一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌菌株及其应用的制作方法
专利名称:一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株去除有害污染物的微生物菌株，尤其涉及一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株,属于溴酸盐的微生物降解领域。
背景技术：
随着给水处理技术的发展和人们对饮用水水质的重视，臭氧氧化技术在饮用水中的应用日益广泛。臭氧对多数细菌、病毒、真菌及原虫、卵囊都具有明显的灭活效果，同时能够高效地去除水中的消毒副产物前驱物、嗅味物质等多种痕量有害污染物。然而臭氧化过程中产生的一些副产物，对饮用水安全性也造成一定的负面影响，如含溴原水臭氧化过程中会产生溴酸盐，具有致癌性，且难于被后续工艺所去除，在一定程度上限制了臭氧的进一步应用。
溴酸盐在自然条件下呈无色无味、挥发性小、不水解、热稳定等性质，因其具有DNA和染色体水平的遗传毒性，溴酸盐被国际癌症研究机构认定为2B级的潜在致癌物。美国国家环境保护局的研究表明:饮用水中溴酸盐的含量为μ g/L级都会有一定的致癌作用。摄入3 μ g/L的溴酸盐的致癌风险率为1(Γ5 ;摄入5 μ g/L的溴酸盐的致癌风险率为10'在国际上，世界卫生组织和美国环保局所规定的饮用水中，溴酸盐最高允许浓度在0.01mg/L以内，中国饮用水标准中的该项指标与国际标准一致。
针对饮用水臭氧化过程中出现的溴酸盐，国内外学者研究了很多去除方法，例如加氨、加过氧化氢、氧化-还原、半导体光催化、新型金属催化剂、离子交换膜等。上述方法虽然能在一定程度上去除溴酸盐，但是存在很多应用中的问题，如成本过高、引发二次污染等。膜处理方法对溴酸盐的去除效果较好，但成本很高，同时会产生一些含高浓度的溴酸盐的废水需要另外处理；活性炭吸附法对溴酸盐的除去也有较好效果，但是需要定期更换且费用较高，操作麻烦；采用低压，中压或高压汞灯紫外光虽然可适度分解溴酸盐，但其同时更强烈地把装瓶前预留的臭氧也分解了。对去除水中溴酸盐的研究较多，如公开号为CN101439900A的发明专利申请公开了一种氧化还原去除水中溴酸盐的方法及系统。该方法是:第一通过铵盐和活性炭上微生物的硝化作用控制水中的溶解氧浓度处于较低水平；第二通过硫酸亚铁的还原性去除水中的溴酸盐；第三通过过滤单元去除水中过量的铁离子。该去除溴酸盐的系统包括:控制水中溶解氧的预处理工作段、去除溴酸盐的氧化还原工作段和去除过量铁离子的过滤处理工作段，其中，所述预处理工作段与所述氧化还原工作段连接，所述氧化还原工作段与所述过滤处理工作段连接。虽然该方法对溴酸盐的去除率可达60%以上，但是该处理方法需控制溶氧，实际工艺中难于应用，同时工艺操作复杂，容易引发二次污染。
关于溴酸盐的生物降解方面的工作国内外进展较少。为此，从自然界中筛选出对溴酸盐有高效降解能力的菌株， 应用于水中溴酸盐的去除将有实际的应用价值。
发明内容
[0006]本发明针对现有技术存在的问题，本发明从自然界中筛选到一株鞘氨醇单胞菌，该鞘氨醇单胞菌菌株能够有效降解溴酸盐，去除饮用水臭氧化过程中出现的溴酸盐和被溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐，在饮用水处理方面具有良好的应用前景。
为实现上述目的,本发明一方面提供一株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y。
本发明所提供的鞘氨醇单胞菌菌株已于2011年3月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”;其微生物保藏号为CGMCC N0.4721 ;其分类命名为:Sphingomonas sp.815Y,保藏时间是2011年3月28日；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株从中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究组(北京海淀区双清路18号环境技术楼，邮编100085)臭氧生物活性炭小试装置的生物活性炭工艺段的炭中采用富集培养、平板稀释法分离、纯化得到。
其中，富集培养的培养基的组成如下:CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl2 0.3mg, FeCl2
0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO3 0.0lmg, CoCl2 0.005mg,溴酸盐 Img,乙酸钠 IOmg,蒸懼水
1,OOOmL, pH 7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
其中，分离纯化培养的培养基的组成如下:酵母提取物0.5g，胰蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4.7H20 0.05g,丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，pH 7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y具有以下特征:
1、鞘氨 醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y适宜在中性偏碱性(pH7_8)的培养介质中生长，适合的生长温度为15-35°C，其细菌学形态特征为:细胞呈杆状，大小为0.53 0.70 μ mX 1.06 1.67 μ m ;革兰氏染色阴性；不生芽孢，无鞭毛。
2、鞘氨醇单胞菌菌株在LB和营养肉汁琼脂平板上菌落形态一致，培养2天的菌落呈黄色，湿润，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘较为整齐。
3、16S rRNA基因序列特征为:菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y的16SrRNA序列长度为1466bp。
其中，按照如下步骤筛选菌种:
以中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究组处理饮用水的小试装置的臭氧生物活性炭工艺段的生物活性炭为样品，作为菌源进行富集培养。所述小试装置用于深度处理饮用水，包括依次进行的臭氧氧化工艺段和生物活性碳吸附工艺段两部分，其中的臭氧氧化工艺是利用臭氧作为高级氧化剂，将传统饮用水处理工艺中无法去除的难降解物质降解，将大分子有机物分解为小分子有机物；生物活性碳吸附工艺是以活性炭以及微生物对小分子物质进行吸附及分解，从而达到净化饮用水的目的。活性炭刚开始运行时碳表面并没有生物，随着运行时间的延长，水中及空气中的微生物会逐渐富集在生物活性碳上形成具有一定厚度的生物膜，成为稳定的生物活性碳。本发明采集是生物活性炭是在小试装置的生物活性碳吸附工艺段连续运行5个月后采集。
将所采集的生物活性炭样品与磷酸盐缓冲液混合，制成菌悬液；接着，将菌悬液离心后的离心液接种到富集培养基中进行富集培养；然后将富集培养物涂布于平板分离纯化培养基上反复进行平板涂布，进行分离纯化培养，直到分离得到对溴酸盐具有去除能力的鞘氨醇单胞菌属菌株。[0019]其中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH为7.2。
特别是，所述磷酸盐缓冲液的配制方法是:在800ml蒸馏水中加入8gNaCl，0.2gKCl，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，在121 °C下恒温灭菌20分钟后于室温保存，备用。
