变异葡萄糖脱氢酶的制作方法
专利名称:变异葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及底物特异性提高的变异葡萄糖脱氢酶。具体而言，本发明涉及包含下述变异型α亚单位的葡萄糖脱氢酶及其基因，所述变异型α亚单位是在构成包含细胞色素C的葡萄糖脱氢酶(下文中也称为CyGDH)的α亚单位氨基酸残基中引入变异的。本发明的葡萄糖脱氢酶可以适用于葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒等，在生物化学领域、临床领域等中有用。
背景技术：
目前，野生型的Cy⑶H及以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的PQQGDH用于血糖自测传感器。野生型的CyGDH及PQQGDH有如下缺点由于其不仅与葡萄糖反应而且还与麦芽糖反应， 因此在患者的血中麦芽糖浓度高的情况下，不能测定准确的血糖值。特别是在日本和英国， 使用麦芽糖作为输液中的能量物质，实际上，利用腹膜透析等施用输液的低血糖患者，还会发生因用PQQGDH型的血糖传感器而被误认为高血糖的事故。
野生型CyGDH对麦芽糖的反应性比对葡萄糖的反应性高，在葡萄糖浓度为50mg/ dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果显示出170%的高值。
鉴于如上所述的情况，发明了 Cy⑶H的变异体酶(在α亚单位的氨基酸残基的 3 位和365位上引入变异，分别取代成谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)的变异葡萄糖脱氢酶(以下也可称为Cy⑶H (QY)或者简称为QY、QYA))(国际公开号2006/137^3)，在葡萄糖浓度为 50mg/dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果能够被控制到36%的高值。但是， 还不能说是规避麦芽糖影响的效果彻底的物质。
发明内容
本发明的课题在于，提供与Cy⑶H(QY)相比对葡萄糖的底物特异性提高的Cy⑶H。
本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代构成CyGDH的α亚单位的氨基酸残基中相应于3 位和365位的位点，并且进一步用酪氨酸取代相应于472位的位点，与Cy⑶H(QY)相比，底物特异性进一步提高，而且， 即使将GDH的同源物中的相应于3 位、365位及472位的位点分别用谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代也可带来同样的效果，从而完成了本发明。
SP，本发明为以下的内容。
(1)变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80%的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于
所述氨基酸序列的相应于3 位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、 酪氨酸及酪氨酸取代；
对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
(2)如⑴所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90%的同一性的
氨基酸序列。[0012](3)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于于3 位、365位及472 位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。
(4)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。
(5)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。
(6)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。
(7)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。
(8)如(1) (7)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于3 位和365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
(9)如(1) (8)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。
(10)变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。
(11)如(10)所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色
素Co
(12)编码(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。
(13)微生物，其保持(12)所述的DNA，产生(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者(10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。
(14)葡萄糖检测试剂盒，其包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、 (10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(1 所述的微生物。
(15)葡萄糖传感器，其包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、(10) 或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(1 所述的微生物。
图1是表示葡萄糖传感器的结构的图。
图2是表示葡萄糖传感器的各试剂部的图。
图3是表示使用比色式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。
图4是表示使用电极式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。
图5是表示电极式葡萄糖传感器的结构的图。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
本发明的变异⑶H可以通过将特定的变异引入野生型⑶H的α亚单位来制造。野生型⑶H可例如是洋葱伯克霍尔德菌(BurWiolderia cepacia)产生的⑶H。洋葱伯克霍尔德菌的⑶H，例如是洋葱伯克霍尔德菌KSl株、JCIC800株或JCIC801株产生的⑶H。KSl 株在2000年9月25日以保藏号码为第FERM BP-7306保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)。
包含KSl株的⑶H α亚单位基因及β亚单位基因的一部分的染色体DNA片段的碱基序列如序列号1所示(美国专利申请公开第2004/0023330号)。该碱基序列中存在3 个开放阅读框(ORF)，从5 ‘末端侧开始第2及第3个ORF分别编码α亚单位(序列号3) 及β亚单位(序列号4)。另外，推测第1个ORF编码γ亚单位(序列号2)。另外，序列号5中示出含有β亚单位基因全长的片段的碱基序列。而且，β亚单位的氨基酸序列示于序列号6中(欧洲专利申请公开第1498484号)。推测序列号6中氨基酸号码1 22为信号肽。
另夕卜，除此之外，作为洋葱伯克霍尔德菌KSl株的GDH的同源物，新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia) J2315株的假定的氧化还原酶(putative oxidoreductase)(序列号 7)、Burkholderia thailandensis TXDOH 株的假定蛋白 BthaT-07876 (序列号8)、皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii) 12D株的FAD依赖型氧化还原酶(FAD dependent oxidoreductase)(序列号9)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)IP01609 株的跨膜脱氧酶(transmembrane dehydrogenase)(序列号10)及Burkholderia phytof irmans PsJN株的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶 (glucose-methanol-choline oxidoreductase)(序列号 11)的各 α 亚单位也可以禾口洋葱伯克霍尔德菌KSl株的GDH同样使用。
此外，关于序列号7 11所示的氨基酸序列，均在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的数据库中登录。各自的登录号码分别为序列号7为YP-002234347、序列号8为ZP-02370914、序列号9为 YP-002980762、序列号 10 为 YP-002260434、序列号 11 为 YP-001890482。
另外，新洋葱伯克霍尔德菌J2315 株以 LMG16656、ATCCBAA-245、CCM4899、 CCUG48434、NCTC13227 保藏。Burkholderia phytofirmans PsJN 株以 LMG22487、CCUG49060 保藏。
