配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法
专利名称:配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法
技术领域：
:
本发明属于藻类繁殖技术，具体地涉及一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法。
背景技术：
:
巨藻被认为是进行海底植被恢复的首选大型藻类。巨藻由于体积庞大，生长速度极快，特别适合作为人工鱼 礁的“配套藻林”来改善近海生态环境，我国原无巨藻分布，1978年中国水产科学研究院黄海水产研究所采用低温水运的方法从墨西哥成功地引进了一种巨藻(Macrocystis pyrifera)幼藻和配子体。研究人员通过对巨藻养殖生物学研究,结合我国海况条件的特点，建立了巨藻人工育苗和养殖技术体系，夏苗培育达到一定的数量，建立了筏式养殖技术。然而，受苗种繁育技术的限制，一些苗种培育过程中的关键性的问题没有有效的解决，因而不能获得足量优质的苗种。王广策等发明了“用配子体克隆法繁育能源海藻-巨藻孢子体的方法”(专利申请号:200510046473.6,公开号:1865433)，该发明通过把配子体粉碎后对粉碎液进行培育并进一步扩繁获得大量雌雄配子体，雌雄配子体混合受精培养两周后获得巨藻孢子体，尽管该发明文本中记载在两周后有85-90%的配子体发育成孢子体，但在实际培养过程中，雌雄配子体混合受精后3-10周内将有大量孢子体死亡，10周以后巨藻孢子体基本稳定，养殖海区温度适宜即可下海养殖，该发明的技术方案没有公开3-10周的培养条件，并且该发明的技术方案通过对配子体粉碎后进行扩繁配子体，粉碎液中含有破碎细胞等及其它杂质影响扩繁的配子体质量，尽管通过进一步扩繁，但是最后能够获得的优质孢子体数量有限，不能满足大规模养殖的需要。
发明内容
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本发明要解决的技术问题是提供一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，以解决优质巨藻幼苗不足，不能够满足养殖需要的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步骤:
(I)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆，分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁；
(2)受精当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，将形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受:精；
(3)巨藻孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3 (1.8-2.4) X10^4mol / L，KH2PO4(1.8-2.4) Xl(T5mol / L，受精后 5-10 周营养盐为 KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L, KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周温度控制在8-11 °C，受精后5-10周温度控制在17-19。。;光照强度为:受精后1-2周10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ E m、-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
进一步，所述的步骤I对克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为20-40 μ E HT2s-1,营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L, KH2PO4L 2 X 10_5mol / L。
进一步，所述的步骤I扩繁过程中的温度在10-15°c，照强度为20-40 μ E πΓ2^，营养盐为=KNO3 (1.2-1.8) ΧΙΟΛιοΙ / L，KH2PO4 (1.2-1.8) X l(T5mol / L，每周更换一次。
进一步，所述的巨藻孢子体培育过程中，受精后1-4周营养盐每周更换一次，受精后5-10周营养盐每周更换两次。
本发明与现有技术相比的有益效果:
(I)制种所用时间短。受精过程及温度和光照的控制通过人工操作而实现，大大缩短了苗种生长的周期，提高了苗种的质量和产量。受精后经过4周培养即可生成巨藻孢子体，10周后即可达到出苗规格。
(2)制种费用低廉。制种过程中所需的海水只需要煮沸消毒即可，营养盐纯度采用分析纯规格，利用低温展示柜来控制温度，通过增减白炽灯管的数量来控制光照强度。步骤操作简单可行，培养费用低廉。
(3)制种过程采用毛细管分离单细胞技术，通过克隆无性繁殖技术获得质量较高的配子体，在后续的扩培中能得到大量的雌雄配子体，产苗量大，苗种质量高。克隆出的巨藻小孢子体可达每厘米棕绳10-16棵，完全符合正常育苗密度。
(4)制种过程不受种苗和环境条件的制约。利用克隆无性繁殖技术对雌雄配子体进行扩增，制种过程无需大量的野生藻株，通过实验室人工条件控制环境，过程不受种苗和环境条件的制约。
(5)生态意义重大。制种过程无须大量野生巨藻，即保护了野生巨藻的种质资源，又可以在近海产出大量海底森林，对近海生态的修复和维护起到重要的作用。
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图1巨藻的雌雄配子体团:A早为克隆培养的雌配子体团；B ^为克隆培养的雄配子体团。
图2.雌雄配子的受精过程以及孢子体的前期发育:A，排放卵细胞；B，精卵细胞受精；C，受精后细胞拉长；D细胞横向与纵向分裂；E形成的孢子体。
图310周后的巨藻孢子体。
具体实施方式
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下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的解释。
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步骤:
(I)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆，分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁；克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为ZO-^yEnT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L ;在扩繁过程中的最佳环境条件为:温度保持在10-15°C，光照强度为20-40 μ E IrT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2-1.8X ΙΟΛιοΙ / L, KH2PO4L 2_1.8 X l(T5mol / L ；