特别是，所述富集培养是黑暗条件，在温度为15-25°C，转速为150-200rpm的条件下，传代培养2-3次，传代培养时间为20-30天/次。
其中，所述分离纯化培养的培养条件为在黑暗条件下，温度为35°C，培养时间为2-3天/次。
本发明另一方面提供所述鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y在降解溴酸盐中的应用，包括:将所述鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y接种于含有溴酸盐的培养基中，进行振荡培养。
其中，所述含溴酸盐的培养基的组成如下:CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl20.3mg,FeCl2 0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO3 0.0lmg, CoCl2 0.005mg,溴酸盐 lmg,乙酸钠 IOmg,蒸懼水I, OOOmL, pH 7.0-8.0,培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
其中，所述震荡培养的培养温度为15_35°C，优选为25_35°C。
特别是，所述振荡培养是在以下条件下进行:黑暗条件，培养温度为25_35°C，转速为150-170rpm，震荡培养时间为15-25天。
特别是，所述 振荡培养条件为:黑暗条件，培养温度为25°C，转速150rpm，震荡培养时间为20天。
其中，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml培养基。
本发明又一方面提供所述鞘氨醇单胞菌株Sphingomonas sp.815Y在处理被溴酸盐污染的水中的应用，包括:向被溴酸盐污染的水中加入所述的鞘氨醇单胞菌菌株，混合均匀，培养15-25天。
其中，在所述培养过程是在黑暗条件下，培养温度为25_35°C，培养15-25天。
特别是，在培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌菌株的外加碳源。
其中，外加碳源的添加量为每升水中添加10_200mg乙酸钠。
特别是，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml水。
本发明再一方面提供所述的鞘氨醇单胞菌属菌株Sphingomonas sp.815Y在降解饮用水中溴酸盐的应用，包括:将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于含有溴酸盐的自来水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解自来水中的溴酸盐。
特别是，将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于自来水处理过称中含有应用臭氧氧化处理工艺步骤得到的饮用水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解饮用水中的溴酸盐。
其中，所述饮用水是在自来水厂制备饮用水的过程中，含有使用臭氧对进水进行氧化处理工艺，而制得的饮用水。
其中，鞘氨醇单胞菌在以下条件下进行培养:黑暗条件，培养温度为25_35°C，培养时间为15-25天。
特别是，培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌的外加碳源，其中外加碳源的添加量为每升饮用水中添加10-200mg。
特别是，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml饮用水。[0040]本发明的鞘氨醇单胞菌株(Sphingomonas sp.815Y)具有如下优点:
1、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株对溴酸盐的降解能力强，降解速度快，对于浓度为1000 μ g/L溴酸盐在短时间内的降解去除率达到50%以上；
2、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株用于处理饮用水经过臭氧消毒处理的水中，将臭氧氧化产生的副产物溴酸盐降解为溴离子，提高饮用水的安全性；
3、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株可投加于被溴酸盐污染的水中，降解去除溴酸盐，对溴酸盐污染的水进行生物修复，降低其的致癌毒性。
4、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株可投加于臭氧生物活性炭工艺单元，作为对溴酸盐进行生物修复的深度强化处理手段，方法简单，运行及维护成本较低，在规模化处理臭氧消毒副产物溴酸盐的处理中具有良好的应用前景。
图1为鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y在培养基上的菌落图；
图2为鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的细胞形态图；
图3为实施例3中鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y培养过程中培养基中溴酸盐和溴离子浓度变化图；
图4为实施例4中鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y培养过程中培养基中溴酸盐和溴离子浓度变化图；
图5为试验例I中处理被溴酸盐污染水中的溴酸盐试验；
图6为试验例2中处理被`溴酸盐污染水中的溴酸盐试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。
实施例1菌株的分离及纯化
1、培养基制备
(I)富集培养基:
CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl2 0.3mg, FeCl2 0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO30.0lmg,CoCl2 0.005mg，溴酸盐 lmg,乙酸钠 10mg，蒸馏水 I, OOOmL, pH 7.0-8.0，培养基在 121。。下恒温灭菌20分钟。
(2)分离、纯化培养基:
酵母提取物0.5g，胰蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉 0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4.7H20 0.05g,丙酮酸钠 0.3g，琼脂 15g，蒸馏水 I, OOOmL, pH7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
(3) LB固体培养基[0060]胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1，OOOmL，pH7.2。培养基使用前在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟。
2、磷酸缓冲液
磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH为7.2。
