一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途的制作方法
专利名称:一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域：
。
背景技术：
流感病毒(influenza virus)在病毒分类学上属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA。根据病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构及其基因特性又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-16)，神经氨酸酶有9个亚型(N1-9)。由于基因组是分节段的，故易产生同型不同株间基因重配。尤其是人甲型流感病毒HA基因能经常不断的发生点突变，导致其编码的HA蛋白分子上氨基酸序列发生替换，造成其抗原性经常不断的发生漂移，每次抗原性漂移常带来不同程度的流感流行。
正确判断流感病毒型别，是流行病学调查和疫情防控的重要环节。近100年来，已经出现了数次不同亚型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(H1N1型)，造成5000-6000万人死亡；1957年亚洲流感(H2N2)，死亡至少200万人；1968年香港流感(H3N2型)，死亡人数超过100万；1997年香港禽流感(H5N1型)，死亡人数虽少于前几次流感，但死亡率高达33 %。甲型HlNl流感自2009年3月在墨西哥暴发以来，迅速在全球流行，成为国际性的公共卫生事件。世界卫生组织(WHO)于2009年6月11日将甲型HlNl流感病毒大流行的预警级别提升至最高的6级，全球共有超过214个国家和地区向WHO报告了经实验室确诊的甲型HlNl流感病例，至少18001人死亡。随着全球人口流动性的不断增加，流感病毒交替、混合流行将成为常态。
流感病毒耐药性监测，是指导疫情防控和临床用药的必然要求。目前有两类正式上市的药物可用于治疗流感，一类是神经氨酸酶抑制剂，包括磷酸奥司他韦(oseltamivir//Tamiflu 达菲)和扎那米韦(zanamivir/Relenza ./ 乐感清)；另一类是M2通道阻滞剂,包括金刚烧胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。病毒耐药性的产生是抗病毒治疗失败的主要原因之一。由于流感病毒为节段型RNA病毒，突变发生率很高；随着抗病毒治疗的展开，药物选择压力等因素导致病毒耐药性不可避免地出现。据调查显示，目前北美地区98%的季节性流感病毒H3N2对金刚烷胺耐药，98%的季节性流感病毒HlNl对达菲耐药；禽流感病毒H5N1对达菲耐药的病例也屡有报道。自2009年6月丹麦报告了全球第一例甲型HlNl流感达菲耐药病例后，截至2010年2月3日，全球已有20个国家报告了达菲耐药的甲型HlNl流感病例至少225例。随着达菲的广泛使用，更多耐药株的出现将不可避免。耐药型病毒的产生和传播可导致抗病毒治疗失败和民众恐慌。尽管甲型HlNl流感病毒耐药病例为数不多并呈散发状，但仍引起了公众和研究者的关注。因此，对甲型HlNl流感病毒耐药性的监测和研究具有重要的意义。
甲型流感病毒具有多种高致病性亚型，而且各种亚型之间只是在蛋白或核酸水平具有细微差异，而临床上存在甄别流感病毒各种亚型的需求。这种情况对准确甄别几种重要的亚型提出了很高的技术和方法上的要求。针对不同的检测对象，通常分为病毒核酸检测和蛋白检测，病毒核酸检测因其灵敏度较高而被广泛应用。
基因芯片技术作为核酸检测方法中的重要一员，近年来被用于流感病毒的分型。国内外文献及专利文件中提及的基因芯片技术用于流感病毒的分型检测，多为针对某一种流感病毒的分型研究，而同时甄别不同亚型流感病毒的方法报道很少，且操作步骤较为繁琐，尚未标准化，成本偏高。公开号为CN1858249A，
公开日为2006年11月8日的中国专利申请公开了一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，但该方法只能对H5N1亚型进行检测，并不能同时对H1N1、H3N2等甲型流感病毒进行甄别，而且该方法需要将第一轮RT-PCR反应产物作为第二轮PCR的模板，两轮PCR反应极容易产生污染且检测需时较长。Li X报道了一种可以同时检测H1N1、H1N2，、H3N2、H5N1和H9N2的芯片，该芯片灵敏度为IO5Copies/体系。公开号为CN101392298A，
公开日为2009年3月25日的中国专利申请公开了一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，可以检测包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒在内的多种甲、乙型流感病毒。该方法需通过四重RT-PCR反应扩增病毒RNA，灵敏度为Ipg RNA。Michal报道了一种Fluchip可以同时甄别H1N1、H3N2和H5N1流感病毒，但整个过程需要12小时，每个样本的检测费用约为20美元，耗时长且费用较高。自2009年3月甲型HlNl流感暴发以来，可以同时甄别甲型HlNl流感病毒与常见的季节性H1N1、H3N2及禽H5N1、猪HlNl流感的基因芯片鲜见报道。Lu简单报道了一种芯片可以甄别甲型HlNl和季节性流感病毒，通过两步法扩增病毒RNA产物与芯片杂交，耗时较长，且并无该方法特异性及灵敏度的实验数据。