另外，作为和洋葱伯克霍尔德菌KSl株同属的洋葱伯克霍尔德菌株，来自例如 JCM2800, JCM28Ol、JCM5506, JCM5507, IF014595 的各 GDH 的 α 亚单位(序列号 I2 I6) 也可以和洋葱伯克霍尔德菌KS1株的⑶H同样地使用。此外，JCM2800、JCM2801、JCM5506及 JCM5507保存于日本独立行政法人理化学研究所微生物菌种保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM)。IF014595保存于日本财团法人发酵研究所(IFO)。
本发明的变异⑶H可以仅为α亚单位，也可以为α亚单位和β亚单位的复合体， α亚单位和γ亚单位的复合体，或包括α亚单位、β亚单位及Y亚单位的复合体。在本说明书中，将含有β亚单位的GDH复合体称为CyGDH，将不含β亚单位的GDH复合体称为 GDH0对于本发明的变异GDH而言，在任何情况下，在α亚单位中均引入特定的变异(3 位、365位及472位中的变异，或对应于这些位点的位置中的变异)，但是除该特定的变异之夕卜，也可以具有保守变异(保存的&変異)。另外，其它的亚单位可以为野生型，也可以具有保守的变异。需要说明的是，所谓“保守的变异”是指对GDH活性没有实质影响的变异。[0038]本发明的变异型α亚单位优选除上述特定的变异以外具有序列号3、7 11所示的氨基酸序列。另外，对于变异型α亚单位而言，只要具有GDH活性，也可以具有如上所述的保守的变异。即，可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列号3、7 11的氨基酸序列中，除了具有上述特定的变异之外，还取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基。此外，在序列号3中示出了可利用序列号1的碱基序列编码的氨基酸序列， 但是N末端的甲硫氨酸残基有可能会在翻译后脱落。上述所谓的“一个或多个”优选为1 10个、更优选为1 5个、特别优选为1 3个。此外，本发明的变异型α亚单位相对于序列号3中所示的氨基酸序列而言，具有至少80%、优选85%、更优选90%的氨基酸同一性。
另外，β亚单位典型地具有序列号6的氨基酸序列。但是，只要可以作为Cy⑶H 的β亚单位起作用，也可以为具有在包括序列号6的氨基酸号码23 425的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。另外，只要可以作为Cy⑶H的β亚单位起作用，也可以为具有KSl株以外的β亚单位及该β亚单位的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。上述所谓的“一个或多个”优选1 20个、更优选为1 10个、特别优选为1 5个。
此外，所谓的作为Cy⑶H的β亚单位起作用，是指在和α亚单位一起形成复合体时作为不损害该复合体的GDH活性的电子传递亚单位、即细胞色素C起作用。
作为野生型α亚单位基因，具体可例如包含包括序列号1的碱基号码764 2380 的碱基序列的DNA。另外，α亚单位基因也可以为具有包括序列号1中的碱基序列的碱基号码764 2380的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码具有⑶H活性的蛋白质的DNA。
另外，作为β亚单位基因，具体可例如包含包括序列号5的碱基号码187 1398 的碱基序列的DNA。另外，β亚单位基因也可以为具有包括序列号5的碱基号码187 1398的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码可作为β亚单位起作用的蛋白质的DNA。
上述严谨条件可例如是具有优选80%、更优选90%以上、特别优选95%以上的同源性的DNA之间杂交的条件，具体可例如是0. 1XSSC、0. 1% SDS、60°C。
α亚单位基因及β亚单位基因例如可以利用以洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA为模板进行PCR来获取。PCR用引物可以基于上述的碱基序列通过化学合成来制备。 另外，还可以利用以基于上述序列制备的寡核苷酸为探针的杂交，由洋葱伯克霍尔德菌KSl 株的染色体DNA来获取。此外，也可以使用KSl株以外的新洋葱伯克霍尔德菌J2315株、 Burkholderia thailandensis TXDOH株、皮氏罗尔斯顿氏菌12D株、茄科雷尔氏菌IP01609 株及 Burkholderia phytof irmans PsJN 株。
对本发明的变异⑶H而言，通过使如上所述的野生型⑶H或具有保守的变异的⑶H 具有特定的变异，对葡萄糖的底物特异性提高。所谓“对葡萄糖的底物特异性提高”包含如下含义在实质上保持对葡萄糖的反应性的情况下，对其它单糖类、二糖类或低聚糖等糖类例如麦芽糖、半乳糖、木糖等的反应性下降；或对葡萄糖的反应性与对其它糖类的反应性相比提高了。例如，即使对葡萄糖的反应性下降，但对其它糖类的反应性也下降更多的话，则对葡萄糖的底物特异性是提高的。另外，即使对其它糖类的反应性升高，但对葡萄糖的底物特异性升高更多的话，则对葡萄糖的底物特异性提高。具体而言，例如，如果变异型酶相对野生型酶的底物特异性(对葡萄糖的比活性和对其它糖类例如麦芽糖的比活性之比)的提高(用下述式表示)为10%以上、优选20%以上、更优选40%以上，则对葡萄糖的底物特异性提高。例如，底物特异性在使用野生型酶为60%、使用变异型GDH时为40%的情况下，对葡萄糖的底物特异性升高了 33%。
底物特异性=(对葡萄糖以外的糖类的比活性/对葡萄糖的比活性)X 100
底物特异性的提高=(A-B) X100/A
A 野生型酶的底物特异性
B 变异型酶的底物特异性
另外，变异型⑶H对麦芽糖的反应性(比活性)为对葡萄糖的反应性(比活性) 的以下、优选0.5%以下。
较之优选在序列号3所示的氨基酸序列的相应于3 位及365位的氨基酸残基分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代而472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比，本发明的变异型GDH 对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性下降。
本发明中的所谓变异，具体而言如下所述。
(1)序列号3所示的氨基酸序列的相应于3 位的丝氨酸残基被谷氨酰胺取代。
(2)序列号3所示的氨基酸序列的相应于365位的丝氨酸残基被酪氨酸取代。
(3)序列号3所示的氨基酸序列的相应于472位的丙氨酸残基被酪氨酸取代。
上述氨基酸取代变异的位置为序列号3(即洋葱伯克霍尔德菌KSl株的野生型 GDHa亚单位)的氨基酸序列中的位置，但是在序列号3的氨基酸序列中除上述特定的变异以外还具有取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的GDHa亚单位的同源物或变体中，在和序列号3的氨基酸序列的比对中，表示相当于上述氨基酸取代的位置的位置。例如，在1 364位的区域中具有1个氨基酸残基缺失的⑶Hα亚单位的保守变体中，所谓365位表示上述变体的364位。
在序列号7中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为同样的326 位、365位及472位。
在序列号8中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为3M位、 363位及470位。
在序列号9中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为327位、 366位及473位。
在序列号10中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为327位、 366位及473位。
在序列号11中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为322位、 361位及466位。
此外，对于序列号3所示的氨基酸序列而言，相对于序列号7 11，分别具有 96%、93%、82%、82%、63%的氨基酸序列同一性。
在以下的表1中，示出了序列号3、7 11的氨基酸序列比对。
[表1-1]
序列号 31 MADTDT--QKADVVVVGSGVAGAIVAHQLAMAGKAVILLEAGPRMPRWEI 48
序列号 71 MADTDT--QKADVVVVGSGVAGAIVAHQLAMAGKSVILLEAGPRMPRWEI 48
序列号 81 MAET——QQADVVVVGSGVAGAIVAHOLAMAGKSVILLEAGPRMPRWEI 46
序列号 91 MAQSEQTRQQADIVVVGSGVAGALVAYELARAGKSVLMLEAGPRLPRWEI 50
序列号 101 MADTRR-ADQADIVVVGSGVAGALVAYELARAGKSVLMLEAGPRLPRWEI 49
序列号 111 MANKNS——ADIVVVGSGVAGGLVAHQMALAGASVILLEAGPRIPRWQI 46
序列号 349 VERFRNQPDKMDFMAPYPSSPWAPHPEYGP-PNDYLILKGEHKFNSQYIR 97
序列号 749 VERFRNQPDKTDFMAPYPSSPWAPHPEYGP-PNDYLI LKGEHKFNSQY IR 97
序列号 847 VERFRNOPDKMDFMAPYPSSAWAPHPEYAP-PNDYLVLKGEHKFNSQYIR 95
序列号 951 VERFRNQADKMDFMAPYPSTAWAPHPEYGP-PNNYLVLKGEHQFNSQYIR 99
序列号 1050 VERFRNQADKMDFMAPYPSTPWAPHPEYGPSPNDYLVLKGEHKFDSQYIR 99
序列号 1147 VENFRNSPVKSDFATPYPSTPYAPHPEYAP-ANNYLIQKGDYPYSSQYLR 95
序列号 398 AVGGTTWHWAASAWRFIPNDFKMKSVYGVGRDWPIQYDDLEPYYORAEEE 147
序列号 798 AVGGTTWHWAASAWRF IPNDFKMKTVYGVARDWPIQYDDLEHWYQRAEEE 147
序列号 896 AVGGTTWHWAASAWRF IPNDFKMKTVYGVGRDWPIQYDDLEHFYQRAEEE 145