在800ml蒸馏水中加入8gNaCl，0.2KC1,1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节PH至7.2，加水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟后保存于室温，备用。
3、富集培养
中国科学院生态环境研究中心的环境水质国家重点实验室环境微生物技术研究组的臭氧-生物活性碳水处理装置，该处理装置首先对进水进行臭氧氧化处理，经过臭氧氧化处理的水含有较高浓度的溴酸盐，水流经活性炭，进行吸附和生物降解处理，其中，处理装置在常温(25°C )条件下连续运行6个月；臭氧投加量为2.5-3.0mg/L ;生物活性炭吸附柱的流速为7ml/min，生物活性碳柱总容积为450ml，进水的溴酸盐浓度为10-20 y g/L，有机物含量为2.5-3.0mg/L,出水的溴酸盐为0_5 u g/L。
称取采集于臭氧-生物活性碳水处理装置中的生物活性炭10g，加入磷酸盐缓冲液和小玻璃珠，150rpm下振荡处理4h，制得菌悬液，接着对菌悬液进行离心浓缩处理，然后取IOmL所得浓缩菌液，接种于含有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm,培养20天，获得第一代培养液；接着取第一代培养液IOml继续接种于装有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm,培养20天，获得第二代培养液；然后取第二代培养液IOml继续接种于装有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm，培 养20天，获得第三代富集培养液，即将经过离心浓缩处理获得的浓缩菌液传代培养2次，获得富集培养液。
3、分离、纯化培养
将第三代培养液(即富集培养液)稀释后于平板分离、纯化培养基上划线分离培养，放入恒温培养箱中于35°C下培养5天。挑取合适稀释度下的平板上形成的单个菌落，再次划线接种于平板分离、纯化培养基中，进行分离培养，于35°C下培养5天后对平板培养物进行显微镜检查，如果获得的培养物菌种不纯，则按上述方法挑取平板培养物划线接种于平板分离、纯化培养基中继续纯化，直到显微镜检查结果表明为纯菌为止；经纯化得到纯鞘氨醇单胞菌菌株。
实施例2鞘氨醇单胞菌菌株的微生物学特性研究
1、菌落形态观察
将分离、纯化培养得到的单胞菌株划线接种于LB固体培养基中，于35°C下培养至长出菌落，观察菌落形态，结果如下:
菌株的菌落特征为:在LB平板上培养2天的菌落直径大小约为l_2mm，菌落呈黄色，湿润，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘整齐。如图1所示。
2、细胞形态观察
挑取在LB平板上培养2天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸盐缓冲液(pH7.2)漂洗、梯度乙醇脱水、醋酸异戊酯处理以及二氧化碳临界点干燥、喷金、将样品放入观察室后进行电镜扫描，电镜扫描结果如图2，表明鞘氨醇单胞菌呈杆状，不生芽孢，无鞭毛，大小为 0.53 0.70 u mX 1.06 1.67 u m。
3、16S rRNA基因序列测定
将接种于LB培养基中的单胞菌于25°C，150rpm培养20天后的单胞菌细胞收集后米用DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN kit for soil,MP Biomedicals,France),提取单胞菌的DNA ;采用正向引物(27f引物，5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3')和反向引物(1492r引物，5' -TACGGYTACC TTGTTACGAC TT-3')对菌株的 16SrRNA 在 PCR 电泳仪上进行 PCR 扩增；将扩增产物采用纯化试剂盒(Fermantas,Gene JET Extraction Kit,EU)进行纯化,然后将纯化后的PCR产物采用TA-克隆方法(分子克隆手册)将成功转化后的大肠杆菌(T0P10化学感受态细胞)进行测序，将测序结果在NCBI基因文库(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)上进行比对。
测序结果见序列表，其中，菌株的16S rRNA(SEQ ID N0.1)序列长度为1466bp。
根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其16S rRNA基因序列的比对结果，鉴定菌株属于Sphingomonas sp.。
本发明中所提及的鞘氨醇单胞菌经鉴定，发现其菌株形态学和生理生化试验结果与 Sphingomonas koreensis 特征最为接近，Sphingomonas koreensis 为革兰氏阴性菌，具有单极鞭毛，运动性杆菌。菌落形态呈圆形，微凸面，表面光滑，不透明呈黄色。经过16SrRNA序列比对发现，两者的相似性为98%，因此本发明鞘氨醇单胞菌菌株不同于已有的鞘氨醇单胞菌，迄今为止未经报道。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株已于2011年3月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其菌株名称为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的保藏编号为CGMCC N0.4721。
实施例3
I)制备单胞菌株Sphingomonas sp.815Y的湿细胞
用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞。
2)去除溴酸盐试验
挑取菌种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞接种于富集培养基中，在黑暗条件下，于25°C进行培养，其中，每50mL富集培养基中接种0.2g湿细胞；培养液中的溴酸盐和溴离子含量按照国家标准GB/T 5750.10-2006(生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定，测定接种前培养基和接种后第9天、15天、20天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度值，测定结果如图3所示。
测定结果表明:本发明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐具有很好的去除能力，对溴酸盐的去除效率高，在接种量为0.2g湿细胞/50mL培养液时，在培养15天之内对溴酸盐的去除率达到40%以上。
实施例4
除了步骤2)中菌种Sphingomonas sp.815Y的接种量为每50mL富集培养基中接种0.3g湿细胞，测定接种前的培养液、接种后第7天、15天、25天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度之外，其余与实施例3相同，测定结果如图4所示。[0089]测定结果表明:本发明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐具有很好的去除能力，对溴酸盐的去除效率高，在接种量为0.3g湿细胞/50mL培养液时，在培养15天之后，对溴酸盐的去除率达到60%以上。
对照例I
除了将接种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的Sphingomonas sp.815Y立即灭活之外,得到无生物活性的对照组，其余与实施例3相同，测定接种前培养基和接种后第9天、15天、20天的相应培养液中溴酸盐和溴离子浓度，测定结果如图3所示。
