构建中小片段rna测序文库的方法
专利名称:构建中小片段rna测序文库的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种构建中小片段RNA测序文库的方法。
背景技术：
核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。与DNA不同，RNA 一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了 A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA (转运RNA)，rRNA (核糖体RNA)，mRNA (信使RNA)。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列(即遗传密码子)的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
目前小片段RNA测序文库的制备方法，主要有两种:1.随机引物法，该方法将RNA用随机反转录成cDNA，然后合成双链的DNA，加上接头，从而完成文库的制备。该方法虽然简单，但是在文库制备的过程中，容易将小片段的RNA丢失；2.接头连接法，该方法是将在去磷酸化RNA的3’端加上RNA接头，对连接产物的5’端加上磷酸，加上5’端的RNA接头，反转录以及PCR扩增，从而完成文库的制备。该方法操作繁琐，而且必须保证RNA的5’端是磷酸基团，从而方便RNA接头的连接；该方法制备的文库受限于目前测序读长的局限，使得RNA的序列不能完全被测出。
公开号CN101377021A的发明，公开了一种构建cDNA文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括:(1)以总RNA(或者MRNA)为模板，利用引物通过反转录合成⑶NA第一条链。(2)利用这对引物通过TAQ DNA合成酶催化的PCR合成⑶NA第二条链。(3)将步 骤(2)得到的PCR产物通过DNA连接酶直接与T-载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到CDNA文库。但该方法容易将小片段的RNA丢失，导致测序不完整。
发明内容
本发明的目的在于克服随机引物法容易将小片段的RNA丢失以及接头连接法受限测序读长而使得RNA的序列不能完全被测出的问题，提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法，本方法将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种构建中小片段RNA测序文库的方法，所述的方法如下:[0008]样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小为50nt ^ M1 < 150nt,所述的大片段RNA的分子量M2的大小为150nt ^ M2 ^ 500nt ；
一、小片段cDNA的制备
(I)用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物；
(2)用14 RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量8(Tl80nt的RNA连接产物；
RNA接头的序列如下:
5-p-AGAUCGGAAGAGCGGUUCAGCAGGAAUGCCGAG-NHR-3 (SEQ ID N0.1 所示)；
(3)以步骤(2)得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA链；
反转录引物序列如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ ID N0.2 所示)；
(4)用RNase A消化步骤(3)得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段；
(5)用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤(4)纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ；
带有突出端的双链DNA接头序列信息如下:
正义链:5-p-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-NHR-3(SEQ ID N0.3 所示)；反义链:
5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.4 N0.7 所示)；
二、大片段cDNA的制备
A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA ；
带有6个随机碱基的接头为反转录引物的序列信息如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.8 N0.11 所示)；
B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA ;离心纯化使用Millipore公司YM-30离心超滤管；
C、用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ；
本步骤的带有突出端的双链DNA接头序列信息同步骤(5)带有突出端的双链DNA接头;
三、PCR扩增
将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR引物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。[0031]本发明中nt (Nucleotide)指代的是核苷酸的意思。
作为优选，所述的电泳分离使用的电泳介质为尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶。采用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高。
作为优选，尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中尿素的浓度为7 8mol/L。控制浓度使核酸的二级结构完全打开，有利于正确评估核酸的分子量大少。
作为优选，尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为6 10%。聚丙烯酰胺凝胶浓度适合本方法所分离核酸的分子量。
作为优选，步骤三中，PCR引物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
PCR前向引物:
5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ IDN0.12 所示)；
PCR反向引物:
5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQID N0.13 所示)。
本发明的有益效果是:将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
图1是本发明的技术路线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例:
本实施例中使用的英文缩写代表的具体含义如下:
TBE =Tris硼酸EDTA缓冲液，PAGE:聚丙烯酰胺凝胶，TEMED:N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，EtBr:溴化乙锭，CIAP:碱性磷酸酶，DMSO:二甲基亚砜，FS缓冲液:第一链合成缓冲液，DTT:二硫苏糖醇。