(2)受精雌雄配子体扩繁到一定量时，将形成的配子体团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精；
(3)巨藻孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3L 8-2.4 X10^4moI / L，KH2PO4L 8-2.4Xl(T5mol / L，每周更换一次；5-10 周 KN032.8-3.2 X 10_4mol / L,KH2P042.8-3.2X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1_4周温度控制在8_11°C，5_10周温度控制在17-19。。;光照强度为:受精后1-2周，10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ EHT2S-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E nT2s'
实施例1
本实验的进行时间为2011年6月到2011年11月号。巨藻品种为MacrocystisPyrifera,6月份开始克隆繁殖雌雄配子体。
(I)克隆与扩繁当巨藻的游孢子发育到配子体阶段时，在倒置显微镜下(显微镜为Nikon T1-U，倍数为100倍)，利用毛细管分离技术将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，将分离的细胞分别放入加入营养盐的IOOml无菌海水中进行培养，操作时温度和培养温度保持在8°C，光照强度为20-40 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L。雌雄细胞发育成雌雄配子体后继续扩繁。在扩繁增殖过程中的环境条件为:温度保持在10°C，光照强度为20-40 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L，每周更换一次;
(2)受精雌雄配子体分别扩繁增殖20天后，当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，把雌雄配子体增殖形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合于1000毫升烧杯中培育，烧杯内置棕绳制盘状苗帘，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精，受精后附着在苗帘上；
(3)巨藻孢子体培育将受精后的合子在棕绳附着基上进行培养，培养过程中加入营养盐，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3L 8X10_4mol / L，KH2PO4L 8 X 10_5mol / L，每周更换一次；5-10周营养盐为在灭菌的海水中ΚΝ032.8X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ042.8 X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1-4周温度控制在8°C，5-10周温度控制在17°C ;光照强度为:受精后1-2周10 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周20 μ E IrT2S-1 ;受精后5-10周40 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻孢子体,长约1.5cm。
实施例2
本实验的进行时间为2011年7月到2011年12月号。巨藻品种为MacrocystisPyrifera，7月份开始克隆繁殖雌雄配子体。
(I)克隆与扩繁当巨藻的游孢子发育到配子体阶段时在倒置显微镜下(显微镜为Nikon T1-U，倍数为100倍，)利用毛细管分离技术将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，将分离的细胞分别放入加入营养盐的IOOml无菌海水中分别培养，操作时温度和培养温度保持在7°C，光照强度为ZO-^yEnT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 5X10_4mol / L，KH2PO4L 5X 10_5mol / L。雌雄细胞发育成雌雄配子体后继续扩繁。在扩繁增殖过程中的环境条件为:温度保持在15°C，光照强度为20-30 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.8Xl(T4mol / L，KH2PO4L 8 X l(T5mol / L，每周更换一次;[0034](2)受精雌雄配子体分别扩繁增殖20天后，当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时(图1)，把雌雄配子体增殖形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合于1000毫升烧杯中培育，烧杯内置棕绳制盘状苗帘，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精，受精后附着在苗帘上，受精及受精后发育为孢子体的过程如图2所示；
(3)巨藻孢子体培育将受精后的合子在棕绳附着基上进行培养，培养过程中加入营养盐，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KN032.4X 10_4mol / L，KH2P042.4X 10_5mol / L，每周更换一次；5-10 周营养盐为在灭菌的海水中KN033.2X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ043.2 X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1-4周温度控制在11°C，5-10周温度控制在19°C;光照强度为:受精后1-2周20 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周40 μ EnT2S4 ;受精后5-10周80 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻幼苗,长约1.6cm (图3)。
以上仅列举几个优选的实施例，并非是对本发明作任何形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用尚属揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明内的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属 于本发明技术方案的保护范围。
权利要求