测定结果是对照例I的培养液中的溴酸盐和溴离子浓度保持不变，对照测定结果表明:培养液中溴酸盐的降解是由鞘氨醇单胞菌引起的，而灭菌后的生物菌体对溴酸盐无吸附能力，因此，鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y能有效地去除溴酸盐,可用于溴酸盐的降解。
对照例2
除了将接种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的Sphingomonas sp.815Y立即灭活之外,得到无生物活性的对照组，其余与实施例4相同，测定接种前的培养液、接种后第7天、15天、25天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图4所示。
测定结果是对照例2的培养液中的溴酸盐和溴离子浓度保持不变，对照测定结果表明:培养液中溴酸盐的降解是由鞘氨醇单胞菌引起的，而灭菌后的生物菌体对溴酸盐无吸附能力，因此，鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y能有效地去除溴酸盐,可用于溴酸盐的降解。
试验例I去除溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐试验
`[0097]I)用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞，备用。
2)向饮用水中加入溴酸钠，将饮用水的溴酸盐浓度提升至约1100 U g/L，饮用水的pH为7.5 ;
3)将含溴酸盐的饮用水高压灭菌处理后向其中加入乙酸钠，乙酸钠的添加量为10mg/L,即每IL灭菌自来水中加入乙酸钠IOmg ；
4)取灭菌后的饮用水300ml置于500ml血清瓶中，接种鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,密封后在黑暗条件下,于温度25°C下静置培养，降解饮用水中的溴酸盐，接种量为0.3g湿细胞/IOOml ；
5)按照国家标准GB/T 5750.10-2006(生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定接种后第O、I天、4天、6天的饮用水中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图5所示。
测定结果显示:在接种菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y之后，鞘氨醇单胞菌从第二天开始降解溴酸盐，饮用水中的溴酸盐浓度迅速下降，降解产物溴离子浓度逐渐升高，接种6天后饮用水中的溴酸盐浓度浓度降低至起始浓度的50%以下，说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐的去除率达到50 %以上，表明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y降解溴酸盐效率高。试验例2去除溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐试验
I)用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞，备用。
2)向饮用水中加入溴酸钠，将饮用水的溴酸盐浓度提升至约1000 u g/L,饮用水的pH为7.5 ;
3)取灭菌后的饮用水300ml置于500ml血清瓶中，接种鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,密封后在黑暗条件下,于温度25°C下静置培养，降解饮用水中的溴酸盐，接种量为0.3g湿细胞/IOOml ；
4按照国家标准GB/T 5750.10-2006 (生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定接种后第0、1、2、3、5、6天的饮用水中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图6所示。
测定结果显示:在接种菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y之后,鞘氨醇单胞菌从接种第一天即开始降解溴酸盐，饮用水中的溴酸盐浓度迅速下降，降解产物溴离子浓度逐渐升高，接种6天后饮用水中的溴酸盐浓度浓度降低至起始浓度的70 %以下，说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐的去除率达到30 %以上,表明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y降解溴酸盐效率高；但是由于没有为单胞菌提供外加碳源(乙酸钠)，菌株对溴酸盐的 降解效率稍逊于添加了额外碳源的降解效果。
权利要求
1.一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株,其特征在于,其微生物保藏编号为CGMCC N0.4721。
2.如权利 要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在降解溴酸盐中的应用。
3.如权利要求
2所述的应用，其特征在于，将所述鞘氨醇单胞菌属菌株接种于含有溴酸盐的培养基中，进行鞘氨醇单胞菌培养。
4.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述的培养温度为15-35°C。
5.如权利要求
1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在处理被溴酸盐污染的水中的应用。
6.如权利要求
5所述的应用，其特征在于，向被溴酸盐污染的水中加入所述的鞘氨醇单胞菌菌株，混合均匀，培养15-25天。
7.如权利要求
1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在降解饮用水中溴酸盐的应用。
8.如权利要求
7所述的应用，其特征在于，将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于含有溴酸盐的自来水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解水中的溴酸盐。
9.如权利要求
8所述的应用，其特征在于所述培养温度为15-35°C。
10.如权利要求
6或8所述的应用，其特征在于，在培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌菌株的外加碳源；优选的，乙酸钠的添加量为每升水中添加10-200mg乙酸钠。
专利摘要
本发明公开了一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.815Y)菌株及其应用，其微生物保藏号是CGMCC No.4721。本发明鞘氨醇单胞菌属菌株从自然界中筛选得到，能够有效降解溴酸盐，降解效率高，可接种应用于生物活性炭工艺中，有效去除饮用水臭氧化过程中生成的溴酸盐和受污染饮用水中的溴酸盐，提高饮用水的安全性，在饮用水处理方面具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/20GKCN103103146SQ201110362285