TRIzol:是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶；TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。
一、凝胶分离大片段RNA和小片段RNA
1.凝胶分离大片段RNA和小片段RNA
1.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
1.2 6%尿素变性PAGE制备
1.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
1.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用I X TBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔。
1.3样品准备
1.3.1从_80°C冰箱中取10微升总RNA样品(约10微克，总RNA样品来自线虫-Caenorhabditis elegans)放置到冰上融化,加入等量的2X上样缓冲液,在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
1.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
1.4割胶流程
1.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
1.4.2用干净的刀片割取胶片大于等于50nt小于150nt区域的小片段RNA和150-500 nt区域的大片段RNA，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0ml大管子中。
1.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm离心2分钟，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
1.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤RNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用8微升的无核酶水溶解RNA。
二、小片段cDNA的制备
1.小片段RNA去磷酸化
1.1在200微升的PCR管中依次加入以下去磷酸化反应试剂:8微升无核酶水；
2.0微升10 X CIAP缓冲液；8微升小片段RNA ；1.0微升RNA酶抑制剂；1.0微升CIAP (10U/ μ I)。
1.2热循环仪上37°C孵育60分钟
1.3 纯化
1.3.1在反应管中加入80微升无核酶水，使总体积达到100微升；
1.3.2加入83微升TRIzol和17微升氯仿；
1.3.3用手用力振荡反应管15秒,室温静置2分钟；
1.3.4 在 40CT 12000 rcf 离心 15 分钟；
1.3.5将水相液体转移到新的管子中；
1.3.6依次加入420微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/μ I糖原；
1.3.7混匀后-80°C静置30分钟；[0075]1.3.8 4°CT 14000 rpm 离心 25 分钟；
1.3.9小心地弃去上清液；
1.3.10用750毫升75%乙醇洗涤沉淀；
1.3.11 40CT 14000 rpm 离心 5 分钟；
1.3.12小心地弃去上清液；
1.3.13室温放置使乙醇挥发；
1.3.14加入6微升无核酶水溶解RNA。
2.3’端RNA接头连接
2.1在200微升PCR管中加入以下试剂:6微升CIAP处理的小片段RNA ;5微升3’ RNA接头(5 μ M);2微升10XRNA连接缓冲液；4微升DMSO ；1微升RNA酶抑制剂(40 U/μ I) ;2 微升 T4RNA 连接酶(10 U/μ I)。
2.2以上混合物在20°C下孵育6小时。
3.割胶回收
3.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
3.2 6%尿素变性PAGE制备
3.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
3.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
3.3样品准备
3.3.1在20微升连接好的RNA中加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
3.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
3.4割胶流程
3.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
3.4.2用干净的刀片割取胶片80-180 nt区域的小片段RNA片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
3.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱 30分钟。[0099]3.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤RNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用9微升的无核酶水溶解RNA。
4.反转录
4.1在200微升PCR管中加入以下反转录试剂:9微升已连接的小片段RNA ;1微升反转录引物(100 μΜ)ο
4.2 70°C孵育5分钟，取出立即置于冰上。
4.3在之前200微升PCR管中加入以下试剂:4微升5XFS缓冲液，2微升DTT(0.1 mol/L)，2 微升 dNTP (10 mM)，I 微升 RNA 酶抑制剂。
4.4 25 O 孵育 2 分钟。
4.5 加入 I 微升 super script III 反转录酶(200 U/ μ I)。
4.6在PCR仪上运行以下程序:50°C，60分钟；70°C，15分钟；4°C，保存。
5.RNA 酶 A 消化
5.1加入0.5微升RNA酶A至反转录产物。
5.2 37。。孵育 10 分钟。
6.割胶回收cDNA
6.1.电泳装置准 备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
6.2.6%尿素变性PAGE制备
6.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
6.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用I X TBE再次冲洗胶孔
6.3.样品准备
6.3.1 20微升RT产物加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
6.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
6.4.割胶流程
6.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
6.4.2用干净的刀片割取胶片80-180 nt区域的cDNA片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
6.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中洗脱cDNA，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置-80°C冰箱30分钟。