1.一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，其特征在于包括以下步骤: (1)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆；分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁； (2)受精当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，将形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精； (3 )孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4 周营养盐为在灭菌的海水中 KN03(1.8-2.4)Xl(T4mol / L, ΚΗ2Ρ04( 1.8_2.4) X 10_5mol /L，受精后5-10周营养盐为在灭菌海水中KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L，KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周温度控制在8-11 °C，受精后5-10周温度控制在17-19℃;光照强度为:受精后1-2周10-20 μ Em、-1 ;受精后3-4周20-40 μ E mY1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步骤(I)对克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为20-40μΕ HT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步骤(I)扩繁过程中的温度在10-151:，光照强度为20-401^ HT2s-1,营养盐为:在灭菌海水中ΚΝ03( 1.2-1.8)X 10_4mol /L, KH2PO4 (1.2-1.8) X10_5mol / L，每周更换一次营养盐。
4.根据权利要求
1-3任何一项所述的方法，其特征在于所述的巨藻孢子体培育过程中，受精后1-4周营养盐每周更换一次，受精后5-10周营养盐每周更换两次。
专利摘要
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，利用毛细管分离技术在显微镜下将雌配子体上的一个雌细胞和雄配子体上的一个雄细胞分别分离下来，再利用克隆无性繁殖技术分别对雌细胞和雄细胞进行克隆，使雌细胞和雄细胞分别长成雌雄配子体，将配子体继续扩繁。当配子体扩繁到一定量时，将形成的细胞团用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，2周后，雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精；受精后的合子放进营养盐中进行培育；10周后长成1.5cm左右的幼苗。本发明的受精过程及温度和光照的控制通过人工操作而实现，大大缩短了苗种生长的周期，同时利用毛细管分离技术从配子体中分离雌雄细胞进行克隆培育，提高了苗种的质量和产量，能够满足巨藻养殖，同时本发明方法繁育巨藻幼苗成本低廉。
文档编号A01H4/00GKCN102487820 B发布类型授权 专利申请号CN 201110373578
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月22日
发明者叶乃好, 范晓, 徐东, 张晓雯 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
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本发明属于藻类繁殖技术，具体地涉及一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法。
背景技术：
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巨藻被认为是进行海底植被恢复的首选大型藻类。巨藻由于体积庞大，生长速度极快，特别适合作为人工鱼 礁的“配套藻林”来改善近海生态环境，我国原无巨藻分布，1978年中国水产科学研究院黄海水产研究所采用低温水运的方法从墨西哥成功地引进了一种巨藻(Macrocystis pyrifera)幼藻和配子体。研究人员通过对巨藻养殖生物学研究,结合我国海况条件的特点，建立了巨藻人工育苗和养殖技术体系，夏苗培育达到一定的数量，建立了筏式养殖技术。然而，受苗种繁育技术的限制，一些苗种培育过程中的关键性的问题没有有效的解决，因而不能获得足量优质的苗种。王广策等发明了“用配子体克隆法繁育能源海藻-巨藻孢子体的方法”(专利申请号:200510046473.6,公开号:1865433)，该发明通过把配子体粉碎后对粉碎液进行培育并进一步扩繁获得大量雌雄配子体，雌雄配子体混合受精培养两周后获得巨藻孢子体，尽管该发明文本中记载在两周后有85-90%的配子体发育成孢子体，但在实际培养过程中，雌雄配子体混合受精后3-10周内将有大量孢子体死亡，10周以后巨藻孢子体基本稳定，养殖海区温度适宜即可下海养殖，该发明的技术方案没有公开3-10周的培养条件，并且该发明的技术方案通过对配子体粉碎后进行扩繁配子体，粉碎液中含有破碎细胞等及其它杂质影响扩繁的配子体质量，尽管通过进一步扩繁，但是最后能够获得的优质孢子体数量有限，不能满足大规模养殖的需要。
发明内容
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本发明要解决的技术问题是提供一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，以解决优质巨藻幼苗不足，不能够满足养殖需要的问题。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步骤:
(I)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆，分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁；
(2)受精当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，将形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受:精；
(3)巨藻孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3 (1.8-2.4) X10^4mol / L，KH2PO4(1.8-2.4) Xl(T5mol / L，受精后 5-10 周营养盐为 KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L, KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周温度控制在8-11 °C，受精后5-10周温度控制在17-19。。;光照强度为:受精后1-2周10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ E m、-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
