3是最具有潜力的抑制病毒复制的宿主限制因子，其抗病毒谱越来越广泛(Brass et al,，2009 Jiang et al. ,2010 ；Huang et al.， 2011，Lu et al,2011)。
本发明以猪IFITM3为研究对象，基于传统克隆技术，利用真核质粒pCAsIFITM3转染大白猪成纤维细胞，通过G418筛选，PCR与RT-PCR鉴定建立转基因sIFITM3细胞系。将所建立的转基因细胞系用于手工核移植，借助囊胚移植5头受体母猪，有4头母猪受孕，通过mRNA等检测SIFITM3蛋白表达证实获得sIFITM3的转基因克隆猪。该转基因猪可用于研究SIFITM3抗病毒的动物模型以及培育具有抗病性能的优良品种猪。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，方法易行，操作简便，通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出表达猪IFITM3的猪成纤维细胞；通过手工核移植表达SIFITM3的猪成纤维细胞系于受体猪卵母细胞获得重构囊胚， 进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后，通过PCR检测SIFITM3基因， 获得阳性转基因猪。为抗病育种研究提供良好素材。该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪， 具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤是
1.稳定表达SIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建
1. 1 pcDNACAsIITM3 载体构建与线性化参照 GenBank HQ641403. 1 IFITM3 基因序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得SIFITM3基因， 大小438bp。通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCAQnvitrogen, Amp+，4713bp)中，获得载体pCA_sIFITM3，大小为5151bp。进而通过SspI和XhoI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb，分别回收 2280bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACASIITM3。载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
1.2脂质体转染为了构建稳定表达SIFITM3的猪成纤维细胞，按照脂质体 Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养。
1. 3转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖转染sIFITM3基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。 进而通过PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚。
2.手工核移植方法获取重组囊胚
2. 1受体细胞的准备按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 50C的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL, 赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10% ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL， 肝素30IU/mL，2% ν/ν血清)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液(TCM-199 (IX) 80% ν/ν, hCG 15IU/mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% )的四孔板中，38. 5°C，5% CO2成熟36小时，用于克隆操作。
2. 2去核以及核供体细胞的注射用5. 0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。 按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m 的尖的去核管吸取少量1 μ L细胞质，进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。
注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% O2, 5% C02，90%队培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。
3.胚胎移植以及转基因猪的获取
胚胎移植按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN 101427946A)方法进行胚胎移植。将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植约88个融合细胞，共移植5头母猪。胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价。 以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测 6次。
转基因个体鉴定小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，提取组织DNA，通过 NP03/SI3-R 引物引物扩增 NP03 :5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC_3，SI3-R :5_CTAGTAGCCTCTGTAA TCCTTTATGAGC-3，对转基因猪基因组中sIFITM3基因进行鉴定。
基于上述方法，本发明人通过细胞转染和细胞筛选技术获得表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞作为核供体细胞，利用手工移植将核供体细胞移植到去核的受体胚胎中，产生表达SIFITM3的的重组胚胎；进而在体外培养到胚泡期并移植到受孕母猪的卵巢中，获得阳性克隆猪。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