6.4.4预冷4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
7.连接
7.1在200微升PCR管中加入以下连接反应试剂:15微升纯化的cDNA;2微升5’DNA连接头(10 μΜ);2微升含有10 mM ATP的10ΧΤ4 DNA连接缓冲液；I微升T4连接酶(400 U/μ I)。
7.2 16°C孵育 6 小时。
8.纯化5’连接产物(即连接在cDNA 3’端的连接产物)
8.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
8.2 6%尿素变性PAGE制备
·[0133]8.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
8.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用I X TBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
8.3样品准备
8.3.1在20微升连接好的cDNA加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
8.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
8.4割胶流程
8.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
8.4.2用干净的刀片割取胶片110-210 nt区域的片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm 2分钟的离心，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
8.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
8.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
三、大片段cDNA的制备
1.反转录
1.1在200微升PCR管中加入以下反转录试剂:8微升大片段RNA ;2微升带有6个随机碱基的接头(10 μΜ)ο
1.2在70°C下孵育5分钟后迅速放置冰上。
1.3之后再加入以下反应试剂:4微升5XFS缓冲液；2微升DTT (0.1 M);2微升dNTP (10 mM) ;I 微升 RNA 酶抑制剂(40 U/μ I)。
1.4 25°C下孵育2分钟。
1.5 加入 I 微升 SuperScript III 反转录酶(200 U/ μ I)。
1.6在热循环仪上设定以下程序:25°C，10分钟；44°C，60分钟；70°C，15分钟；4°C，保存。
2.cDNA 纯化
2.1加入30微升无核酶水和8.75微升0.5M Na0H/50 mM EDTA停止反应。
2.2短暂的涡旋，然后离心收集产物。
2.3 65°C 下孵育 30 分钟。
2.4加入150微升无核酶水后将混合液转移到YM-30管中，13000 rpm离心12分钟。
2.5再加入150微升无核酶水到YM-30管中，13000 rpm离心6分钟，重复一次。
2.6加入5微升无核酶水到YM-30管中，将YM-30管倒置，10000 rpm离心2分钟。
2.7加入无核酶水至15微升。
3.连接
3.1在200微升PCR管中加入以下反应试剂:15微升纯化的cDNA ；2微升5’DNA/DNA连接头(10 μ M) ;2微升含有10 mM ATP的10 X T4 DNA连接缓冲液；I微升T4 DNA连接酶(400 U/μ I)。
3.2 16°C孵育 16 小时。
4.纯化5’连接产物(即连接在cDNA 3’端的连接产物)
4.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
4.2 6%尿素变性PAGE制备
4.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
4.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
4.3样品准备[0170]4.3.1在20微升连接好的cDNA加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
4.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
4.4割胶流程
4.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
4.4.2用干净的刀片割取胶片15(T560 nt区域的片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm 2分钟的离心，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
4.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
4.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
四、PCR扩增
1.PCR (小片段·cDNA和大片段cDNA分别扩增)
1.1在200微升PCR管中加入以下PCR反应试剂:5微升小片段cDNA或5微升大片段cDNA; 10微升5 X phu酶缓冲液；2微升PE PCR前向引物(25 μ M); 2微升PE PCR反向引物(25 μΜ);5微升dNTP (2.5 mM) ;0.5微升phu聚合酶(2 U/μ I) ;25.5微升无核酶水。phu全称phusion,是商标名称,是Finnzymes公司开发的一种高性能聚合酶。
1.2在热循环仪上设定以下程序:98°C，30秒；98°C，15秒；65°C，30秒；72°C，40秒；72°C，10分钟；4°C保存。第二到第四步重复40个循环。
2.用PCR Clean up试剂盒(Axygen)纯化PCR产物，并用25微升双蒸水洗脱。
3.扩增产物的混合
摩尔数计算公式:
摩尔数(mol)=文库质量(g)/(文库平均分子量(bp) X650 (g/mol/bp))；
其中，小片段cDNA扩增产物的文库平均分子量=(50+150)/2=100 bp;
大片段cDNA扩增产物的文库平均分子量=(150+500)/2=325 bp。
将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。
制备好的中小片段RNA文库送至illumina公司，利用GA II仪器进行大规模测序，测序结果使用blast软件基因组比对，比对结果通过velvet软件进行序列的拼接。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求
所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
权利要求