发明内容
本发明的目的在于针对流感病毒分型及耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的甲型流感病毒甄别及耐药检测基因芯片，能同时对常见的甲型流感病毒进行核酸分型，并检测其达菲耐药位点的突变情况。
为了达到上述目 的，本发明开发了检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法如下:
1.步骤一:制备通用引物
选择流感病毒NA基因作为检测靶基因，可以通过一次反应实现甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1和猪HlNl流感病毒的通用扩增，优选3对引物序列及其对应的扩增靶病毒种类，如表I所示:
表I引物序列及对应的扩增靶病毒
权利要求
1.一种检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法包括: 1)步骤一，制备3对通用引物，序列如表I所示: 表I引物序列
2.根据权利要求
1所述的基因芯片，其特征还在于用于甲型流感病毒核酸分型和甲型流感病毒达菲耐药性检测。
专利摘要
本发明涉及一种流感病毒甄别与耐药检测基因芯片，其制备方法包括制备通用引物，制备亚型核酸分型探针及耐药探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别5种亚型的甲型流感病毒，包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1、猪H1N1流感病毒，并可提示甲型流感病毒达菲耐药情况。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。
文档编号C12Q1/70GKCN102433391 B发布类型授权 专利申请号CN 201110401595
公开日2013年8月21日 申请日期2011年12月6日
发明者王升启, 刘琪琦, 陈苏红, 张敏丽, 刘志红, 朱坤 申请人:深圳市普瑞康生物技术有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2),
技术领域：
本发明涉及甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域：
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背景技术：
流感病毒(influenza virus)在病毒分类学上属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA。根据病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构及其基因特性又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-16)，神经氨酸酶有9个亚型(N1-9)。由于基因组是分节段的，故易产生同型不同株间基因重配。尤其是人甲型流感病毒HA基因能经常不断的发生点突变，导致其编码的HA蛋白分子上氨基酸序列发生替换，造成其抗原性经常不断的发生漂移，每次抗原性漂移常带来不同程度的流感流行。
正确判断流感病毒型别，是流行病学调查和疫情防控的重要环节。近100年来，已经出现了数次不同亚型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(H1N1型)，造成5000-6000万人死亡；1957年亚洲流感(H2N2)，死亡至少200万人；1968年香港流感(H3N2型)，死亡人数超过100万；1997年香港禽流感(H5N1型)，死亡人数虽少于前几次流感，但死亡率高达33 %。甲型HlNl流感自2009年3月在墨西哥暴发以来，迅速在全球流行，成为国际性的公共卫生事件。世界卫生组织(WHO)于2009年6月11日将甲型HlNl流感病毒大流行的预警级别提升至最高的6级，全球共有超过214个国家和地区向WHO报告了经实验室确诊的甲型HlNl流感病例，至少18001人死亡。随着全球人口流动性的不断增加，流感病毒交替、混合流行将成为常态。
流感病毒耐药性监测，是指导疫情防控和临床用药的必然要求。目前有两类正式上市的药物可用于治疗流感，一类是神经氨酸酶抑制剂，包括磷酸奥司他韦(oseltamivir//Tamiflu 达菲)和扎那米韦(zanamivir/Relenza ./ 乐感清)；另一类是M2通道阻滞剂,包括金刚烧胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。病毒耐药性的产生是抗病毒治疗失败的主要原因之一。由于流感病毒为节段型RNA病毒，突变发生率很高；随着抗病毒治疗的展开，药物选择压力等因素导致病毒耐药性不可避免地出现。据调查显示，目前北美地区98%的季节性流感病毒H3N2对金刚烷胺耐药，98%的季节性流感病毒HlNl对达菲耐药；禽流感病毒H5N1对达菲耐药的病例也屡有报道。自2009年6月丹麦报告了全球第一例甲型HlNl流感达菲耐药病例后，截至2010年2月3日，全球已有20个国家报告了达菲耐药的甲型HlNl流感病例至少225例。随着达菲的广泛使用，更多耐药株的出现将不可避免。耐药型病毒的产生和传播可导致抗病毒治疗失败和民众恐慌。尽管甲型HlNl流感病毒耐药病例为数不多并呈散发状，但仍引起了公众和研究者的关注。因此，对甲型HlNl流感病毒耐药性的监测和研究具有重要的意义。