方法易行，操作简便，通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出表达猪IFITM3的猪成纤维细胞；通过手工核移植表达SIFITM3的猪成纤维细胞系于受体猪卵母细胞获得重构囊胚，进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后，通过PCR、RT-PCR检测 SIFITM3基因以及在mRNA水平检测其表达，获得阳性转基因猪。为抗病育种研究提供良好素材。该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。本发明提供了表达猪源IFITM3基因的转基因猪的培育。利用常规手工移植的方法，将核供体细胞移植到去核的受体胚胎中，产生表达SIFITM3的的重组胚胎；进而在体外培养到胚泡期并移植到受孕母猪的卵巢中，获得阳性克隆猪。本发明提供了表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等病毒的能力，为抗病育种提供优良的动物模型。
图1为一种AccI线性化pcDNACAsIFITM3示意图；
通过RT-PCR扩增猪的IFITM3基因，测序结果表明全长为438bp，通过XbaI和 XhoI将SIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA(Invitrogen，Amp+，4713bp)中，获得载体 pCA-sIFITM3,大小为 5151bp。进而通过 SspI 和 XhoI 双酶切 pCA_sIFITM3 和 pCDNA3. 1 (+) (Invitrogen，neo+/Amp+，5. 4kb，分别回收2280bp的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶得到pcDNACAsIITM3。AccI线性化pcDNACAsIITM3可见一条6. 6Kb条带，直接用于转染构建表达IFITM3基因的细胞系。
图2为一种显示了表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞阳性克隆筛选及鉴定示意图；
其中A图是正常制备大白系猪胎猪成纤维细胞示意图；图B是将pCA_sIFITM3转染大白系猪胎猪成纤维细胞，通过G418筛选获得阳性细胞克隆图；图C是阳性克隆细胞的 RT-PCR的鉴定图。
图3为一种显示表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞核移植受体细胞后第6天囊胚示意图；
将表达IFITM3的大白猪成纤维细胞作为供核细胞，通过手工移植于卵母细胞获得重组胚胎，体外培养6天后囊胚的形态图，直接用于移植受孕母猪。
图4为一种是SIFITM3转基因受体母猪B超检测示意图；
胚胎移植4周后用超声波对受孕母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，受孕状况良好。
图5为一种是SIFITM3转基因猪PCR鉴定示意图；
转基因小猪出生后提取组织提取DNA，取50ng为模板，NP03/SI3-R引物， 950C 5min, (94°C 30s, 66°C 30S，72°C 30s) X 35，72°C，5min 进行扩增。1. 5%琼脂糖凝胶， 140V，35min，EB染色15min结果。阴性为水和非转基因DB13细胞系总DNA，取50ng为模板，阳性为PCASI3 IOng质粒为模板。
具体实施方式
实施例1
一种用于制备转基因猪的猪干扰素诱导跨膜3基因(interferon induced transmembrane 3, IFITM3)的制备方法，其步骤是
1、猪干扰素诱导跨膜3基因的获得
参照GenBank HQ641403. 1 IFITM3基因序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织 RNA，进行RT-PCR扩增SIFITM3基因，其引物序列如下CN 102391990 A
说明书
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sIFITM 3F :5，_tttgaattccaccatgaactgcgct_3，
sIFITM 3R 5' -tttctcgagtcagatcatcgga-3'
利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增，其反应体系为模板质粒 0. 25 μ L，10XLA buffer 5 μ L，pTRIM25F、pTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (终浓度为 10pmol/L)，LA 酶 0.25yL，dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按 94°C作用 3 分钟； 然后94°C作用30秒分钟，58 °C退火30秒，72 °C延伸3分钟，共35个循环，最后72 °C延伸10 分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8% (g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段。
2、用于制备转基因猪真核表达载体ρ⑶NACASIITM3的构建
通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCAQnvitrogen, Amp+, 4713bp)中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为515Ibp。进而通过kpl和XhoI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1 (+) (Invitrogen, neo+/Amp+，5. 4kb)，分别回收 2^0bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACAsIITM3，转化大肠杆菌DH-5 α， 置_80°C保存。载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
实施例2
一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育，其步骤是
1.稳定表达SIFITM3基因的大白猪成纤维细胞系的构建
1. 1载体线性化
载体质粒pCDNACAsIITM3大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
1. 2脂质体转染