进一步，所述的步骤I对克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为20-40 μ E HT2s-1,营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L, KH2PO4L 2 X 10_5mol / L。
进一步，所述的步骤I扩繁过程中的温度在10-15°c，照强度为20-40 μ E πΓ2^，营养盐为=KNO3 (1.2-1.8) ΧΙΟΛιοΙ / L，KH2PO4 (1.2-1.8) X l(T5mol / L，每周更换一次。
进一步，所述的巨藻孢子体培育过程中，受精后1-4周营养盐每周更换一次，受精后5-10周营养盐每周更换两次。
本发明与现有技术相比的有益效果:
(I)制种所用时间短。受精过程及温度和光照的控制通过人工操作而实现，大大缩短了苗种生长的周期，提高了苗种的质量和产量。受精后经过4周培养即可生成巨藻孢子体，10周后即可达到出苗规格。
(2)制种费用低廉。制种过程中所需的海水只需要煮沸消毒即可，营养盐纯度采用分析纯规格，利用低温展示柜来控制温度，通过增减白炽灯管的数量来控制光照强度。步骤操作简单可行，培养费用低廉。
(3)制种过程采用毛细管分离单细胞技术，通过克隆无性繁殖技术获得质量较高的配子体，在后续的扩培中能得到大量的雌雄配子体，产苗量大，苗种质量高。克隆出的巨藻小孢子体可达每厘米棕绳10-16棵，完全符合正常育苗密度。
(4)制种过程不受种苗和环境条件的制约。利用克隆无性繁殖技术对雌雄配子体进行扩增，制种过程无需大量的野生藻株，通过实验室人工条件控制环境，过程不受种苗和环境条件的制约。
(5)生态意义重大。制种过程无须大量野生巨藻，即保护了野生巨藻的种质资源，又可以在近海产出大量海底森林，对近海生态的修复和维护起到重要的作用。
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图1巨藻的雌雄配子体团:A早为克隆培养的雌配子体团；B ^为克隆培养的雄配子体团。
图2.雌雄配子的受精过程以及孢子体的前期发育:A，排放卵细胞；B，精卵细胞受精；C，受精后细胞拉长；D细胞横向与纵向分裂；E形成的孢子体。
图310周后的巨藻孢子体。
具体实施方式
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下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的解释。
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，包括以下步骤:
(I)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆，分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁；克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为ZO-^yEnT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L ;在扩繁过程中的最佳环境条件为:温度保持在10-15°C，光照强度为20-40 μ E IrT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2-1.8X ΙΟΛιοΙ / L, KH2PO4L 2_1.8 X l(T5mol / L ；
(2)受精雌雄配子体扩繁到一定量时，将形成的配子体团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精；
(3)巨藻孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3L 8-2.4 X10^4moI / L，KH2PO4L 8-2.4Xl(T5mol / L，每周更换一次；5-10 周 KN032.8-3.2 X 10_4mol / L,KH2P042.8-3.2X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1_4周温度控制在8_11°C，5_10周温度控制在17-19。。;光照强度为:受精后1-2周，10-20 μ E mY1 ;受精后3-4周20-40 μ EHT2S-1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E nT2s'
实施例1
本实验的进行时间为2011年6月到2011年11月号。巨藻品种为MacrocystisPyrifera,6月份开始克隆繁殖雌雄配子体。
(I)克隆与扩繁当巨藻的游孢子发育到配子体阶段时，在倒置显微镜下(显微镜为Nikon T1-U，倍数为100倍)，利用毛细管分离技术将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，将分离的细胞分别放入加入营养盐的IOOml无菌海水中进行培养，操作时温度和培养温度保持在8°C，光照强度为20-40 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2X 10_5mol / L。雌雄细胞发育成雌雄配子体后继续扩繁。在扩繁增殖过程中的环境条件为:温度保持在10°C，光照强度为20-40 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.2Xl(T4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L，每周更换一次;
(2)受精雌雄配子体分别扩繁增殖20天后，当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，把雌雄配子体增殖形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合于1000毫升烧杯中培育，烧杯内置棕绳制盘状苗帘，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精，受精后附着在苗帘上；
(3)巨藻孢子体培育将受精后的合子在棕绳附着基上进行培养，培养过程中加入营养盐，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KNO3L 8X10_4mol / L，KH2PO4L 8 X 10_5mol / L，每周更换一次；5-10周营养盐为在灭菌的海水中ΚΝ032.8X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ042.8 X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1-4周温度控制在8°C，5-10周温度控制在17°C ;光照强度为:受精后1-2周10 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周20 μ E IrT2S-1 ;受精后5-10周40 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻孢子体,长约1.5cm。