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月15日
发明者杨敏, 刘娟, 于建伟, 王永京 申请人:中国科学院生态环境研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及一株去除有害污染物的微生物菌株，尤其涉及一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株,属于溴酸盐的微生物降解领域。
背景技术：
随着给水处理技术的发展和人们对饮用水水质的重视，臭氧氧化技术在饮用水中的应用日益广泛。臭氧对多数细菌、病毒、真菌及原虫、卵囊都具有明显的灭活效果，同时能够高效地去除水中的消毒副产物前驱物、嗅味物质等多种痕量有害污染物。然而臭氧化过程中产生的一些副产物，对饮用水安全性也造成一定的负面影响，如含溴原水臭氧化过程中会产生溴酸盐，具有致癌性，且难于被后续工艺所去除，在一定程度上限制了臭氧的进一步应用。
溴酸盐在自然条件下呈无色无味、挥发性小、不水解、热稳定等性质，因其具有DNA和染色体水平的遗传毒性，溴酸盐被国际癌症研究机构认定为2B级的潜在致癌物。美国国家环境保护局的研究表明:饮用水中溴酸盐的含量为μ g/L级都会有一定的致癌作用。摄入3 μ g/L的溴酸盐的致癌风险率为1(Γ5 ;摄入5 μ g/L的溴酸盐的致癌风险率为10'在国际上，世界卫生组织和美国环保局所规定的饮用水中，溴酸盐最高允许浓度在0.01mg/L以内，中国饮用水标准中的该项指标与国际标准一致。
针对饮用水臭氧化过程中出现的溴酸盐，国内外学者研究了很多去除方法，例如加氨、加过氧化氢、氧化-还原、半导体光催化、新型金属催化剂、离子交换膜等。上述方法虽然能在一定程度上去除溴酸盐，但是存在很多应用中的问题，如成本过高、引发二次污染等。膜处理方法对溴酸盐的去除效果较好，但成本很高，同时会产生一些含高浓度的溴酸盐的废水需要另外处理；活性炭吸附法对溴酸盐的除去也有较好效果，但是需要定期更换且费用较高，操作麻烦；采用低压，中压或高压汞灯紫外光虽然可适度分解溴酸盐，但其同时更强烈地把装瓶前预留的臭氧也分解了。对去除水中溴酸盐的研究较多，如公开号为CN101439900A的发明专利申请公开了一种氧化还原去除水中溴酸盐的方法及系统。该方法是:第一通过铵盐和活性炭上微生物的硝化作用控制水中的溶解氧浓度处于较低水平；第二通过硫酸亚铁的还原性去除水中的溴酸盐；第三通过过滤单元去除水中过量的铁离子。该去除溴酸盐的系统包括:控制水中溶解氧的预处理工作段、去除溴酸盐的氧化还原工作段和去除过量铁离子的过滤处理工作段，其中，所述预处理工作段与所述氧化还原工作段连接，所述氧化还原工作段与所述过滤处理工作段连接。虽然该方法对溴酸盐的去除率可达60%以上，但是该处理方法需控制溶氧，实际工艺中难于应用，同时工艺操作复杂，容易引发二次污染。
关于溴酸盐的生物降解方面的工作国内外进展较少。为此，从自然界中筛选出对溴酸盐有高效降解能力的菌株， 应用于水中溴酸盐的去除将有实际的应用价值。
发明内容
[0006]本发明针对现有技术存在的问题，本发明从自然界中筛选到一株鞘氨醇单胞菌，该鞘氨醇单胞菌菌株能够有效降解溴酸盐，去除饮用水臭氧化过程中出现的溴酸盐和被溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐，在饮用水处理方面具有良好的应用前景。
为实现上述目的,本发明一方面提供一株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y。
本发明所提供的鞘氨醇单胞菌菌株已于2011年3月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”;其微生物保藏号为CGMCC N0.4721 ;其分类命名为:Sphingomonas sp.815Y,保藏时间是2011年3月28日；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株从中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究组(北京海淀区双清路18号环境技术楼，邮编100085)臭氧生物活性炭小试装置的生物活性炭工艺段的炭中采用富集培养、平板稀释法分离、纯化得到。
其中，富集培养的培养基的组成如下:CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl2 0.3mg, FeCl2
0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO3 0.0lmg, CoCl2 0.005mg,溴酸盐 Img,乙酸钠 IOmg,蒸懼水
1,OOOmL, pH 7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
其中，分离纯化培养的培养基的组成如下:酵母提取物0.5g，胰蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4.7H20 0.05g,丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，pH 7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y具有以下特征:
1、鞘氨 醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y适宜在中性偏碱性(pH7_8)的培养介质中生长，适合的生长温度为15-35°C，其细菌学形态特征为:细胞呈杆状，大小为0.53 0.70 μ mX 1.06 1.67 μ m ;革兰氏染色阴性；不生芽孢，无鞭毛。
2、鞘氨醇单胞菌菌株在LB和营养肉汁琼脂平板上菌落形态一致，培养2天的菌落呈黄色，湿润，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘较为整齐。
3、16S rRNA基因序列特征为:菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y的16SrRNA序列长度为1466bp。
其中，按照如下步骤筛选菌种:
以中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究组处理饮用水的小试装置的臭氧生物活性炭工艺段的生物活性炭为样品，作为菌源进行富集培养。所述小试装置用于深度处理饮用水，包括依次进行的臭氧氧化工艺段和生物活性碳吸附工艺段两部分，其中的臭氧氧化工艺是利用臭氧作为高级氧化剂，将传统饮用水处理工艺中无法去除的难降解物质降解，将大分子有机物分解为小分子有机物；生物活性碳吸附工艺是以活性炭以及微生物对小分子物质进行吸附及分解，从而达到净化饮用水的目的。活性炭刚开始运行时碳表面并没有生物，随着运行时间的延长，水中及空气中的微生物会逐渐富集在生物活性碳上形成具有一定厚度的生物膜，成为稳定的生物活性碳。本发明采集是生物活性炭是在小试装置的生物活性碳吸附工艺段连续运行5个月后采集。
将所采集的生物活性炭样品与磷酸盐缓冲液混合，制成菌悬液；接着，将菌悬液离心后的离心液接种到富集培养基中进行富集培养；然后将富集培养物涂布于平板分离纯化培养基上反复进行平板涂布，进行分离纯化培养，直到分离得到对溴酸盐具有去除能力的鞘氨醇单胞菌属菌株。[0019]其中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH为7.2。
特别是，所述磷酸盐缓冲液的配制方法是:在800ml蒸馏水中加入8gNaCl，0.2gKCl，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L，在121 °C下恒温灭菌20分钟后于室温保存，备用。