按照常规方法(《动物细胞培养技术与应用》，王捷主编，北京市化学工业出版社， 2004)，分离制备用作核供体细胞一大白胎猪的成纤维细胞。通过除去胎膜分离胎猪，用含抗生素的磷酸盐缓冲液将胎猪洗涤3次，然后除去胎猪的四肢、头部和内脏。用小剪刀机械方法磨碎组织，进而通过胰酶_EDTA(乙二胺四乙酸)37°C消化20分钟，制备成纤维细胞，用含 15% (ν/ν)胎牛血清(FCS,Gibco,Life Technologies Inc.)，1000 单位青霉素和 1000 μ g/mL链霉素的Dulbecco，s改良的Eagle's培养基(DMEM,Gibco,Life Technologies Inc.)扩大培养和冻存。
按照脂质体LipofeCtamineTM2000说明书进行转染，将AccI线性化处理的 pCA-sIFITM3转染猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养。
1. 3转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖
由于骨架载体 pcDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+，5. 4kb)含有选择性标记的新霉素抗性基因，因而可以在特定的抗生素新霉素存在下通过体外培养选择转染了 SIFITM3基因的核供体细胞。在含有新霉素的培养基中，只有转染了该载体的细胞能够存活，没有转染的细胞由于新霉素的作用而死亡。转染SIFITM3基因后，将核供体细胞培养3 天，利用600yg/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。进而通过PCR 和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚。
2.手工核移植方法获取重组囊胚[0053]2. 1受体细胞的准备
按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢，在恒温(32 34°C )条件下运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 5°C 的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL,赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10 % ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL,肝素 30IU/mL，血清2% ν/ν)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在 5% C02培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外成熟培养液(TCM-199 (IX) 80% ν/ν, hCG15IU/mL, PMSF 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% ν/ν)的四孔板中，38. 5°C，5% C02成熟36小时，用于克隆操作。
2. 2去核以及核供体细胞的注射
用5. 0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时， 灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取1 μ L细胞质， 进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。
注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% O2, 5% C02，90%队培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。
3.胚胎移植以及转基因猪的培育
3. 1胚胎移植
按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN 101427946A)方法进行胚胎移植，将代孕母猪人工保定，从阴门处向阴道内插入深宫输精管外管至其海绵头堵住子宫颈口，再向深宫输精管内插入长约1.5米地内置柔性细管至子宫角内。将发育至囊胚阶段的猪胚胎从内置的柔性细管外部开口处注入，由内置柔性细管引导进入子宫角，利用空气压力使其流入子宫内。
于2011年5月3日移植3头和4日移植2头受孕母猪，所用细胞系分别为 SI3-105/84和SI3-106/51平均每头移植约88个融合细胞。胚胎移植25天后用超声波对母猪的妊娠情况进行评价。除了编号116的猪只外，另外4头母猪均成功受孕。以后每隔两周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况。4头受孕母猪顺利产下16头大白小猪。
3. 2基因组检测SIFITM3基因
提取了 4窝共16头小猪的基因组，转基因猪通过NP03/SI3-R引物引物扩增NP03 5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3, SI3-R 5-CTAGTAGCCTCTGTAATCCTTTATGAGC-3,扩增产物在0.8% (g/v)琼脂糖凝胶上进行电泳检测，均能检测出480bp的特异性片段，证实转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中。图5为部分猪只PCR检测结果(如图5)。结果表明从16头小猪的10头猪的基因组中，均扩增出480bp的特异性片段，水和非转基因DB13细胞系阴性对照中均没有扩增出目的片段。
以上结果表明通过核移植技术成功的获得了 20头转基因猪，目前小猪生长健康， 通过基因组和转录水平均已证实了转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中并且表达。 SIFITM3的活性在本实验室的其它实验中证实。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求
书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求
书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。
权利要求