序列号 9100 AV6GTTWHWAASTWRFLPNDFKLRSVYGIARDWPIQYQDLERYYGLAEEA 149
序列号 10100 AVGGTTWHWAASTWRFLPNDFKLRSVYGIARDWPL0YDDLERDY6RAEAA 149
序列号 1196 LVG6TTWHWAAAAWRLLPSDFQLHKLYGVGRDWPYPYETLEPWYSAAEVQ 145
序列号 3148 LGVWGPGPEEDLYSPRKQPYPMPPLPLSFNEQTIKTALNNYDPKFHVVTE 197
序列号 7148 LGVWGPGPEEDLYSPRKQAYPMPPLPLSFNEQTIKSALNGYDPKFHVVTE 197
序列号 8146 LGVWGPGAEEDLLSPRKAPYPMPPLPLSYNERTIKTALNNHDPKYHVVTE 195
序列号 9150 LGVWGPN-DEDLGSPRSQPYPMTPLPLSFNERTIKEALNAHDASFHVVTE 198
序列号 10150 L6VWGPN-DEDLGSPRSQPYPMAPLPLSFNERTIKEALNAHDPAFHVVTE 198
序列号 11146 LGVSGPGNSIDL6SPRSKPYPMNPLPLSYMDQRFSDVLNAQG—FKVVPE 193
序列号 3198 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMPI CP IGAMYNGIVHVEKAERAGAKLIEN 247
序列号 7198 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEOAGAKLIDS 247
序列号 8196 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEQAGAKLIEN 245
序列号 9199 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEQAGARLIEN 248
序列号 10199 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGI VHVEKAEQAGARL IEN 248
序列号 11194 PVARNSRPYDARPTCCGNNNCMPI CP IAAMYNGVVHAEKAEQAGAKLIPE 243
序列号 3248 AVVYKLETGPDKRIVAALYKDKTGAEHRVEGKYFVLAANGIETPKILLMS 297
序列号 7248 AVVYKLETGPDKR IVAAIYKDKTGADHRVEGKYFVLAANGIETPKILLMS 297
序列号 8246 AVVHKLEVGPQKKIVAALYKDPKGAEHRVEGKYFVLAANGIETPKLMLMS 295
序列号 9249 AVVFKLEVGPNKRIVAARYKDSKGAEHRVEGKWFVLAANGI ETPKLMLMS 298
序列号 10249 AVVYKLEVGAGRRIVAAHYKDPKGVDHRVEGKWFVLAANGI ETPKLMLMS 298
序列号 11242 AVVYRVEADNKGLITAVHYKDPNGNSTRVTGKLFVLAANGI ETPKLMLMS 293
[表 1-2]
序列号 3298 ANRDFPNGVANSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYASEKLWPGRGPQEMTSLIG 347
序列号 7298 ANRDFPNGVANSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYANEKLWPGRGPOEMTSLIG 347
序列号 8296 TSHDFPNGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYASEKLWPGRGPQEMTSLIG 345
序列号 9299 TSQDFPKGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYADRKLWPGRGPQEMTSLIG 348
序列号 10299 TSEAFPRGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYADRKLWPGRGPQEMTSLIG 348
序列号 11294 TSDKFPHGVGNSSDQVGRNLMDHPGTGVTFLANEALWPGRGPMEMTSIVN 343
序列号 3348 FRDGPFRATEAAKKIHLSNLSRIDQETQKIFKAGKLMKPDELDAQIRDRS 397
序列号 7348 FRDGPFRATEAAKK IHLSNMSRINOETQKIFKAGKLMKHEELDAOIRDRS 397
序列号 8346 FRDGPFRATEAAKK I HLSNLSR IDQETOKIFKAGKLLKPAELDAQIRDRS 395
序列号 9349 FRDGPFRATQAGKKLHLSNISRIEQETQRIFKEGKLIKPADLDARIRDOA 398
序列号 10349 FRDGPFRAMOAGKKLHLSNISRIEQETARIFKAGKLLKPAELDARIRDQA 398
序列号 11344 FRDGAFRSDYAAKKLHLSNGVPTMSVTADLLKK6—LTGAELDRQIRDRA 391
序列号 3398 ARYVQFDCFHEILPQPENRIVPSKTATDAIGIPRPEITYAIDDYVKRGAA 447
序列号 7398 ARYVQFDCFHE I LPQPENR I VPSKTATDA IGIPRPEITYAIDDYVKRGAV 447
序列号 8396 ARYVQFDCFHE I LPQPENR I VPSKTATDA IGIPRPEITYAI DDYVKRGAA 445
序列号 9399 ARYVQFDSFHEILPLPENRIVPSATEVDA161PRPEITYHIDDYVKRSAV 448
序列号 10399 ARYVQFDSFHE I LPLPENR IVPSATETDALGIPRPEITYRI DDYVKRSAV 448
序列号 11392 ARTLNINSFHEHLAEPQNRVVPSADHKDSLGI POPE IYYSINDYVKKSAA 441
序列号 3448 HTREVYATAAKVLGGTDVVFNDEFAPNNHITGSTIMGADARDSVVDKDCR 497
序列号 7448 HTREVYATAAKVLGGTDVVFNDEFAPNNH ITGATI MGADARDSVVDKDCR 497
序列号 8446 HTREVYASAAQVLGGTDVVFNDEFAPNNHITGATIMGADPRDSVVDKDCR 495
序列号 9449 HTREVYATAAQVMGGTNVEFHDDFAPNNHITGATIMGADPKDSVVDKDCR 498
序列号 10449 HTREVYATAAKVLGATDVQFHDDFAPNNHITGATSMGADPKDSVVDKDCR 498
序列号 11442 NTHELYAQIAALFGGAEVTFDDTFAPNNHIMGTTIMGSDPADSVVDADCR 49
序列号 3498 TFDHPNLFISSSATMPTVGTVNVTLTIAALALRMSDTLKKEV 539
序列号 7498 TFDHPNLF ISSSSTMPTVGTVNVTLTI AALALRMSDTLKKEV 539
序列号 8496 TFDHPNLF I SSSATMPTVGTVNVTLT IAALALRISDQLKKE 丨 537
序列号 9499 TFDHPNLF I SSSSTMPTVGTVNVTLT IAALALRIADQLKQEA 540
序列号 10499 TFDHPNLF I SSSATMPTVGTVNVTLT IAALALRIADRLKKEA 540
序列号 11492 THDHSNLFIASSGVMPTAASVNCTLTIAALSLKLADKLKREI 533
为了较之变异体葡萄糖脱氢酶(CyGDH(QY))而言增加对葡萄糖的底物特异性，本发明人使用遗传算法，对最佳的3 位、365位及472位的组合进行了研究。其结果发现了可以提高底物特异性的组合。
以下示出了本发明的变异型GDH的优选变异方式。
(数字表示氨基酸序列中的位置，氨基酸残基表示上述位置中的取代后的氨基酸残基，“ + ”表示同时具有2个氨基酸取代。)
326Gln+365Tyr+472Tyr
具有期望的变异的⑶Ha亚单位可通过如下方法来获取，利用位点特异性变异法，在编码⑶Ha亚单位的DNA(a亚单位基因)上，引入对应于期望的氨基酸变异的核苷酸变异，将获得的变异DNA用适当的表达体系来表达。另外，通过将编码变异GDHa亚单位的DNA、与编码β亚单位的DNA(i3亚单位基因)或β亚单位基因和编码Y亚单位的 DNA (Y亚单位基因)一起表达，可以获得变异Cy⑶H复合体。此外，向编码⑶Ha亚单位的 DNA引入变异，也可以使用将Y亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段。[0073]可以通过如下方法来确定引入了变异的⑶Ha亚单位或Cy⑶H复合体的底物特异性，即，利用实施例中记载的方法，研究对各种糖类的反应性，并和野生型GDHa亚单位或野生型Cy⑶H复合体的反应性相比较。
对于将γ亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段，可以利用例如以洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA为模板、将具有序列号19、20的碱基序列的寡核苷酸作为引物的PCR来获取(参照后述实施例)。
作为用于获取GDH的各亚单位的基因、引入变异、表达基因等的载体，可举出例如通过hcherichia属细菌起作用的载体，具体可例如φ^χ^θΑ、pBR322、pUC18、pUC118、 pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等。作为用于基因表达的启动子，可例如lac、trp、tac、 trc、Pptet、W10A等。另外，通过在包含启动子的表达载体的适当位点插入α亚单位基因或其它亚单位基因，由此可以在同一步骤中进行向这些基因的载体的插入和启动子的连接。作为如上所述的表达载体，可例如φ χ^θΑ,ρΒΙικ^α ρΙρΚΙ^ΖβΙ等。