特别是，所述富集培养是黑暗条件，在温度为15-25°C，转速为150-200rpm的条件下，传代培养2-3次，传代培养时间为20-30天/次。
其中，所述分离纯化培养的培养条件为在黑暗条件下，温度为35°C，培养时间为2-3天/次。
本发明另一方面提供所述鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y在降解溴酸盐中的应用，包括:将所述鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y接种于含有溴酸盐的培养基中，进行振荡培养。
其中，所述含溴酸盐的培养基的组成如下:CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl20.3mg,FeCl2 0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO3 0.0lmg, CoCl2 0.005mg,溴酸盐 lmg,乙酸钠 IOmg,蒸懼水I, OOOmL, pH 7.0-8.0,培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
其中，所述震荡培养的培养温度为15_35°C，优选为25_35°C。
特别是，所述振荡培养是在以下条件下进行:黑暗条件，培养温度为25_35°C，转速为150-170rpm，震荡培养时间为15-25天。
特别是，所述 振荡培养条件为:黑暗条件，培养温度为25°C，转速150rpm，震荡培养时间为20天。
其中，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml培养基。
本发明又一方面提供所述鞘氨醇单胞菌株Sphingomonas sp.815Y在处理被溴酸盐污染的水中的应用，包括:向被溴酸盐污染的水中加入所述的鞘氨醇单胞菌菌株，混合均匀，培养15-25天。
其中，在所述培养过程是在黑暗条件下，培养温度为25_35°C，培养15-25天。
特别是，在培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌菌株的外加碳源。
其中，外加碳源的添加量为每升水中添加10_200mg乙酸钠。
特别是，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml水。
本发明再一方面提供所述的鞘氨醇单胞菌属菌株Sphingomonas sp.815Y在降解饮用水中溴酸盐的应用，包括:将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于含有溴酸盐的自来水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解自来水中的溴酸盐。
特别是，将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于自来水处理过称中含有应用臭氧氧化处理工艺步骤得到的饮用水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解饮用水中的溴酸盐。
其中，所述饮用水是在自来水厂制备饮用水的过程中，含有使用臭氧对进水进行氧化处理工艺，而制得的饮用水。
其中，鞘氨醇单胞菌在以下条件下进行培养:黑暗条件，培养温度为25_35°C，培养时间为15-25天。
特别是，培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌的外加碳源，其中外加碳源的添加量为每升饮用水中添加10-200mg。
特别是，所述鞘氨醇单胞菌株的接种量为0.2-0.3g湿细胞/50ml饮用水。[0040]本发明的鞘氨醇单胞菌株(Sphingomonas sp.815Y)具有如下优点:
1、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株对溴酸盐的降解能力强，降解速度快，对于浓度为1000 μ g/L溴酸盐在短时间内的降解去除率达到50%以上；
2、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株用于处理饮用水经过臭氧消毒处理的水中，将臭氧氧化产生的副产物溴酸盐降解为溴离子，提高饮用水的安全性；
3、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株可投加于被溴酸盐污染的水中，降解去除溴酸盐，对溴酸盐污染的水进行生物修复，降低其的致癌毒性。
4、本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株可投加于臭氧生物活性炭工艺单元，作为对溴酸盐进行生物修复的深度强化处理手段，方法简单，运行及维护成本较低，在规模化处理臭氧消毒副产物溴酸盐的处理中具有良好的应用前景。
图1为鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y在培养基上的菌落图；
图2为鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的细胞形态图；
图3为实施例3中鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y培养过程中培养基中溴酸盐和溴离子浓度变化图；
图4为实施例4中鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y培养过程中培养基中溴酸盐和溴离子浓度变化图；
图5为试验例I中处理被溴酸盐污染水中的溴酸盐试验；
图6为试验例2中处理被`溴酸盐污染水中的溴酸盐试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。
实施例1菌株的分离及纯化
1、培养基制备
(I)富集培养基:
CaCl2 5mg, MgCl2 5mg, MnCl2 0.3mg, FeCl2 0.3mg, ZnCl2 0.0lmg, H3BO30.0lmg,CoCl2 0.005mg，溴酸盐 lmg,乙酸钠 10mg，蒸馏水 I, OOOmL, pH 7.0-8.0，培养基在 121。。下恒温灭菌20分钟。
(2)分离、纯化培养基:
酵母提取物0.5g，胰蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉 0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4.7H20 0.05g,丙酮酸钠 0.3g，琼脂 15g，蒸馏水 I, OOOmL, pH7.0-8.0，培养基在121°C下恒温灭菌20分钟。
(3) LB固体培养基[0060]胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水1，OOOmL，pH7.2。培养基使用前在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟。
2、磷酸缓冲液
磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的混合溶液，pH为7.2。
在800ml蒸馏水中加入8gNaCl，0.2KC1,1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节PH至7.2，加水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟后保存于室温，备用。