1.一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤是A、稳定表达SIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得SIFITM3基因，大小438bp，通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体PCA中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为5151bp，通过kpl和BioI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb，分别回收 2280bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACAsIITM3，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染为了构建稳定表达sIFITM3的猪成纤维细胞，按照脂质体 Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养；C、转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖转染SIFITM3基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过 PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；B、手工核移植方法获取重组囊胚a、受体细胞的准备制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至 38. 5°C的洗卵液2% ν/ν血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液TCM-199 (IX) 80% v/v,hCG 15IU/ mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0. 10mg/mL，庆大霉素0. 05mg/mL，猪卵泡液10%，血清10%的四孔板中，38.5°C,5% CO2成熟36小时，用于克隆操作；b、去核以及核供体细胞的注射用5.0μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，进行显微操作，将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取少量1 μ L细胞质，吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，产生核移植胚胎；C、胚胎移植以及转基因猪的获取a、胚胎移植进行胚胎移植，将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植 88个融合细胞，共移植5头母猪，胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测6次；b、转基因个体鉴定小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，通过PCR对SIFITM3进行基因组进行鉴定。
2.根据权利要求
1所述的一种表达猪IFITM3基因的转基因猪，其特征在于所述的转基因猪通过 NP03/S13-R 引物引物扩增 NP03 5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3，S13-R 5-CTAGTA GCCTCTGTAATCCTTTATGAGC-3，扩增产物在0. 8% g/v琼脂糖凝胶上进行电泳检测，均能检测出480bp的特异性片段，证实转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中。
专利摘要
本发明公开了一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤A、稳定表达sIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得sIFITM3基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染构建表达sIFITM3的猪成纤维细胞；c、转染sIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖；B、手工核移植方法获取重组囊胚a、受体细胞的准备；b、去核以及核供体细胞的注射；C、胚胎移植以及转基因猪的获取a、胚胎移植将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，检测；b、转基因个体鉴定。方法易行，操作简便，该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。
文档编号A61D19/04GKCN102391990SQ201110349688
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月8日
发明者李祥敏, 钱平, 陈焕春 申请人:华中农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及生物医药技术和抗病育种领域。具体涉及一种具有抵抗动物病毒性疾病的转基因猪的培育方法，通过手工体细胞核移植技术制备表达猪源干扰素诱导跨膜蛋白 3 (swine interferon induced transmembrane 3，sIFITM3)基因的转基因猪。
背景技术：
动物传染病流行是严重制约我国养殖业持续发展的主要原因，其流行的三个基本环节是传染源、传播途径和易感动物。控制传染源、切断传播途径和提高易感动物的抗病能力是动物传染病防控的基本措施，其中提高易感动物的抗病能力是根本。提高易感动物抗病能力主要途径是疫苗免疫和抗病育种。虽然疫苗免疫目前在保护易感动物方面发挥了重要的作用，但是仍然存在诸多的缺点，譬如(1)对易变的RNA病毒免疫效果不佳，如2009 年至今的亚洲口蹄疫，导致日本顶级宫崎牛几乎灭绝，其一定程度上是由于病毒出现较大的变异，疫苗免疫效果不佳或无效；( 存在生物安全隐患，如2007年英国发生两起口蹄疫就是由于疫苗加工厂病毒逃逸；C3)疫苗免疫的高成本疫苗从研发到应用的周期很长，而且需要随着病原的变异不断更新换代；大多数疫苗需要逐个动物多次接种，物力和人力成本均很高。通过抗病育种途径提高猪的抗病力，是避免养猪生产遭受疾病困扰的一种很有前景的方法(袁树楷等，2007)，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。