另外，α亚单位基因或其它亚单位基因可以以能够表达的方式整合进宿主微生物的染色体DNA中。
在使用重组载体转化微生物时，可例如利用钙处理的感受态细胞法、原生质粒法或电穿孔法等。
宿主微生物可例如是枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌、酿酒酵母等酵母、黑曲霉等丝状真菌，但是不限于这些，只要是适合生产异源蛋白质的宿主微生物就可以使用。
本发明的变异α亚单位或变异Cy⑶H复合体或者对其进行表达的微生物，可以作为葡萄糖传感器的酶电极、或葡萄糖的检测试剂盒的构成要素来使用。使用洋葱伯克霍尔德菌的野生型GDH的葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒在美国专利公开第 2004/0023330Α1中有记载。本发明的变异⑶H也可以同样操作来使用。
实施例
下面，举出实施例进一步具体地说明本发明，但是本发明不限定于这些实施例。
实施例1表达洋葱伯克霍尔德菌的GDH或CWDH的质粒
准备表达⑶H的α亚单位及γ亚单位的质粒作为表达洋葱伯克霍尔德菌的⑶H 的质粒，并且，准备表达α亚单位、β亚单位及γ亚单位的质粒作为表达Cy⑶H的质粒。
<1>表达⑶H的α亚单位及γ亚单位的质粒
使用了W002/036779(对应于 EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703A)中记载的质粒ρΤιχ99Α/γ + α作为表达α亚单位及Υ亚单位的质粒。该质粒为将从洋葱伯克霍尔德菌KSl株(FERM ΒΡ-7306)染色体DNA中分离的、连续包含⑶H γ亚单位结构基因和α 亚单位结构基因的DNA片段，插入作为载体pTrc99A的克隆位点的Ncol/Hindlll中而形成的质粒。本质粒中的⑶H γ α基因利用trc启动子来控制。pTrc99A/Y + a保持有氨苄青霉素抗性基因。
利用以上述质粒pTrc99A/γ + α为模板，以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行 PCR，对包含在GDH的α亚单位C末端附加了 6个组氨酸残基的DNA片段的整个质粒进行扩增。
[正向引物]
5，-ACCACCACTGATAAGGAGGTCTGACCGTGCGGAAATCTAC-3，(序列号 17)[0089][反向引物]
5‘ -AGCCTGTGCGACTTCTTCCTTCAGCGATCGGTGGTGGTGG-3‘(序列号 I8)
将扩增得到的片段两端进行平末端化后，将5’末端磷酸化，利用连接反应进行环状化。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5 α，采集在包含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA 片段，确认了约2. 11Λ的插入片段。本质粒中GDH的各结构基因利用trc启动子来控制。本质粒保持有氨苄青霉素抗性基因。
<2>表达Cy⑶H的α亚单位、β亚单位及Y亚单位的质粒
按如下操作来制备表达Cy⑶H的α亚单位、β亚单位及、亚单位的质粒。
(1)来自洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA的制备
依照通常方法，由洋葱伯克霍尔德菌KSl株来制备染色体基因。即，使用TL液体培养基(聚蛋白胨log、酵母提取液lg、NaCl 58、1(吐 0428、葡萄糖58;11^ !1 7. 2)，将该菌株在34°C下振荡一晚。通过离心分离回收增殖的菌体。将该菌体悬浮在包含IOmM的NaCl、 20mM 的 Tris-HCl (pH 8. 0) UmM 的 EDTA、0. 5%的 SDSUOO μ g/ml 的蛋白酶 K 的溶液中，在 50°C处理6小时。在其中添加等量的苯酚-氯仿并在室温下搅拌10分钟，然后，通过离心分离回收上清液。向其中添加醋酸钠，使最终浓度达到0. 3M，用2倍量的乙醇进行分层，使染色体DNA在中间层析出。将其用玻璃棒捞出，用70%的乙醇洗涤后，使其溶解在适量的 TE缓冲剂中，制成染色体DNA溶液。
(2)编码Cy⑶H的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段的制备
利用以上述染色体DNA为模板、以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行PCR，扩增编码Cy⑶H的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段。
[正向引物]
5，-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3，(序列号 19)
[反向引物]
5，-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3，(序列号 20)
将扩增得到的片段的C末端侧进行平末端化后，用NcoI对N末端侧进行消化，在经同样处理的pTrc99A上进行连接。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5 α，采集在包含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA片段，确认了约3. 81Λ的插入片段。将本质粒命名为 pTrc99A γ α β。本质粒中的Cy⑶H的各结构基因利用trc启动子来控制。pTrc99A γ α β 保持有氨苄青霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因。
实施例2通过向CWDHa亚单位基因引入变异对底物相互作用位点的探索
(1)向3 位、365位及472位引入变异
在实施例1中获得的pTrc99A γ α β所含有的⑶H α亚单位基因上，以使编码该基因的α亚单位的3 位的丝氨酸残基、365位的丝氨酸残基、及472位的丙氨酸残基被取代为其它氨基酸残基的方式引入变异。
具体而言，使用市售的位点特异性变异引入试剂盒(Stratagenc公司， QuikChangell Site-Directed Mutagenesis Kit)，将实施例 1 记载的质粒 pTrc99A/γ + α 及pTrc99AY α β中含有的⑶Ha亚单位基因的幻6位的丝氨酸的密码子(TCG)、365位的丝氨酸的密码子(TCG)、及472位的丙氨酸的密码子(GCG)取代成其它氨基酸的密码子。
用于上述氨基酸残基取代的正向引物及反向引物的序列示于下表2。另外，用于制备3个变异的反向引物示于表3。
此外，在表示变异的表述中，数字表示氨基酸序列中的位置，数字前的字母表示氨基酸取代前的氨基酸残基，数字后的字母表示氨基酸取代后的氨基酸残基。例如，R53F表示53位由精氨酸向苯基丙氨酸的取代。
对于PCR反应而言，使用下文中的反应组成，在95°C、30秒后，重复15次95°C、30 秒；55°C、1分钟；68°C、8分钟的循环，在68°C进行30分钟的反应后，在4°C下保持。
[反应液组成]
模板 DNA (5ng4il)2μ1
(3 变异引入 pTrc99A/y+a 及 ρΤ 99Αγαβ) IOx反应缓冲液5μ1
正向引物(lOOng/μΙ)1.25μ1
反向引物(lOOng/μΙ)1.25μ1
dNTPΙμ
蒸馏水38.5μ1
DNA聚合酶Ιμ
合计50μ1
PCR反应后，在反应液中添加0. 5 μ 1的Dpnl，在37°C下孵育1小时，使模板质粒分解。
使用获得的反应液转化大肠杆菌DH5a (SUpE44，Δ lacU169 (Φ801βοΖ ΔΜ15), hsdR17，recAi，endAl，gyrA96，thi-1, relAl)的感受态细胞。由数个在包含氨苄青霉素 (50yg/ml)及卡那霉素(30yg/ml)的LB琼脂培养基(细菌用胰蛋白胨1 %、酶提取液 0. 5%,NaCl 1%、琼脂1. 5% )上生长的菌落制备质粒DNA，进行序列分析，确认了在⑶Hα 亚单位基因中引入了目标变异。
[表2]
权利要求
1.变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80%的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于所述氨基酸序列的相应于3 位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代；对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
2.如权利要求
1所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90%的同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。
5.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。
6.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。
7.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。
8.如权利要求
1 7中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于3 位及365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
9.如权利要求
1 8中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。
10.变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。
11.如权利要求
10所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色素C。