1.一种构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:所述的方法如下: 样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小为SOntSM1 < 150nt，所述的大片段RNA的分子量M2的大小为150nt < M2 < 500nt ； 一、小片段cDNA的制备 (1)用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物； (2)用14RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量8(Tl80nt的RNA连接产物；RNA接头的序列为SEQ ID N0.1 ； (3)以步骤(2)得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，反转录引物序列为SEQ ID N0.2，在反转录酶的作用下合成cDNA链； (4)用RNaseA消化步骤(3)得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段； (5)用T4DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤(4)纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ;双链DNA接头序列正义链为SEQ ID N0.3，反义链为SEQ ID N0.4 N0.7 ； 二、大片段cDNA的制备 A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，该反转录引物的序列为SEQ ID N0.8 N0.11，在反转录酶的作用下合成cDNA ；· B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA ； C、用T4DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ； 三、PCR扩增 将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR弓丨物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。
2.根据权利要求
1所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:所述的电泳分离使用的电泳介质为尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶。
3.根据权利要求
2所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中尿素的浓度为7 8mol/L。
4.根据权利要求
2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为6 10%。
5.根据权利要求
1或2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:步骤三中，PCR弓丨物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
专利摘要
本发明涉及分子生物学领域，目的在于提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法。本发明主要步骤为1、小片段cDNA的制备，2、大片段cDNA的制备，3、PCR扩增。本发明将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
文档编号C12Q1/68GKCN102534813 B发布类型授权 专利申请号CN 201110360084
公开日2013年9月4日 申请日期2011年11月15日
发明者周小川, 郎秋蕾, 徐根明, 吴鹏, 刘歆 申请人:杭州联川生物技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种构建中小片段RNA测序文库的方法。
背景技术：
核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。与DNA不同，RNA 一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了 A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA (转运RNA)，rRNA (核糖体RNA)，mRNA (信使RNA)。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列(即遗传密码子)的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
目前小片段RNA测序文库的制备方法，主要有两种:1.随机引物法，该方法将RNA用随机反转录成cDNA，然后合成双链的DNA，加上接头，从而完成文库的制备。该方法虽然简单，但是在文库制备的过程中，容易将小片段的RNA丢失；2.接头连接法，该方法是将在去磷酸化RNA的3’端加上RNA接头，对连接产物的5’端加上磷酸，加上5’端的RNA接头，反转录以及PCR扩增，从而完成文库的制备。该方法操作繁琐，而且必须保证RNA的5’端是磷酸基团，从而方便RNA接头的连接；该方法制备的文库受限于目前测序读长的局限，使得RNA的序列不能完全被测出。
公开号CN101377021A的发明，公开了一种构建cDNA文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括:(1)以总RNA(或者MRNA)为模板，利用引物通过反转录合成⑶NA第一条链。(2)利用这对引物通过TAQ DNA合成酶催化的PCR合成⑶NA第二条链。(3)将步 骤(2)得到的PCR产物通过DNA连接酶直接与T-载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到CDNA文库。但该方法容易将小片段的RNA丢失，导致测序不完整。
发明内容
本发明的目的在于克服随机引物法容易将小片段的RNA丢失以及接头连接法受限测序读长而使得RNA的序列不能完全被测出的问题，提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法，本方法将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种构建中小片段RNA测序文库的方法，所述的方法如下:[0008]样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小为50nt ^ M1 < 150nt,所述的大片段RNA的分子量M2的大小为150nt ^ M2 ^ 500nt ；
一、小片段cDNA的制备
(I)用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物；
(2)用14 RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量8(Tl80nt的RNA连接产物；
RNA接头的序列如下:
5-p-AGAUCGGAAGAGCGGUUCAGCAGGAAUGCCGAG-NHR-3 (SEQ ID N0.1 所示)；
(3)以步骤(2)得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA链；
反转录引物序列如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ ID N0.2 所示)；
(4)用RNase A消化步骤(3)得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段；
(5)用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤(4)纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ；
带有突出端的双链DNA接头序列信息如下:
正义链:5-p-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-NHR-3(SEQ ID N0.3 所示)；反义链:
5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.4 N0.7 所示)；