常规育种技术对抗病等复杂性状的分析较困难、选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对抗病品种的需求。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。如果将疫苗免疫和抗病育种结合起来，必将有助于动物疫病控制和保障人类的健康。随着人类对动物传染病危害认识越来越深刻，目前国内外许多科学工作者都认识到了抗病育种的迫切性，通过现代分子技术阐明抗病力的遗传机理并结合分子育种进行抗病育种已经成为可能。越来越多的抗病育种候选基因被发掘并利用，1992年德国慕尼黑大学的Brem小组首次培育出小鼠流感抗性基因Mxl的转基因猪(MUller et al.，1992)。1994年Clements等将Visna病毒的衣壳蛋白基因(eve)转入绵羊，获得了对该病毒抗病能力明显提高的转基因羊。2000年，Kerr等将溶葡球菌酶基因转入小鼠乳腺中，获得抗乳腺炎转基因小鼠。后来，相继培育出抗乳房炎的转基因牛(Donovan et al.，2005)和山羊(Maga et al.，2006)。 此外，在抗牛海绵状脑病和羊瘙痒病转基因动物研究方面也取得了显著进展。1993年，瑞士的Wfeissmann小组培育出对羊瘙痒病有抗性的PrP敲除小鼠(Bueler H et al.，1993)。 后来，不同的科学家运用基因打靶技术相继培育出抗羊瘙痒病的克隆羊(Denning et al., 2001 ；Golding et al.，2006)和抗牛海绵状脑病的克隆牛(Kuroiwa et al.，2004 ；Golding et al.，2006 ；Richt et al. ,2007)
干扰素诱导跨膜基因(interferon induced transmembrane, IFITM)属于干扰素刺激基因(interferon stimulated genes, ISGs)中一类较小的分子，包括IFITM 1 3，
3IFITM5 和 IFITM6，(Martensen et al. ,2004 ；Fredy Siegrist et al.，2011)。IFITMs 参与早期发育、细胞间黏着与分化、宿主免疫防御反应以及天然免疫相关的生物过程等功能 (Saitou M et al. ,2002 ；Siegrist F, et al. ,2011) Brass 等利用 RNAi 库筛选鉴定出 IFITMl 3为病毒的限制因子，主要影响病毒进入细胞阶段来有效抑制流感病毒、水疱性口炎病毒和WNV等虫媒病毒复制，其中IFITM3是最具有潜力的抑制病毒复制的宿主限制因子，其抗病毒谱越来越广泛(Brass et al,，2009 Jiang et al. ,2010 ；Huang et al.， 2011，Lu et al,2011)。
本发明以猪IFITM3为研究对象，基于传统克隆技术，利用真核质粒pCAsIFITM3转染大白猪成纤维细胞，通过G418筛选，PCR与RT-PCR鉴定建立转基因sIFITM3细胞系。将所建立的转基因细胞系用于手工核移植，借助囊胚移植5头受体母猪，有4头母猪受孕，通过mRNA等检测SIFITM3蛋白表达证实获得sIFITM3的转基因克隆猪。该转基因猪可用于研究SIFITM3抗病毒的动物模型以及培育具有抗病性能的优良品种猪。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，方法易行，操作简便，通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出表达猪IFITM3的猪成纤维细胞；通过手工核移植表达SIFITM3的猪成纤维细胞系于受体猪卵母细胞获得重构囊胚， 进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后，通过PCR检测SIFITM3基因， 获得阳性转基因猪。为抗病育种研究提供良好素材。该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪， 具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤是
1.稳定表达SIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建
1. 1 pcDNACAsIITM3 载体构建与线性化参照 GenBank HQ641403. 1 IFITM3 基因序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得SIFITM3基因， 大小438bp。通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCAQnvitrogen, Amp+，4713bp)中，获得载体pCA_sIFITM3，大小为5151bp。进而通过SspI和XhoI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb，分别回收 2280bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACASIITM3。载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
1.2脂质体转染为了构建稳定表达SIFITM3的猪成纤维细胞，按照脂质体 Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养。
1. 3转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖转染sIFITM3基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。 进而通过PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚。
2.手工核移植方法获取重组囊胚
2. 1受体细胞的准备按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 50C的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL, 赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10% ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL， 肝素30IU/mL，2% ν/ν血清)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液(TCM-199 (IX) 80% ν/ν, hCG 15IU/mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% )的四孔板中，38. 5°C，5% CO2成熟36小时，用于克隆操作。
2. 2去核以及核供体细胞的注射用5. 0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。 按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m 的尖的去核管吸取少量1 μ L细胞质，进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。
注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% O2, 5% C02，90%队培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。