12.编码权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。
13.微生物，其保持权利要求
12所述的DNA，产生权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。
14.葡萄糖检测试剂盒，其包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求
13所述的微生物。
15.葡萄糖传感器，其包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求
13所述的微生物。
专利摘要
本发明提供了一种变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于，所述氨基酸序列的相应于326位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
文档编号C12Q1/02GKCN102453702SQ201110404251
公开日2012年5月16日 申请日期2011年10月27日
发明者小岛胜博, 早出广司 申请人:爱科来株式会社, 生物工程实验室有限责任公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
技术领域：
本发明涉及底物特异性提高的变异葡萄糖脱氢酶。具体而言，本发明涉及包含下述变异型α亚单位的葡萄糖脱氢酶及其基因，所述变异型α亚单位是在构成包含细胞色素C的葡萄糖脱氢酶(下文中也称为CyGDH)的α亚单位氨基酸残基中引入变异的。本发明的葡萄糖脱氢酶可以适用于葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒等，在生物化学领域、临床领域等中有用。
背景技术：
目前，野生型的Cy⑶H及以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的PQQGDH用于血糖自测传感器。野生型的CyGDH及PQQGDH有如下缺点由于其不仅与葡萄糖反应而且还与麦芽糖反应， 因此在患者的血中麦芽糖浓度高的情况下，不能测定准确的血糖值。特别是在日本和英国， 使用麦芽糖作为输液中的能量物质，实际上，利用腹膜透析等施用输液的低血糖患者，还会发生因用PQQGDH型的血糖传感器而被误认为高血糖的事故。
野生型CyGDH对麦芽糖的反应性比对葡萄糖的反应性高，在葡萄糖浓度为50mg/ dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果显示出170%的高值。
鉴于如上所述的情况，发明了 Cy⑶H的变异体酶(在α亚单位的氨基酸残基的 3 位和365位上引入变异，分别取代成谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)的变异葡萄糖脱氢酶(以下也可称为Cy⑶H (QY)或者简称为QY、QYA))(国际公开号2006/137^3)，在葡萄糖浓度为 50mg/dL时，麦芽糖浓度为100mg/dL时的血糖值测量结果能够被控制到36%的高值。但是， 还不能说是规避麦芽糖影响的效果彻底的物质。
发明内容
本发明的课题在于，提供与Cy⑶H(QY)相比对葡萄糖的底物特异性提高的Cy⑶H。
本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代构成CyGDH的α亚单位的氨基酸残基中相应于3 位和365位的位点，并且进一步用酪氨酸取代相应于472位的位点，与Cy⑶H(QY)相比，底物特异性进一步提高，而且， 即使将GDH的同源物中的相应于3 位、365位及472位的位点分别用谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代也可带来同样的效果，从而完成了本发明。
SP，本发明为以下的内容。
(1)变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80%的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于
所述氨基酸序列的相应于3 位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、 酪氨酸及酪氨酸取代；
对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
(2)如⑴所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90%的同一性的
氨基酸序列。[0012](3)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于于3 位、365位及472 位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。
(4)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。
(5)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。
(6)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。
(7)如(1)或⑵所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。
(8)如(1) (7)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于3 位和365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
(9)如(1) (8)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。
(10)变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。
(11)如(10)所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色
素Co
(12)编码(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。
(13)微生物，其保持(12)所述的DNA，产生(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者(10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。
(14)葡萄糖检测试剂盒，其包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、 (10)或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(1 所述的微生物。
(15)葡萄糖传感器，其包含(1) (9)中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、(10) 或(11)所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者(1 所述的微生物。
图1是表示葡萄糖传感器的结构的图。
图2是表示葡萄糖传感器的各试剂部的图。
图3是表示使用比色式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。
图4是表示使用电极式传感器的血糖测定中的葡萄糖浓度50mg/dL时的麦芽糖浓度(100mg/dL、200mg/dL、300mg/dL)对血糖值的影响的图。
图5是表示电极式葡萄糖传感器的结构的图。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
本发明的变异⑶H可以通过将特定的变异引入野生型⑶H的α亚单位来制造。野生型⑶H可例如是洋葱伯克霍尔德菌(BurWiolderia cepacia)产生的⑶H。洋葱伯克霍尔德菌的⑶H，例如是洋葱伯克霍尔德菌KSl株、JCIC800株或JCIC801株产生的⑶H。KSl 株在2000年9月25日以保藏号码为第FERM BP-7306保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)。
包含KSl株的⑶H α亚单位基因及β亚单位基因的一部分的染色体DNA片段的碱基序列如序列号1所示(美国专利申请公开第2004/0023330号)。该碱基序列中存在3 个开放阅读框(ORF)，从5 ‘末端侧开始第2及第3个ORF分别编码α亚单位(序列号3) 及β亚单位(序列号4)。另外，推测第1个ORF编码γ亚单位(序列号2)。另外，序列号5中示出含有β亚单位基因全长的片段的碱基序列。而且，β亚单位的氨基酸序列示于序列号6中(欧洲专利申请公开第1498484号)。推测序列号6中氨基酸号码1 22为信号肽。
另夕卜，除此之外，作为洋葱伯克霍尔德菌KSl株的GDH的同源物，新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia) J2315株的假定的氧化还原酶(putative oxidoreductase)(序列号 7)、Burkholderia thailandensis TXDOH 株的假定蛋白 BthaT-07876 (序列号8)、皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii) 12D株的FAD依赖型氧化还原酶(FAD dependent oxidoreductase)(序列号9)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)IP01609 株的跨膜脱氧酶(transmembrane dehydrogenase)(序列号10)及Burkholderia phytof irmans PsJN株的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶 (glucose-methanol-choline oxidoreductase)(序列号 11)的各 α 亚单位也可以禾口洋葱伯克霍尔德菌KSl株的GDH同样使用。