实施例2
本实验的进行时间为2011年7月到2011年12月号。巨藻品种为MacrocystisPyrifera，7月份开始克隆繁殖雌雄配子体。
(I)克隆与扩繁当巨藻的游孢子发育到配子体阶段时在倒置显微镜下(显微镜为Nikon T1-U，倍数为100倍，)利用毛细管分离技术将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，将分离的细胞分别放入加入营养盐的IOOml无菌海水中分别培养，操作时温度和培养温度保持在7°C，光照强度为ZO-^yEnT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 5X10_4mol / L，KH2PO4L 5X 10_5mol / L。雌雄细胞发育成雌雄配子体后继续扩繁。在扩繁增殖过程中的环境条件为:温度保持在15°C，光照强度为20-30 μ E HT2s'营养盐为在灭菌海水中:ΚΝ031.8Xl(T4mol / L，KH2PO4L 8 X l(T5mol / L，每周更换一次;[0034](2)受精雌雄配子体分别扩繁增殖20天后，当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时(图1)，把雌雄配子体增殖形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎后，将雌雄配子体混合于1000毫升烧杯中培育，烧杯内置棕绳制盘状苗帘，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精，受精后附着在苗帘上，受精及受精后发育为孢子体的过程如图2所示；
(3)巨藻孢子体培育将受精后的合子在棕绳附着基上进行培养，培养过程中加入营养盐，并控制温度和光照强度；受精后1-4周营养盐为在灭菌的海水中KN032.4X 10_4mol / L，KH2P042.4X 10_5mol / L，每周更换一次；5-10 周营养盐为在灭菌的海水中KN033.2X 10_4mol / L，ΚΗ2Ρ043.2 X 10_5mol / L，每周更换两次；受精后1-4周温度控制在11°C，5-10周温度控制在19°C;光照强度为:受精后1-2周20 μ E IrT2iT1 ;受精后3_4周40 μ EnT2S4 ;受精后5-10周80 μ EnT2S' 10周后，生成巨藻幼苗,长约1.6cm (图3)。
以上仅列举几个优选的实施例，并非是对本发明作任何形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用尚属揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明内的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属 于本发明技术方案的保护范围。
权利要求
1.一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，其特征在于包括以下步骤: (1)克隆与扩繁当游孢子发育到配子体阶段时，利用毛细管分离技术在显微镜下将一个雌细胞和一个雄细胞分别从雌雄配子体中分离，再利用克隆无性繁殖技术对雌雄细胞进行克隆；分别培育雌雄细胞使其发育成雌雄配子体并将配子体进行扩繁； (2)受精当雌雄配子体团各扩繁至直径大于3毫米的细胞团时，将形成的细胞团分别用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，培育两周后雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精； (3 )孢子体培育受精后的合子放进营养盐中进行培育，并控制温度和光照强度；受精后1-4 周营养盐为在灭菌的海水中 KN03(1.8-2.4)Xl(T4mol / L, ΚΗ2Ρ04( 1.8_2.4) X 10_5mol /L，受精后5-10周营养盐为在灭菌海水中KNO3 (2.8-3.2) X 10_4mol / L，KH2PO4(2.8-3.2) X10_5mol / L;受精后1-4周温度控制在8-11 °C，受精后5-10周温度控制在17-19℃;光照强度为:受精后1-2周10-20 μ Em、-1 ;受精后3-4周20-40 μ E mY1 ;受精后 5-10 周 40-80 μ E m 2S、
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步骤(I)对克隆的雌雄细胞培育过程中温度保持在8°C，光照强度为20-40μΕ HT2iT1,营养盐为在灭菌海水中:KNO3L 2X10_4mol / L，KH2PO4L 2 X l(T5mol / L。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的步骤(I)扩繁过程中的温度在10-151:，光照强度为20-401^ HT2s-1,营养盐为:在灭菌海水中ΚΝ03( 1.2-1.8)X 10_4mol /L, KH2PO4 (1.2-1.8) X10_5mol / L，每周更换一次营养盐。
4.根据权利要求
1-3任何一项所述的方法，其特征在于所述的巨藻孢子体培育过程中，受精后1-4周营养盐每周更换一次，受精后5-10周营养盐每周更换两次。
专利摘要
一种配子体克隆法繁育巨藻幼苗新方法，利用毛细管分离技术在显微镜下将雌配子体上的一个雌细胞和雄配子体上的一个雄细胞分别分离下来，再利用克隆无性繁殖技术分别对雌细胞和雄细胞进行克隆，使雌细胞和雄细胞分别长成雌雄配子体，将配子体继续扩繁。当配子体扩繁到一定量时，将形成的细胞团用细胞捣碎机捣碎，将雌雄配子体进行混合，2周后，雌雄配子体分别释放卵子和精子，自发受精；受精后的合子放进营养盐中进行培育；10周后长成1.5cm左右的幼苗。本发明的受精过程及温度和光照的控制通过人工操作而实现，大大缩短了苗种生长的周期，同时利用毛细管分离技术从配子体中分离雌雄细胞进行克隆培育，提高了苗种的质量和产量，能够满足巨藻养殖，同时本发明方法繁育巨藻幼苗成本低廉。
文档编号A01H4/00GKCN102487820 B发布类型授权 专利申请号CN 201110373578
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月22日
发明者叶乃好, 范晓, 徐东, 张晓雯 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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