3.胚胎移植以及转基因猪的获取
胚胎移植按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN 101427946A)方法进行胚胎移植。将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植约88个融合细胞，共移植5头母猪。胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价。 以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测 6次。
转基因个体鉴定小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，提取组织DNA，通过 NP03/SI3-R 引物引物扩增 NP03 :5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC_3，SI3-R :5_CTAGTAGCCTCTGTAA TCCTTTATGAGC-3，对转基因猪基因组中sIFITM3基因进行鉴定。
基于上述方法，本发明人通过细胞转染和细胞筛选技术获得表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞作为核供体细胞，利用手工移植将核供体细胞移植到去核的受体胚胎中，产生表达SIFITM3的的重组胚胎；进而在体外培养到胚泡期并移植到受孕母猪的卵巢中，获得阳性克隆猪。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
方法易行，操作简便，通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出表达猪IFITM3的猪成纤维细胞；通过手工核移植表达SIFITM3的猪成纤维细胞系于受体猪卵母细胞获得重构囊胚，进而将阳性囊胚移植入受体母猪输卵管中，受孕母猪产仔后，通过PCR、RT-PCR检测 SIFITM3基因以及在mRNA水平检测其表达，获得阳性转基因猪。为抗病育种研究提供良好素材。该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。本发明提供了表达猪源IFITM3基因的转基因猪的培育。利用常规手工移植的方法，将核供体细胞移植到去核的受体胚胎中，产生表达SIFITM3的的重组胚胎；进而在体外培养到胚泡期并移植到受孕母猪的卵巢中，获得阳性克隆猪。本发明提供了表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等病毒的能力，为抗病育种提供优良的动物模型。
图1为一种AccI线性化pcDNACAsIFITM3示意图；
通过RT-PCR扩增猪的IFITM3基因，测序结果表明全长为438bp，通过XbaI和 XhoI将SIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCA(Invitrogen，Amp+，4713bp)中，获得载体 pCA-sIFITM3,大小为 5151bp。进而通过 SspI 和 XhoI 双酶切 pCA_sIFITM3 和 pCDNA3. 1 (+) (Invitrogen，neo+/Amp+，5. 4kb，分别回收2280bp的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶得到pcDNACAsIITM3。AccI线性化pcDNACAsIITM3可见一条6. 6Kb条带，直接用于转染构建表达IFITM3基因的细胞系。
图2为一种显示了表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞阳性克隆筛选及鉴定示意图；
其中A图是正常制备大白系猪胎猪成纤维细胞示意图；图B是将pCA_sIFITM3转染大白系猪胎猪成纤维细胞，通过G418筛选获得阳性细胞克隆图；图C是阳性克隆细胞的 RT-PCR的鉴定图。
图3为一种显示表达SIFITM3的大白猪成纤维细胞核移植受体细胞后第6天囊胚示意图；
将表达IFITM3的大白猪成纤维细胞作为供核细胞，通过手工移植于卵母细胞获得重组胚胎，体外培养6天后囊胚的形态图，直接用于移植受孕母猪。
图4为一种是SIFITM3转基因受体母猪B超检测示意图；
胚胎移植4周后用超声波对受孕母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，受孕状况良好。
图5为一种是SIFITM3转基因猪PCR鉴定示意图；
转基因小猪出生后提取组织提取DNA，取50ng为模板，NP03/SI3-R引物， 950C 5min, (94°C 30s, 66°C 30S，72°C 30s) X 35，72°C，5min 进行扩增。1. 5%琼脂糖凝胶， 140V，35min，EB染色15min结果。阴性为水和非转基因DB13细胞系总DNA，取50ng为模板，阳性为PCASI3 IOng质粒为模板。
具体实施方式
实施例1
一种用于制备转基因猪的猪干扰素诱导跨膜3基因(interferon induced transmembrane 3, IFITM3)的制备方法，其步骤是
1、猪干扰素诱导跨膜3基因的获得
参照GenBank HQ641403. 1 IFITM3基因序列，设计一对引物，提取猪的淋巴结组织 RNA，进行RT-PCR扩增SIFITM3基因，其引物序列如下CN 102391990 A
说明书
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sIFITM 3F :5，_tttgaattccaccatgaactgcgct_3，
sIFITM 3R 5' -tttctcgagtcagatcatcgga-3'
利用两步法进行扩增，首先反转录得到cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增，其反应体系为模板质粒 0. 25 μ L，10XLA buffer 5 μ L，pTRIM25F、pTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (终浓度为 10pmol/L)，LA 酶 0.25yL，dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按 94°C作用 3 分钟； 然后94°C作用30秒分钟，58 °C退火30秒，72 °C延伸3分钟，共35个循环，最后72 °C延伸10 分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8% (g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小438bp片段。
2、用于制备转基因猪真核表达载体ρ⑶NACASIITM3的构建