二、大片段cDNA的制备
A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA ；
带有6个随机碱基的接头为反转录引物的序列信息如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.8 N0.11 所示)；
B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA ;离心纯化使用Millipore公司YM-30离心超滤管；
C、用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ；
本步骤的带有突出端的双链DNA接头序列信息同步骤(5)带有突出端的双链DNA接头;
三、PCR扩增
将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR引物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。[0031]本发明中nt (Nucleotide)指代的是核苷酸的意思。
作为优选，所述的电泳分离使用的电泳介质为尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶。采用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高。
作为优选，尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中尿素的浓度为7 8mol/L。控制浓度使核酸的二级结构完全打开，有利于正确评估核酸的分子量大少。
作为优选，尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为6 10%。聚丙烯酰胺凝胶浓度适合本方法所分离核酸的分子量。
作为优选，步骤三中，PCR引物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
PCR前向引物:
5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ IDN0.12 所示)；
PCR反向引物:
5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQID N0.13 所示)。
本发明的有益效果是:将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
图1是本发明的技术路线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例:
本实施例中使用的英文缩写代表的具体含义如下:
TBE =Tris硼酸EDTA缓冲液，PAGE:聚丙烯酰胺凝胶，TEMED:N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，EtBr:溴化乙锭，CIAP:碱性磷酸酶，DMSO:二甲基亚砜，FS缓冲液:第一链合成缓冲液，DTT:二硫苏糖醇。
TRIzol:是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶；TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。
一、凝胶分离大片段RNA和小片段RNA
1.凝胶分离大片段RNA和小片段RNA
1.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
1.2 6%尿素变性PAGE制备
1.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
1.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用I X TBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔。
1.3样品准备
1.3.1从_80°C冰箱中取10微升总RNA样品(约10微克，总RNA样品来自线虫-Caenorhabditis elegans)放置到冰上融化,加入等量的2X上样缓冲液,在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
1.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
1.4割胶流程
1.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
1.4.2用干净的刀片割取胶片大于等于50nt小于150nt区域的小片段RNA和150-500 nt区域的大片段RNA，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0ml大管子中。
1.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm离心2分钟，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
1.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤RNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用8微升的无核酶水溶解RNA。
二、小片段cDNA的制备
1.小片段RNA去磷酸化
1.1在200微升的PCR管中依次加入以下去磷酸化反应试剂:8微升无核酶水；
2.0微升10 X CIAP缓冲液；8微升小片段RNA ；1.0微升RNA酶抑制剂；1.0微升CIAP (10U/ μ I)。
1.2热循环仪上37°C孵育60分钟
1.3 纯化
1.3.1在反应管中加入80微升无核酶水，使总体积达到100微升；
1.3.2加入83微升TRIzol和17微升氯仿；
1.3.3用手用力振荡反应管15秒,室温静置2分钟；
1.3.4 在 40CT 12000 rcf 离心 15 分钟；
1.3.5将水相液体转移到新的管子中；
1.3.6依次加入420微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/μ I糖原；
1.3.7混匀后-80°C静置30分钟；[0075]1.3.8 4°CT 14000 rpm 离心 25 分钟；
1.3.9小心地弃去上清液；
1.3.10用750毫升75%乙醇洗涤沉淀；
1.3.11 40CT 14000 rpm 离心 5 分钟；
1.3.12小心地弃去上清液；
1.3.13室温放置使乙醇挥发；
1.3.14加入6微升无核酶水溶解RNA。
2.3’端RNA接头连接
2.1在200微升PCR管中加入以下试剂:6微升CIAP处理的小片段RNA ;5微升3’ RNA接头(5 μ M);2微升10XRNA连接缓冲液；4微升DMSO ；1微升RNA酶抑制剂(40 U/μ I) ;2 微升 T4RNA 连接酶(10 U/μ I)。
2.2以上混合物在20°C下孵育6小时。
3.割胶回收
3.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
3.2 6%尿素变性PAGE制备
3.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
3.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
3.3样品准备
3.3.1在20微升连接好的RNA中加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