3、富集培养
中国科学院生态环境研究中心的环境水质国家重点实验室环境微生物技术研究组的臭氧-生物活性碳水处理装置，该处理装置首先对进水进行臭氧氧化处理，经过臭氧氧化处理的水含有较高浓度的溴酸盐，水流经活性炭，进行吸附和生物降解处理，其中，处理装置在常温(25°C )条件下连续运行6个月；臭氧投加量为2.5-3.0mg/L ;生物活性炭吸附柱的流速为7ml/min，生物活性碳柱总容积为450ml，进水的溴酸盐浓度为10-20 y g/L，有机物含量为2.5-3.0mg/L,出水的溴酸盐为0_5 u g/L。
称取采集于臭氧-生物活性碳水处理装置中的生物活性炭10g，加入磷酸盐缓冲液和小玻璃珠，150rpm下振荡处理4h，制得菌悬液，接着对菌悬液进行离心浓缩处理，然后取IOmL所得浓缩菌液，接种于含有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm,培养20天，获得第一代培养液；接着取第一代培养液IOml继续接种于装有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm,培养20天，获得第二代培养液；然后取第二代培养液IOml继续接种于装有300mL富集培养基的血清瓶中，在黑暗条件下，于25°C、150rpm，培 养20天，获得第三代富集培养液，即将经过离心浓缩处理获得的浓缩菌液传代培养2次，获得富集培养液。
3、分离、纯化培养
将第三代培养液(即富集培养液)稀释后于平板分离、纯化培养基上划线分离培养，放入恒温培养箱中于35°C下培养5天。挑取合适稀释度下的平板上形成的单个菌落，再次划线接种于平板分离、纯化培养基中，进行分离培养，于35°C下培养5天后对平板培养物进行显微镜检查，如果获得的培养物菌种不纯，则按上述方法挑取平板培养物划线接种于平板分离、纯化培养基中继续纯化，直到显微镜检查结果表明为纯菌为止；经纯化得到纯鞘氨醇单胞菌菌株。
实施例2鞘氨醇单胞菌菌株的微生物学特性研究
1、菌落形态观察
将分离、纯化培养得到的单胞菌株划线接种于LB固体培养基中，于35°C下培养至长出菌落，观察菌落形态，结果如下:
菌株的菌落特征为:在LB平板上培养2天的菌落直径大小约为l_2mm，菌落呈黄色，湿润，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘整齐。如图1所示。
2、细胞形态观察
挑取在LB平板上培养2天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸盐缓冲液(pH7.2)漂洗、梯度乙醇脱水、醋酸异戊酯处理以及二氧化碳临界点干燥、喷金、将样品放入观察室后进行电镜扫描，电镜扫描结果如图2，表明鞘氨醇单胞菌呈杆状，不生芽孢，无鞭毛，大小为 0.53 0.70 u mX 1.06 1.67 u m。
3、16S rRNA基因序列测定
将接种于LB培养基中的单胞菌于25°C，150rpm培养20天后的单胞菌细胞收集后米用DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN kit for soil,MP Biomedicals,France),提取单胞菌的DNA ;采用正向引物(27f引物，5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3')和反向引物(1492r引物，5' -TACGGYTACC TTGTTACGAC TT-3')对菌株的 16SrRNA 在 PCR 电泳仪上进行 PCR 扩增；将扩增产物采用纯化试剂盒(Fermantas,Gene JET Extraction Kit,EU)进行纯化,然后将纯化后的PCR产物采用TA-克隆方法(分子克隆手册)将成功转化后的大肠杆菌(T0P10化学感受态细胞)进行测序，将测序结果在NCBI基因文库(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)上进行比对。
测序结果见序列表，其中，菌株的16S rRNA(SEQ ID N0.1)序列长度为1466bp。
根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其16S rRNA基因序列的比对结果，鉴定菌株属于Sphingomonas sp.。
本发明中所提及的鞘氨醇单胞菌经鉴定，发现其菌株形态学和生理生化试验结果与 Sphingomonas koreensis 特征最为接近，Sphingomonas koreensis 为革兰氏阴性菌，具有单极鞭毛，运动性杆菌。菌落形态呈圆形，微凸面，表面光滑，不透明呈黄色。经过16SrRNA序列比对发现，两者的相似性为98%，因此本发明鞘氨醇单胞菌菌株不同于已有的鞘氨醇单胞菌，迄今为止未经报道。
本发明鞘氨醇单胞菌菌株已于2011年3月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其菌株名称为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的保藏编号为CGMCC N0.4721。
实施例3
I)制备单胞菌株Sphingomonas sp.815Y的湿细胞
用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞。
2)去除溴酸盐试验
挑取菌种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞接种于富集培养基中，在黑暗条件下，于25°C进行培养，其中，每50mL富集培养基中接种0.2g湿细胞；培养液中的溴酸盐和溴离子含量按照国家标准GB/T 5750.10-2006(生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定，测定接种前培养基和接种后第9天、15天、20天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度值，测定结果如图3所示。
测定结果表明:本发明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐具有很好的去除能力，对溴酸盐的去除效率高，在接种量为0.2g湿细胞/50mL培养液时，在培养15天之内对溴酸盐的去除率达到40%以上。
实施例4
除了步骤2)中菌种Sphingomonas sp.815Y的接种量为每50mL富集培养基中接种0.3g湿细胞，测定接种前的培养液、接种后第7天、15天、25天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度之外，其余与实施例3相同，测定结果如图4所示。[0089]测定结果表明:本发明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐具有很好的去除能力，对溴酸盐的去除效率高，在接种量为0.3g湿细胞/50mL培养液时，在培养15天之后，对溴酸盐的去除率达到60%以上。
对照例I
除了将接种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的Sphingomonas sp.815Y立即灭活之外,得到无生物活性的对照组，其余与实施例3相同，测定接种前培养基和接种后第9天、15天、20天的相应培养液中溴酸盐和溴离子浓度，测定结果如图3所示。
测定结果是对照例I的培养液中的溴酸盐和溴离子浓度保持不变，对照测定结果表明:培养液中溴酸盐的降解是由鞘氨醇单胞菌引起的，而灭菌后的生物菌体对溴酸盐无吸附能力，因此，鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y能有效地去除溴酸盐,可用于溴酸盐的降解。