通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体pCAQnvitrogen, Amp+, 4713bp)中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为515Ibp。进而通过kpl和XhoI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1 (+) (Invitrogen, neo+/Amp+，5. 4kb)，分别回收 2^0bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACAsIITM3，转化大肠杆菌DH-5 α， 置_80°C保存。载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
实施例2
一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育，其步骤是
1.稳定表达SIFITM3基因的大白猪成纤维细胞系的构建
1. 1载体线性化
载体质粒pCDNACAsIITM3大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解。
1. 2脂质体转染
按照常规方法(《动物细胞培养技术与应用》，王捷主编，北京市化学工业出版社， 2004)，分离制备用作核供体细胞一大白胎猪的成纤维细胞。通过除去胎膜分离胎猪，用含抗生素的磷酸盐缓冲液将胎猪洗涤3次，然后除去胎猪的四肢、头部和内脏。用小剪刀机械方法磨碎组织，进而通过胰酶_EDTA(乙二胺四乙酸)37°C消化20分钟，制备成纤维细胞，用含 15% (ν/ν)胎牛血清(FCS,Gibco,Life Technologies Inc.)，1000 单位青霉素和 1000 μ g/mL链霉素的Dulbecco，s改良的Eagle's培养基(DMEM,Gibco,Life Technologies Inc.)扩大培养和冻存。
按照脂质体LipofeCtamineTM2000说明书进行转染，将AccI线性化处理的 pCA-sIFITM3转染猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养。
1. 3转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖
由于骨架载体 pcDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+，5. 4kb)含有选择性标记的新霉素抗性基因，因而可以在特定的抗生素新霉素存在下通过体外培养选择转染了 SIFITM3基因的核供体细胞。在含有新霉素的培养基中，只有转染了该载体的细胞能够存活，没有转染的细胞由于新霉素的作用而死亡。转染SIFITM3基因后，将核供体细胞培养3 天，利用600yg/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养。进而通过PCR 和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚。
2.手工核移植方法获取重组囊胚[0053]2. 1受体细胞的准备
按律波等方法制备受体细胞(律波等，一种猪卵母细胞体外培养成熟方法，专利公开号CN1014^492A)。从屠宰场收集猪的卵巢，在恒温(32 34°C )条件下运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至38. 5°C 的洗卵液(碳酸氢钠0. 17mg/mL,丙酮酸钠0. 22mg/mL,赫佩斯钠盐3. 60mg/mL,赫佩斯酸 2. 63mg/mL, TCM-199 (IOX) 10 % ν/ν,谷氨酰胺 0. 20mg/mL,两性霉素 B 3. 0 μ g/mL,肝素 30IU/mL，血清2% ν/ν)轻轻洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有优质的卵母细胞。所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在 5% C02培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外成熟培养液(TCM-199 (IX) 80% ν/ν, hCG15IU/mL, PMSF 10IU/mL，谷氨酰胺 0. 10mg/mL，庆大霉素 0. 05mg/mL，猪卵泡液 10%，血清10% ν/ν)的四孔板中，38. 5°C，5% C02成熟36小时，用于克隆操作。
2. 2去核以及核供体细胞的注射
用5. 0 μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时， 灭活卵母细胞，使之无法进行RNA转录和合成蛋白。将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，便于进行显微操作。按照杜玉涛等人(杜玉涛等，一种细胞核移植方法，专利公开号CN101580828A)的描述将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取1 μ L细胞质， 进而吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，由此产生核移植胚胎。
注射完成后通过BTX Electro-Cell Manipulator 200 (BTX, San Diego, CA)电细胞操纵装置产生30微妙，1. 8kV/cm的单向直流电脉冲使供体细胞和去核卵母细胞融合。用修饰的北卡大学培养基(North Carolina university 37medium，参照 Kikuchi et al.， 2002)洗涤电融合的重组胚胎，转入％ig/mL牛血清白蛋白的NS⑶-37培养液滴中培养50分钟。在38. 5°C，5% O2, 5% C02，90%队培养箱中培养6天后，观察重组囊胚的发育情况。
3.胚胎移植以及转基因猪的培育
3. 1胚胎移植
按照律波等(一种猪胚胎移植方法，专利公开号CN 101427946A)方法进行胚胎移植，将代孕母猪人工保定，从阴门处向阴道内插入深宫输精管外管至其海绵头堵住子宫颈口，再向深宫输精管内插入长约1.5米地内置柔性细管至子宫角内。将发育至囊胚阶段的猪胚胎从内置的柔性细管外部开口处注入，由内置柔性细管引导进入子宫角，利用空气压力使其流入子宫内。
于2011年5月3日移植3头和4日移植2头受孕母猪，所用细胞系分别为 SI3-105/84和SI3-106/51平均每头移植约88个融合细胞。胚胎移植25天后用超声波对母猪的妊娠情况进行评价。除了编号116的猪只外，另外4头母猪均成功受孕。以后每隔两周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况。4头受孕母猪顺利产下16头大白小猪。