3.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
3.4割胶流程
3.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
3.4.2用干净的刀片割取胶片80-180 nt区域的小片段RNA片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
3.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱 30分钟。[0099]3.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤RNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用9微升的无核酶水溶解RNA。
4.反转录
4.1在200微升PCR管中加入以下反转录试剂:9微升已连接的小片段RNA ;1微升反转录引物(100 μΜ)ο
4.2 70°C孵育5分钟，取出立即置于冰上。
4.3在之前200微升PCR管中加入以下试剂:4微升5XFS缓冲液，2微升DTT(0.1 mol/L)，2 微升 dNTP (10 mM)，I 微升 RNA 酶抑制剂。
4.4 25 O 孵育 2 分钟。
4.5 加入 I 微升 super script III 反转录酶(200 U/ μ I)。
4.6在PCR仪上运行以下程序:50°C，60分钟；70°C，15分钟；4°C，保存。
5.RNA 酶 A 消化
5.1加入0.5微升RNA酶A至反转录产物。
5.2 37。。孵育 10 分钟。
6.割胶回收cDNA
6.1.电泳装置准 备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
6.2.6%尿素变性PAGE制备
6.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
6.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用I X TBE再次冲洗胶孔
6.3.样品准备
6.3.1 20微升RT产物加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
6.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
6.4.割胶流程
6.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
6.4.2用干净的刀片割取胶片80-180 nt区域的cDNA片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm离心2分钟，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
6.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中洗脱cDNA，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置-80°C冰箱30分钟。
6.4.4预冷4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
7.连接
7.1在200微升PCR管中加入以下连接反应试剂:15微升纯化的cDNA;2微升5’DNA连接头(10 μΜ);2微升含有10 mM ATP的10ΧΤ4 DNA连接缓冲液；I微升T4连接酶(400 U/μ I)。
7.2 16°C孵育 6 小时。
8.纯化5’连接产物(即连接在cDNA 3’端的连接产物)
8.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
8.2 6%尿素变性PAGE制备
·[0133]8.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
8.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用I X TBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
8.3样品准备
8.3.1在20微升连接好的cDNA加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
8.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
8.4割胶流程
8.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
8.4.2用干净的刀片割取胶片110-210 nt区域的片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm 2分钟的离心，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
8.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
8.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
三、大片段cDNA的制备
1.反转录
1.1在200微升PCR管中加入以下反转录试剂:8微升大片段RNA ;2微升带有6个随机碱基的接头(10 μΜ)ο
1.2在70°C下孵育5分钟后迅速放置冰上。
1.3之后再加入以下反应试剂:4微升5XFS缓冲液；2微升DTT (0.1 M);2微升dNTP (10 mM) ;I 微升 RNA 酶抑制剂(40 U/μ I)。
1.4 25°C下孵育2分钟。
1.5 加入 I 微升 SuperScript III 反转录酶(200 U/ μ I)。
1.6在热循环仪上设定以下程序:25°C，10分钟；44°C，60分钟；70°C，15分钟；4°C，保存。
2.cDNA 纯化
2.1加入30微升无核酶水和8.75微升0.5M Na0H/50 mM EDTA停止反应。
2.2短暂的涡旋，然后离心收集产物。
2.3 65°C 下孵育 30 分钟。
2.4加入150微升无核酶水后将混合液转移到YM-30管中，13000 rpm离心12分钟。
2.5再加入150微升无核酶水到YM-30管中，13000 rpm离心6分钟，重复一次。
2.6加入5微升无核酶水到YM-30管中，将YM-30管倒置，10000 rpm离心2分钟。
2.7加入无核酶水至15微升。
3.连接
3.1在200微升PCR管中加入以下反应试剂:15微升纯化的cDNA ；2微升5’DNA/DNA连接头(10 μ M) ;2微升含有10 mM ATP的10 X T4 DNA连接缓冲液；I微升T4 DNA连接酶(400 U/μ I)。
3.2 16°C孵育 16 小时。
4.纯化5’连接产物(即连接在cDNA 3’端的连接产物)
4.1电泳装置准备
制备凝胶的玻片用无菌水洗涤2次，然后晾干。
用无菌水配置电泳缓冲液(I XTBE )。
4.2 6%尿素变性PAGE制备
4.2.1在50 ml离心管中依次加入以下试剂:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的双蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%过硫酸铵溶液；7.5微升TEMED。迅速混匀，将液体倒入已经架好的配胶玻片中，插上10孔的梳子，让液体自身凝固15-30分钟。
4.2.2将梳子从6%的尿素变性胶中拔出，用IXTBE冲洗胶孔。200伏下预跑6%尿素变性胶15-30分钟，用IXTBE再次冲洗胶孔