此外，关于序列号7 11所示的氨基酸序列，均在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的数据库中登录。各自的登录号码分别为序列号7为YP-002234347、序列号8为ZP-02370914、序列号9为 YP-002980762、序列号 10 为 YP-002260434、序列号 11 为 YP-001890482。
另外，新洋葱伯克霍尔德菌J2315 株以 LMG16656、ATCCBAA-245、CCM4899、 CCUG48434、NCTC13227 保藏。Burkholderia phytofirmans PsJN 株以 LMG22487、CCUG49060 保藏。
另外，作为和洋葱伯克霍尔德菌KSl株同属的洋葱伯克霍尔德菌株，来自例如 JCM2800, JCM28Ol、JCM5506, JCM5507, IF014595 的各 GDH 的 α 亚单位(序列号 I2 I6) 也可以和洋葱伯克霍尔德菌KS1株的⑶H同样地使用。此外，JCM2800、JCM2801、JCM5506及 JCM5507保存于日本独立行政法人理化学研究所微生物菌种保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM)。IF014595保存于日本财团法人发酵研究所(IFO)。
本发明的变异⑶H可以仅为α亚单位，也可以为α亚单位和β亚单位的复合体， α亚单位和γ亚单位的复合体，或包括α亚单位、β亚单位及Y亚单位的复合体。在本说明书中，将含有β亚单位的GDH复合体称为CyGDH，将不含β亚单位的GDH复合体称为 GDH0对于本发明的变异GDH而言，在任何情况下，在α亚单位中均引入特定的变异(3 位、365位及472位中的变异，或对应于这些位点的位置中的变异)，但是除该特定的变异之夕卜，也可以具有保守变异(保存的&変異)。另外，其它的亚单位可以为野生型，也可以具有保守的变异。需要说明的是，所谓“保守的变异”是指对GDH活性没有实质影响的变异。[0038]本发明的变异型α亚单位优选除上述特定的变异以外具有序列号3、7 11所示的氨基酸序列。另外，对于变异型α亚单位而言，只要具有GDH活性，也可以具有如上所述的保守的变异。即，可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列号3、7 11的氨基酸序列中，除了具有上述特定的变异之外，还取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基。此外，在序列号3中示出了可利用序列号1的碱基序列编码的氨基酸序列， 但是N末端的甲硫氨酸残基有可能会在翻译后脱落。上述所谓的“一个或多个”优选为1 10个、更优选为1 5个、特别优选为1 3个。此外，本发明的变异型α亚单位相对于序列号3中所示的氨基酸序列而言，具有至少80%、优选85%、更优选90%的氨基酸同一性。
另外，β亚单位典型地具有序列号6的氨基酸序列。但是，只要可以作为Cy⑶H 的β亚单位起作用，也可以为具有在包括序列号6的氨基酸号码23 425的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。另外，只要可以作为Cy⑶H的β亚单位起作用，也可以为具有KSl株以外的β亚单位及该β亚单位的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。上述所谓的“一个或多个”优选1 20个、更优选为1 10个、特别优选为1 5个。
此外，所谓的作为Cy⑶H的β亚单位起作用，是指在和α亚单位一起形成复合体时作为不损害该复合体的GDH活性的电子传递亚单位、即细胞色素C起作用。
作为野生型α亚单位基因，具体可例如包含包括序列号1的碱基号码764 2380 的碱基序列的DNA。另外，α亚单位基因也可以为具有包括序列号1中的碱基序列的碱基号码764 2380的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码具有⑶H活性的蛋白质的DNA。
另外，作为β亚单位基因，具体可例如包含包括序列号5的碱基号码187 1398 的碱基序列的DNA。另外，β亚单位基因也可以为具有包括序列号5的碱基号码187 1398的碱基序列的DNA，或者为与可由该序列制备的探针在严谨条件下杂交、并且编码可作为β亚单位起作用的蛋白质的DNA。
上述严谨条件可例如是具有优选80%、更优选90%以上、特别优选95%以上的同源性的DNA之间杂交的条件，具体可例如是0. 1XSSC、0. 1% SDS、60°C。
α亚单位基因及β亚单位基因例如可以利用以洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA为模板进行PCR来获取。PCR用引物可以基于上述的碱基序列通过化学合成来制备。 另外，还可以利用以基于上述序列制备的寡核苷酸为探针的杂交，由洋葱伯克霍尔德菌KSl 株的染色体DNA来获取。此外，也可以使用KSl株以外的新洋葱伯克霍尔德菌J2315株、 Burkholderia thailandensis TXDOH株、皮氏罗尔斯顿氏菌12D株、茄科雷尔氏菌IP01609 株及 Burkholderia phytof irmans PsJN 株。
对本发明的变异⑶H而言，通过使如上所述的野生型⑶H或具有保守的变异的⑶H 具有特定的变异，对葡萄糖的底物特异性提高。所谓“对葡萄糖的底物特异性提高”包含如下含义在实质上保持对葡萄糖的反应性的情况下，对其它单糖类、二糖类或低聚糖等糖类例如麦芽糖、半乳糖、木糖等的反应性下降；或对葡萄糖的反应性与对其它糖类的反应性相比提高了。例如，即使对葡萄糖的反应性下降，但对其它糖类的反应性也下降更多的话，则对葡萄糖的底物特异性是提高的。另外，即使对其它糖类的反应性升高，但对葡萄糖的底物特异性升高更多的话，则对葡萄糖的底物特异性提高。具体而言，例如，如果变异型酶相对野生型酶的底物特异性(对葡萄糖的比活性和对其它糖类例如麦芽糖的比活性之比)的提高(用下述式表示)为10%以上、优选20%以上、更优选40%以上，则对葡萄糖的底物特异性提高。例如，底物特异性在使用野生型酶为60%、使用变异型GDH时为40%的情况下，对葡萄糖的底物特异性升高了 33%。
底物特异性=(对葡萄糖以外的糖类的比活性/对葡萄糖的比活性)X 100
底物特异性的提高=(A-B) X100/A
A 野生型酶的底物特异性
B 变异型酶的底物特异性
另外，变异型⑶H对麦芽糖的反应性(比活性)为对葡萄糖的反应性(比活性) 的以下、优选0.5%以下。
较之优选在序列号3所示的氨基酸序列的相应于3 位及365位的氨基酸残基分别用谷氨酰胺及酪氨酸取代而472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比，本发明的变异型GDH 对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性下降。
本发明中的所谓变异，具体而言如下所述。
(1)序列号3所示的氨基酸序列的相应于3 位的丝氨酸残基被谷氨酰胺取代。
(2)序列号3所示的氨基酸序列的相应于365位的丝氨酸残基被酪氨酸取代。
(3)序列号3所示的氨基酸序列的相应于472位的丙氨酸残基被酪氨酸取代。
上述氨基酸取代变异的位置为序列号3(即洋葱伯克霍尔德菌KSl株的野生型 GDHa亚单位)的氨基酸序列中的位置，但是在序列号3的氨基酸序列中除上述特定的变异以外还具有取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的GDHa亚单位的同源物或变体中，在和序列号3的氨基酸序列的比对中，表示相当于上述氨基酸取代的位置的位置。例如，在1 364位的区域中具有1个氨基酸残基缺失的⑶Hα亚单位的保守变体中，所谓365位表示上述变体的364位。
在序列号7中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为同样的326 位、365位及472位。
在序列号8中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为3M位、 363位及470位。
在序列号9中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为327位、 366位及473位。
在序列号10中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为327位、 366位及473位。
在序列号11中，相应于序列号3的3 位、365位及472位的残基分别为322位、 361位及466位。
此外，对于序列号3所示的氨基酸序列而言，相对于序列号7 11，分别具有 96%、93%、82%、82%、63%的氨基酸序列同一性。
在以下的表1中，示出了序列号3、7 11的氨基酸序列比对。
[表1-1]
序列号 31 MADTDT--QKADVVVVGSGVAGAIVAHQLAMAGKAVILLEAGPRMPRWEI 48
序列号 71 MADTDT--QKADVVVVGSGVAGAIVAHQLAMAGKSVILLEAGPRMPRWEI 48
序列号 81 MAET——QQADVVVVGSGVAGAIVAHOLAMAGKSVILLEAGPRMPRWEI 46
序列号 91 MAQSEQTRQQADIVVVGSGVAGALVAYELARAGKSVLMLEAGPRLPRWEI 50
序列号 101 MADTRR-ADQADIVVVGSGVAGALVAYELARAGKSVLMLEAGPRLPRWEI 49
序列号 111 MANKNS——ADIVVVGSGVAGGLVAHQMALAGASVILLEAGPRIPRWQI 46
序列号 349 VERFRNQPDKMDFMAPYPSSPWAPHPEYGP-PNDYLILKGEHKFNSQYIR 97
序列号 749 VERFRNQPDKTDFMAPYPSSPWAPHPEYGP-PNDYLI LKGEHKFNSQY IR 97