3. 2基因组检测SIFITM3基因
提取了 4窝共16头小猪的基因组，转基因猪通过NP03/SI3-R引物引物扩增NP03 5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3, SI3-R 5-CTAGTAGCCTCTGTAATCCTTTATGAGC-3,扩增产物在0.8% (g/v)琼脂糖凝胶上进行电泳检测，均能检测出480bp的特异性片段，证实转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中。图5为部分猪只PCR检测结果(如图5)。结果表明从16头小猪的10头猪的基因组中，均扩增出480bp的特异性片段，水和非转基因DB13细胞系阴性对照中均没有扩增出目的片段。
以上结果表明通过核移植技术成功的获得了 20头转基因猪，目前小猪生长健康， 通过基因组和转录水平均已证实了转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中并且表达。 SIFITM3的活性在本实验室的其它实验中证实。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求
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权利要求
1.一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤是A、稳定表达SIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化设计一对引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得SIFITM3基因，大小438bp，通过XbaI和XhoI将sIFITM3亚克隆于的真核表达载体PCA中，获得载体pCA-sIFITM3，大小为5151bp，通过kpl和BioI双酶切 pCA-sIFITM3 和 pCDNA3. 1(+) (Invitrogen, neo+/Amp+, 5. 4kb，分别回收 2280bp 的外源片段和43Mbp的载体片段，通过连接酶连接得到pcDNACAsIITM3，载体质粒大提后用AccI进行线性化处理，然后乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染为了构建稳定表达sIFITM3的猪成纤维细胞，按照脂质体 Lipofectamine 2000说明书进行转染上述制备的猪成纤维细胞，5% CO2, 38. 5°C培养；C、转染SIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖转染SIFITM3基因后，将核供体细胞培养2-4天，利用600 μ g/ml G418连续筛选8天后，获得抗性单克隆细胞并扩大培养，通过 PCR和RT-PCR方法对获得细胞进行鉴定，得到表达SIFITM3的转基因猪成纤维细胞，用于后续手工核移植制备重组囊胚；B、手工核移植方法获取重组囊胚a、受体细胞的准备制备受体细胞，从屠宰场收集猪的卵巢放置入生理盐水的容器内运输至实验室，将卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡内的卵母细胞和卵泡液一起流出，用预热至 38. 5°C的洗卵液2% ν/ν血清洗涤卵泡，在显微镜下挑选颗粒细胞层多且致密，胞质均勻的卵母细胞，收集卵泡液中所有的卵母细胞，所得卵母细胞以40-50个为一个孔，移至在5% CO2培养箱平衡6小时，内置400 μ L卵母细胞体外培养液TCM-199 (IX) 80% v/v,hCG 15IU/ mL，PMSG 10IU/mL，谷氨酰胺0. 10mg/mL，庆大霉素0. 05mg/mL，猪卵泡液10%，血清10%的四孔板中，38.5°C,5% CO2成熟36小时，用于克隆操作；b、去核以及核供体细胞的注射用5.0μ g/mL柔红菌素作为去核试剂，处理体外培养成熟的猪卵母细胞10小时，灭活卵母细胞，将成熟后的卵母细胞-卵丘复合体，用透明质酸酶消化卵丘细胞形成裸卵，进行显微操作，将裸卵放入显微操作盘操作滴中，用固定吸液管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20 25 μ m的尖的去核管吸取少量1 μ L细胞质，吸取供核细胞，再将细胞质和供体细胞一起注入卵母细胞的卵周隙中，产生核移植胚胎；C、胚胎移植以及转基因猪的获取a、胚胎移植进行胚胎移植，将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，平均每头移植 88个融合细胞，共移植5头母猪，胚胎移植4周后用超声波对母猪的妊娠情况进行第一次检测评价，以后每隔一周进行一次超声波检测仪监控受孕母猪的妊娠情况和胎猪的生长情况，共检测6次；b、转基因个体鉴定小猪生产后饲养至断奶后取其耳部组织，通过PCR对SIFITM3进行基因组进行鉴定。
2.根据权利要求
1所述的一种表达猪IFITM3基因的转基因猪，其特征在于所述的转基因猪通过 NP03/S13-R 引物引物扩增 NP03 5-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3，S13-R 5-CTAGTA GCCTCTGTAATCCTTTATGAGC-3，扩增产物在0. 8% g/v琼脂糖凝胶上进行电泳检测，均能检测出480bp的特异性片段，证实转基因猪的SIFITM3已成功整合到基因组中。
专利摘要
本发明公开了一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法，其步骤A、稳定表达sIFITM3基因的猪成纤维细胞系的构建a、pcDNACAsIITM3载体构建与线性化设计引物，提取猪的淋巴结组织RNA，进行RT-PCR扩增获得sIFITM3基因，乙醇沉淀，用灭菌水溶解；b、脂质体转染构建表达sIFITM3的猪成纤维细胞；c、转染sIFITM3基因的核供体细胞筛选及增殖；B、手工核移植方法获取重组囊胚a、受体细胞的准备；b、去核以及核供体细胞的注射；C、胚胎移植以及转基因猪的获取a、胚胎移植将培育好的囊胚移入代孕母猪的输卵管中，检测；b、转基因个体鉴定。方法易行，操作简便，该猪是表达猪源IFITM3的转基因猪，具有潜在的抗口蹄疫病毒，乙型脑炎病毒以及猪流感病毒等动物病毒的能力。
文档编号A61D19/04GKCN102391990SQ201110349688
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月8日
发明者李祥敏, 钱平, 陈焕春 申请人:华中农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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