4.3样品准备[0170]4.3.1在20微升连接好的cDNA加入等量的2 X上样缓冲液，在另外一个200微升洁净的PCR管中加入4微升RNA分子量指示剂。
4.3.2在样品上样前在65°C下变性5分钟，取出后冰浴2分钟，然后离心使样品甩到管底，随后可以将样品以及RNA分子量指示剂加入到不同的胶孔中。200伏下电泳30分钟。
4.4割胶流程
4.4.1电泳之后，将凝胶在I X TBE/EtBr染色液中染色3分钟。
4.4.2用干净的刀片割取胶片15(T560 nt区域的片段，然后将这些割下的胶片放到准备好的收集管中。收集管是由大小两个管子套在一起组成的，小管子是1.0 ml离心管，大管子为2.0 ml离心管，小管子底部事先扎好小孔。通过13000 rpm 2分钟的离心，将小管子中的胶片离碎并被甩到2.0 ml大管子中。
4.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后将管子在摇床上振荡过夜。将洗脱物和凝胶碎片转移到具有纤维素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分钟离心，把洗脱物从凝胶碎片中离心出。加入1400微升无水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混匀后放置_80°C冰箱30分钟。
4.4.4打开4°C离心机，4°C下13000 rpm离心25分钟。小心的将上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗涤cDNA沉淀。4°C下13000 rpm离心5分钟，小心的将上清倒掉，让剩余乙醇在空气中挥发，然后用15微升的无核酶水溶解cDNA。
四、PCR扩增
1.PCR (小片段·cDNA和大片段cDNA分别扩增)
1.1在200微升PCR管中加入以下PCR反应试剂:5微升小片段cDNA或5微升大片段cDNA; 10微升5 X phu酶缓冲液；2微升PE PCR前向引物(25 μ M); 2微升PE PCR反向引物(25 μΜ);5微升dNTP (2.5 mM) ;0.5微升phu聚合酶(2 U/μ I) ;25.5微升无核酶水。phu全称phusion,是商标名称,是Finnzymes公司开发的一种高性能聚合酶。
1.2在热循环仪上设定以下程序:98°C，30秒；98°C，15秒；65°C，30秒；72°C，40秒；72°C，10分钟；4°C保存。第二到第四步重复40个循环。
2.用PCR Clean up试剂盒(Axygen)纯化PCR产物，并用25微升双蒸水洗脱。
3.扩增产物的混合
摩尔数计算公式:
摩尔数(mol)=文库质量(g)/(文库平均分子量(bp) X650 (g/mol/bp))；
其中，小片段cDNA扩增产物的文库平均分子量=(50+150)/2=100 bp;
大片段cDNA扩增产物的文库平均分子量=(150+500)/2=325 bp。
将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。
制备好的中小片段RNA文库送至illumina公司，利用GA II仪器进行大规模测序，测序结果使用blast软件基因组比对，比对结果通过velvet软件进行序列的拼接。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求
所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
权利要求
1.一种构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:所述的方法如下: 样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小为SOntSM1 < 150nt，所述的大片段RNA的分子量M2的大小为150nt < M2 < 500nt ； 一、小片段cDNA的制备 (1)用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物； (2)用14RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量8(Tl80nt的RNA连接产物；RNA接头的序列为SEQ ID N0.1 ； (3)以步骤(2)得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，反转录引物序列为SEQ ID N0.2，在反转录酶的作用下合成cDNA链； (4)用RNaseA消化步骤(3)得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段； (5)用T4DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤(4)纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ;双链DNA接头序列正义链为SEQ ID N0.3，反义链为SEQ ID N0.4 N0.7 ； 二、大片段cDNA的制备 A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，该反转录引物的序列为SEQ ID N0.8 N0.11，在反转录酶的作用下合成cDNA ；· B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA ； C、用T4DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ； 三、PCR扩增 将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR弓丨物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。
2.根据权利要求
1所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:所述的电泳分离使用的电泳介质为尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶。
3.根据权利要求
2所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中尿素的浓度为7 8mol/L。
4.根据权利要求
2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为6 10%。
5.根据权利要求
1或2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于:步骤三中，PCR弓丨物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
专利摘要
本发明涉及分子生物学领域，目的在于提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法。本发明主要步骤为1、小片段cDNA的制备，2、大片段cDNA的制备，3、PCR扩增。本发明将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。
文档编号C12Q1/68GKCN102534813 B发布类型授权 专利申请号CN 201110360084
公开日2013年9月4日 申请日期2011年11月15日
发明者周小川, 郎秋蕾, 徐根明, 吴鹏, 刘歆 申请人:杭州联川生物技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),
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