甲型流感病毒具有多种高致病性亚型，而且各种亚型之间只是在蛋白或核酸水平具有细微差异，而临床上存在甄别流感病毒各种亚型的需求。这种情况对准确甄别几种重要的亚型提出了很高的技术和方法上的要求。针对不同的检测对象，通常分为病毒核酸检测和蛋白检测，病毒核酸检测因其灵敏度较高而被广泛应用。
基因芯片技术作为核酸检测方法中的重要一员，近年来被用于流感病毒的分型。国内外文献及专利文件中提及的基因芯片技术用于流感病毒的分型检测，多为针对某一种流感病毒的分型研究，而同时甄别不同亚型流感病毒的方法报道很少，且操作步骤较为繁琐，尚未标准化，成本偏高。公开号为CN1858249A，
公开日为2006年11月8日的中国专利申请公开了一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，但该方法只能对H5N1亚型进行检测，并不能同时对H1N1、H3N2等甲型流感病毒进行甄别，而且该方法需要将第一轮RT-PCR反应产物作为第二轮PCR的模板，两轮PCR反应极容易产生污染且检测需时较长。Li X报道了一种可以同时检测H1N1、H1N2，、H3N2、H5N1和H9N2的芯片，该芯片灵敏度为IO5Copies/体系。公开号为CN101392298A，
公开日为2009年3月25日的中国专利申请公开了一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，可以检测包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒在内的多种甲、乙型流感病毒。该方法需通过四重RT-PCR反应扩增病毒RNA，灵敏度为Ipg RNA。Michal报道了一种Fluchip可以同时甄别H1N1、H3N2和H5N1流感病毒，但整个过程需要12小时，每个样本的检测费用约为20美元，耗时长且费用较高。自2009年3月甲型HlNl流感暴发以来，可以同时甄别甲型HlNl流感病毒与常见的季节性H1N1、H3N2及禽H5N1、猪HlNl流感的基因芯片鲜见报道。Lu简单报道了一种芯片可以甄别甲型HlNl和季节性流感病毒，通过两步法扩增病毒RNA产物与芯片杂交，耗时较长，且并无该方法特异性及灵敏度的实验数据。
发明内容
本发明的目的在于针对流感病毒分型及耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的甲型流感病毒甄别及耐药检测基因芯片，能同时对常见的甲型流感病毒进行核酸分型，并检测其达菲耐药位点的突变情况。
为了达到上述目 的，本发明开发了检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法如下:
1.步骤一:制备通用引物
选择流感病毒NA基因作为检测靶基因，可以通过一次反应实现甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1和猪HlNl流感病毒的通用扩增，优选3对引物序列及其对应的扩增靶病毒种类，如表I所示:
表I引物序列及对应的扩增靶病毒
权利要求
1.一种检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法包括: 1)步骤一，制备3对通用引物，序列如表I所示: 表I引物序列
2.根据权利要求
1所述的基因芯片，其特征还在于用于甲型流感病毒核酸分型和甲型流感病毒达菲耐药性检测。
专利摘要
本发明涉及一种流感病毒甄别与耐药检测基因芯片，其制备方法包括制备通用引物，制备亚型核酸分型探针及耐药探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别5种亚型的甲型流感病毒，包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1、猪H1N1流感病毒，并可提示甲型流感病毒达菲耐药情况。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。
文档编号C12Q1/70GKCN102433391 B发布类型授权 专利申请号CN 201110401595
公开日2013年8月21日 申请日期2011年12月6日
发明者王升启, 刘琪琦, 陈苏红, 张敏丽, 刘志红, 朱坤 申请人:深圳市普瑞康生物技术有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2),
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