序列号 847 VERFRNOPDKMDFMAPYPSSAWAPHPEYAP-PNDYLVLKGEHKFNSQYIR 95
序列号 951 VERFRNQADKMDFMAPYPSTAWAPHPEYGP-PNNYLVLKGEHQFNSQYIR 99
序列号 1050 VERFRNQADKMDFMAPYPSTPWAPHPEYGPSPNDYLVLKGEHKFDSQYIR 99
序列号 1147 VENFRNSPVKSDFATPYPSTPYAPHPEYAP-ANNYLIQKGDYPYSSQYLR 95
序列号 398 AVGGTTWHWAASAWRFIPNDFKMKSVYGVGRDWPIQYDDLEPYYORAEEE 147
序列号 798 AVGGTTWHWAASAWRF IPNDFKMKTVYGVARDWPIQYDDLEHWYQRAEEE 147
序列号 896 AVGGTTWHWAASAWRF IPNDFKMKTVYGVGRDWPIQYDDLEHFYQRAEEE 145
序列号 9100 AV6GTTWHWAASTWRFLPNDFKLRSVYGIARDWPIQYQDLERYYGLAEEA 149
序列号 10100 AVGGTTWHWAASTWRFLPNDFKLRSVYGIARDWPL0YDDLERDY6RAEAA 149
序列号 1196 LVG6TTWHWAAAAWRLLPSDFQLHKLYGVGRDWPYPYETLEPWYSAAEVQ 145
序列号 3148 LGVWGPGPEEDLYSPRKQPYPMPPLPLSFNEQTIKTALNNYDPKFHVVTE 197
序列号 7148 LGVWGPGPEEDLYSPRKQAYPMPPLPLSFNEQTIKSALNGYDPKFHVVTE 197
序列号 8146 LGVWGPGAEEDLLSPRKAPYPMPPLPLSYNERTIKTALNNHDPKYHVVTE 195
序列号 9150 LGVWGPN-DEDLGSPRSQPYPMTPLPLSFNERTIKEALNAHDASFHVVTE 198
序列号 10150 L6VWGPN-DEDLGSPRSQPYPMAPLPLSFNERTIKEALNAHDPAFHVVTE 198
序列号 11146 LGVSGPGNSIDL6SPRSKPYPMNPLPLSYMDQRFSDVLNAQG—FKVVPE 193
序列号 3198 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMPI CP IGAMYNGIVHVEKAERAGAKLIEN 247
序列号 7198 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEOAGAKLIDS 247
序列号 8196 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEQAGAKLIEN 245
序列号 9199 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGIVHVEKAEQAGARLIEN 248
序列号 10199 PVARNSRPYDGRPTCCGNNNCMP I CP IGAMYNGI VHVEKAEQAGARL IEN 248
序列号 11194 PVARNSRPYDARPTCCGNNNCMPI CP IAAMYNGVVHAEKAEQAGAKLIPE 243
序列号 3248 AVVYKLETGPDKRIVAALYKDKTGAEHRVEGKYFVLAANGIETPKILLMS 297
序列号 7248 AVVYKLETGPDKR IVAAIYKDKTGADHRVEGKYFVLAANGIETPKILLMS 297
序列号 8246 AVVHKLEVGPQKKIVAALYKDPKGAEHRVEGKYFVLAANGIETPKLMLMS 295
序列号 9249 AVVFKLEVGPNKRIVAARYKDSKGAEHRVEGKWFVLAANGI ETPKLMLMS 298
序列号 10249 AVVYKLEVGAGRRIVAAHYKDPKGVDHRVEGKWFVLAANGI ETPKLMLMS 298
序列号 11242 AVVYRVEADNKGLITAVHYKDPNGNSTRVTGKLFVLAANGI ETPKLMLMS 293
[表 1-2]
序列号 3298 ANRDFPNGVANSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYASEKLWPGRGPQEMTSLIG 347
序列号 7298 ANRDFPNGVANSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYANEKLWPGRGPOEMTSLIG 347
序列号 8296 TSHDFPNGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYASEKLWPGRGPQEMTSLIG 345
序列号 9299 TSQDFPKGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYADRKLWPGRGPQEMTSLIG 348
序列号 10299 TSEAFPRGVGNSSDMVGRNLMDHPGTGVSFYADRKLWPGRGPQEMTSLIG 348
序列号 11294 TSDKFPHGVGNSSDQVGRNLMDHPGTGVTFLANEALWPGRGPMEMTSIVN 343
序列号 3348 FRDGPFRATEAAKKIHLSNLSRIDQETQKIFKAGKLMKPDELDAQIRDRS 397
序列号 7348 FRDGPFRATEAAKK IHLSNMSRINOETQKIFKAGKLMKHEELDAOIRDRS 397
序列号 8346 FRDGPFRATEAAKK I HLSNLSR IDQETOKIFKAGKLLKPAELDAQIRDRS 395
序列号 9349 FRDGPFRATQAGKKLHLSNISRIEQETQRIFKEGKLIKPADLDARIRDOA 398
序列号 10349 FRDGPFRAMOAGKKLHLSNISRIEQETARIFKAGKLLKPAELDARIRDQA 398
序列号 11344 FRDGAFRSDYAAKKLHLSNGVPTMSVTADLLKK6—LTGAELDRQIRDRA 391
序列号 3398 ARYVQFDCFHEILPQPENRIVPSKTATDAIGIPRPEITYAIDDYVKRGAA 447
序列号 7398 ARYVQFDCFHE I LPQPENR I VPSKTATDA IGIPRPEITYAIDDYVKRGAV 447
序列号 8396 ARYVQFDCFHE I LPQPENR I VPSKTATDA IGIPRPEITYAI DDYVKRGAA 445
序列号 9399 ARYVQFDSFHEILPLPENRIVPSATEVDA161PRPEITYHIDDYVKRSAV 448
序列号 10399 ARYVQFDSFHE I LPLPENR IVPSATETDALGIPRPEITYRI DDYVKRSAV 448
序列号 11392 ARTLNINSFHEHLAEPQNRVVPSADHKDSLGI POPE IYYSINDYVKKSAA 441
序列号 3448 HTREVYATAAKVLGGTDVVFNDEFAPNNHITGSTIMGADARDSVVDKDCR 497
序列号 7448 HTREVYATAAKVLGGTDVVFNDEFAPNNH ITGATI MGADARDSVVDKDCR 497
序列号 8446 HTREVYASAAQVLGGTDVVFNDEFAPNNHITGATIMGADPRDSVVDKDCR 495
序列号 9449 HTREVYATAAQVMGGTNVEFHDDFAPNNHITGATIMGADPKDSVVDKDCR 498
序列号 10449 HTREVYATAAKVLGATDVQFHDDFAPNNHITGATSMGADPKDSVVDKDCR 498
序列号 11442 NTHELYAQIAALFGGAEVTFDDTFAPNNHIMGTTIMGSDPADSVVDADCR 49
序列号 3498 TFDHPNLFISSSATMPTVGTVNVTLTIAALALRMSDTLKKEV 539
序列号 7498 TFDHPNLF ISSSSTMPTVGTVNVTLTI AALALRMSDTLKKEV 539
序列号 8496 TFDHPNLF I SSSATMPTVGTVNVTLT IAALALRISDQLKKE 丨 537
序列号 9499 TFDHPNLF I SSSSTMPTVGTVNVTLT IAALALRIADQLKQEA 540
序列号 10499 TFDHPNLF I SSSATMPTVGTVNVTLT IAALALRIADRLKKEA 540
序列号 11492 THDHSNLFIASSGVMPTAASVNCTLTIAALSLKLADKLKREI 533
为了较之变异体葡萄糖脱氢酶(CyGDH(QY))而言增加对葡萄糖的底物特异性，本发明人使用遗传算法，对最佳的3 位、365位及472位的组合进行了研究。其结果发现了可以提高底物特异性的组合。
以下示出了本发明的变异型GDH的优选变异方式。
(数字表示氨基酸序列中的位置，氨基酸残基表示上述位置中的取代后的氨基酸残基，“ + ”表示同时具有2个氨基酸取代。)
326Gln+365Tyr+472Tyr
具有期望的变异的⑶Ha亚单位可通过如下方法来获取，利用位点特异性变异法，在编码⑶Ha亚单位的DNA(a亚单位基因)上，引入对应于期望的氨基酸变异的核苷酸变异，将获得的变异DNA用适当的表达体系来表达。另外，通过将编码变异GDHa亚单位的DNA、与编码β亚单位的DNA(i3亚单位基因)或β亚单位基因和编码Y亚单位的 DNA (Y亚单位基因)一起表达，可以获得变异Cy⑶H复合体。此外，向编码⑶Ha亚单位的 DNA引入变异，也可以使用将Y亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段。[0073]可以通过如下方法来确定引入了变异的⑶Ha亚单位或Cy⑶H复合体的底物特异性，即，利用实施例中记载的方法，研究对各种糖类的反应性，并和野生型GDHa亚单位或野生型Cy⑶H复合体的反应性相比较。