对照例2
除了将接种Sphingomonas sp.815Y的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在15psi高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的Sphingomonas sp.815Y立即灭活之外,得到无生物活性的对照组，其余与实施例4相同，测定接种前的培养液、接种后第7天、15天、25天的培养液中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图4所示。
测定结果是对照例2的培养液中的溴酸盐和溴离子浓度保持不变，对照测定结果表明:培养液中溴酸盐的降解是由鞘氨醇单胞菌引起的，而灭菌后的生物菌体对溴酸盐无吸附能力，因此，鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y能有效地去除溴酸盐,可用于溴酸盐的降解。
试验例I去除溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐试验
`[0097]I)用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞，备用。
2)向饮用水中加入溴酸钠，将饮用水的溴酸盐浓度提升至约1100 U g/L，饮用水的pH为7.5 ;
3)将含溴酸盐的饮用水高压灭菌处理后向其中加入乙酸钠，乙酸钠的添加量为10mg/L,即每IL灭菌自来水中加入乙酸钠IOmg ；
4)取灭菌后的饮用水300ml置于500ml血清瓶中，接种鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,密封后在黑暗条件下,于温度25°C下静置培养，降解饮用水中的溴酸盐，接种量为0.3g湿细胞/IOOml ；
5)按照国家标准GB/T 5750.10-2006(生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定接种后第O、I天、4天、6天的饮用水中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图5所示。
测定结果显示:在接种菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y之后，鞘氨醇单胞菌从第二天开始降解溴酸盐，饮用水中的溴酸盐浓度迅速下降，降解产物溴离子浓度逐渐升高，接种6天后饮用水中的溴酸盐浓度浓度降低至起始浓度的50%以下，说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐的去除率达到50 %以上，表明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y降解溴酸盐效率高。试验例2去除溴酸盐污染的饮用水中的溴酸盐试验
I)用接种环取鞘氨醇单胞菌菌株Sphingomonas sp.815Y的新鲜斜面菌种,划线接种于LB固体培养基上，35°C下，培养2天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得新鲜鞘氨醇单胞菌湿细胞，备用。
2)向饮用水中加入溴酸钠，将饮用水的溴酸盐浓度提升至约1000 u g/L,饮用水的pH为7.5 ;
3)取灭菌后的饮用水300ml置于500ml血清瓶中，接种鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y,密封后在黑暗条件下,于温度25°C下静置培养，降解饮用水中的溴酸盐，接种量为0.3g湿细胞/IOOml ；
4按照国家标准GB/T 5750.10-2006 (生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标)的方法采用离子色谱法测定接种后第0、1、2、3、5、6天的饮用水中溴酸盐和溴离子的浓度，测定结果如图6所示。
测定结果显示:在接种菌株鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y之后,鞘氨醇单胞菌从接种第一天即开始降解溴酸盐，饮用水中的溴酸盐浓度迅速下降，降解产物溴离子浓度逐渐升高，接种6天后饮用水中的溴酸盐浓度浓度降低至起始浓度的70 %以下，说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y对溴酸盐的去除率达到30 %以上,表明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.815Y降解溴酸盐效率高；但是由于没有为单胞菌提供外加碳源(乙酸钠)，菌株对溴酸盐的 降解效率稍逊于添加了额外碳源的降解效果。
权利要求
1.一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)菌株,其特征在于,其微生物保藏编号为CGMCC N0.4721。
2.如权利 要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在降解溴酸盐中的应用。
3.如权利要求
2所述的应用，其特征在于，将所述鞘氨醇单胞菌属菌株接种于含有溴酸盐的培养基中，进行鞘氨醇单胞菌培养。
4.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述的培养温度为15-35°C。
5.如权利要求
1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在处理被溴酸盐污染的水中的应用。
6.如权利要求
5所述的应用，其特征在于，向被溴酸盐污染的水中加入所述的鞘氨醇单胞菌菌株，混合均匀，培养15-25天。
7.如权利要求
1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在降解饮用水中溴酸盐的应用。
8.如权利要求
7所述的应用，其特征在于，将所述鞘氨醇单胞菌菌株接种于含有溴酸盐的自来水中，进行鞘氨醇单胞菌培养，降解水中的溴酸盐。
9.如权利要求
8所述的应用，其特征在于所述培养温度为15-35°C。
10.如权利要求
6或8所述的应用，其特征在于，在培养过程中添加乙酸钠作为鞘氨醇单胞菌菌株的外加碳源；优选的，乙酸钠的添加量为每升水中添加10-200mg乙酸钠。
专利摘要
本发明公开了一株降解溴酸盐的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.815Y)菌株及其应用，其微生物保藏号是CGMCC No.4721。本发明鞘氨醇单胞菌属菌株从自然界中筛选得到，能够有效降解溴酸盐，降解效率高，可接种应用于生物活性炭工艺中，有效去除饮用水臭氧化过程中生成的溴酸盐和受污染饮用水中的溴酸盐，提高饮用水的安全性，在饮用水处理方面具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/20GKCN103103146SQ201110362285
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月15日
发明者杨敏, 刘娟, 于建伟, 王永京 申请人:中国科学院生态环境研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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