对于将γ亚单位、α亚单位及β亚单位依次编码的多顺反子DNA片段，可以利用例如以洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA为模板、将具有序列号19、20的碱基序列的寡核苷酸作为引物的PCR来获取(参照后述实施例)。
作为用于获取GDH的各亚单位的基因、引入变异、表达基因等的载体，可举出例如通过hcherichia属细菌起作用的载体，具体可例如φ^χ^θΑ、pBR322、pUC18、pUC118、 pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等。作为用于基因表达的启动子，可例如lac、trp、tac、 trc、Pptet、W10A等。另外，通过在包含启动子的表达载体的适当位点插入α亚单位基因或其它亚单位基因，由此可以在同一步骤中进行向这些基因的载体的插入和启动子的连接。作为如上所述的表达载体，可例如φ χ^θΑ,ρΒΙικ^α ρΙρΚΙ^ΖβΙ等。
另外，α亚单位基因或其它亚单位基因可以以能够表达的方式整合进宿主微生物的染色体DNA中。
在使用重组载体转化微生物时，可例如利用钙处理的感受态细胞法、原生质粒法或电穿孔法等。
宿主微生物可例如是枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌、酿酒酵母等酵母、黑曲霉等丝状真菌，但是不限于这些，只要是适合生产异源蛋白质的宿主微生物就可以使用。
本发明的变异α亚单位或变异Cy⑶H复合体或者对其进行表达的微生物，可以作为葡萄糖传感器的酶电极、或葡萄糖的检测试剂盒的构成要素来使用。使用洋葱伯克霍尔德菌的野生型GDH的葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒在美国专利公开第 2004/0023330Α1中有记载。本发明的变异⑶H也可以同样操作来使用。
实施例
下面，举出实施例进一步具体地说明本发明，但是本发明不限定于这些实施例。
实施例1表达洋葱伯克霍尔德菌的GDH或CWDH的质粒
准备表达⑶H的α亚单位及γ亚单位的质粒作为表达洋葱伯克霍尔德菌的⑶H 的质粒，并且，准备表达α亚单位、β亚单位及γ亚单位的质粒作为表达Cy⑶H的质粒。
<1>表达⑶H的α亚单位及γ亚单位的质粒
使用了W002/036779(对应于 EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703A)中记载的质粒ρΤιχ99Α/γ + α作为表达α亚单位及Υ亚单位的质粒。该质粒为将从洋葱伯克霍尔德菌KSl株(FERM ΒΡ-7306)染色体DNA中分离的、连续包含⑶H γ亚单位结构基因和α 亚单位结构基因的DNA片段，插入作为载体pTrc99A的克隆位点的Ncol/Hindlll中而形成的质粒。本质粒中的⑶H γ α基因利用trc启动子来控制。pTrc99A/Y + a保持有氨苄青霉素抗性基因。
利用以上述质粒pTrc99A/γ + α为模板，以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行 PCR，对包含在GDH的α亚单位C末端附加了 6个组氨酸残基的DNA片段的整个质粒进行扩增。
[正向引物]
5，-ACCACCACTGATAAGGAGGTCTGACCGTGCGGAAATCTAC-3，(序列号 17)[0089][反向引物]
5‘ -AGCCTGTGCGACTTCTTCCTTCAGCGATCGGTGGTGGTGG-3‘(序列号 I8)
将扩增得到的片段两端进行平末端化后，将5’末端磷酸化，利用连接反应进行环状化。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5 α，采集在包含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA 片段，确认了约2. 11Λ的插入片段。本质粒中GDH的各结构基因利用trc启动子来控制。本质粒保持有氨苄青霉素抗性基因。
<2>表达Cy⑶H的α亚单位、β亚单位及Y亚单位的质粒
按如下操作来制备表达Cy⑶H的α亚单位、β亚单位及、亚单位的质粒。
(1)来自洋葱伯克霍尔德菌KSl株的染色体DNA的制备
依照通常方法，由洋葱伯克霍尔德菌KSl株来制备染色体基因。即，使用TL液体培养基(聚蛋白胨log、酵母提取液lg、NaCl 58、1(吐 0428、葡萄糖58;11^ !1 7. 2)，将该菌株在34°C下振荡一晚。通过离心分离回收增殖的菌体。将该菌体悬浮在包含IOmM的NaCl、 20mM 的 Tris-HCl (pH 8. 0) UmM 的 EDTA、0. 5%的 SDSUOO μ g/ml 的蛋白酶 K 的溶液中，在 50°C处理6小时。在其中添加等量的苯酚-氯仿并在室温下搅拌10分钟，然后，通过离心分离回收上清液。向其中添加醋酸钠，使最终浓度达到0. 3M，用2倍量的乙醇进行分层，使染色体DNA在中间层析出。将其用玻璃棒捞出，用70%的乙醇洗涤后，使其溶解在适量的 TE缓冲剂中，制成染色体DNA溶液。
(2)编码Cy⑶H的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段的制备
利用以上述染色体DNA为模板、以具有以下序列的寡核苷酸为引物进行PCR，扩增编码Cy⑶H的γ亚单位、α亚单位及β亚单位的DNA片段。
[正向引物]
5，-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3，(序列号 19)
[反向引物]
5，-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3，(序列号 20)
将扩增得到的片段的C末端侧进行平末端化后，用NcoI对N末端侧进行消化，在经同样处理的pTrc99A上进行连接。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5 α，采集在包含氨苄青霉素50 μ g/mL的LB琼脂培养基中产生的菌落。将获得的转化体用液体LB培养基培养并提取质粒，分析该插入DNA片段，确认了约3. 81Λ的插入片段。将本质粒命名为 pTrc99A γ α β。本质粒中的Cy⑶H的各结构基因利用trc启动子来控制。pTrc99A γ α β 保持有氨苄青霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因。
实施例2通过向CWDHa亚单位基因引入变异对底物相互作用位点的探索
(1)向3 位、365位及472位引入变异
在实施例1中获得的pTrc99A γ α β所含有的⑶H α亚单位基因上，以使编码该基因的α亚单位的3 位的丝氨酸残基、365位的丝氨酸残基、及472位的丙氨酸残基被取代为其它氨基酸残基的方式引入变异。
具体而言，使用市售的位点特异性变异引入试剂盒(Stratagenc公司， QuikChangell Site-Directed Mutagenesis Kit)，将实施例 1 记载的质粒 pTrc99A/γ + α 及pTrc99AY α β中含有的⑶Ha亚单位基因的幻6位的丝氨酸的密码子(TCG)、365位的丝氨酸的密码子(TCG)、及472位的丙氨酸的密码子(GCG)取代成其它氨基酸的密码子。
用于上述氨基酸残基取代的正向引物及反向引物的序列示于下表2。另外，用于制备3个变异的反向引物示于表3。
此外，在表示变异的表述中，数字表示氨基酸序列中的位置，数字前的字母表示氨基酸取代前的氨基酸残基，数字后的字母表示氨基酸取代后的氨基酸残基。例如，R53F表示53位由精氨酸向苯基丙氨酸的取代。
对于PCR反应而言，使用下文中的反应组成，在95°C、30秒后，重复15次95°C、30 秒；55°C、1分钟；68°C、8分钟的循环，在68°C进行30分钟的反应后，在4°C下保持。
[反应液组成]
模板 DNA (5ng4il)2μ1
(3 变异引入 pTrc99A/y+a 及 ρΤ 99Αγαβ) IOx反应缓冲液5μ1
正向引物(lOOng/μΙ)1.25μ1
反向引物(lOOng/μΙ)1.25μ1
dNTPΙμ
蒸馏水38.5μ1
DNA聚合酶Ιμ
合计50μ1
PCR反应后，在反应液中添加0. 5 μ 1的Dpnl，在37°C下孵育1小时，使模板质粒分解。
使用获得的反应液转化大肠杆菌DH5a (SUpE44，Δ lacU169 (Φ801βοΖ ΔΜ15), hsdR17，recAi，endAl，gyrA96，thi-1, relAl)的感受态细胞。由数个在包含氨苄青霉素 (50yg/ml)及卡那霉素(30yg/ml)的LB琼脂培养基(细菌用胰蛋白胨1 %、酶提取液 0. 5%,NaCl 1%、琼脂1. 5% )上生长的菌落制备质粒DNA，进行序列分析，确认了在⑶Hα 亚单位基因中引入了目标变异。
[表2]
权利要求
1.变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80%的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于所述氨基酸序列的相应于3 位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代；对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
2.如权利要求
1所述的变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少90%的同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号7所示的氨基酸序列。
5.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号8所示的氨基酸序列。
6.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号9所示的氨基酸序列。
7.如权利要求
1或2所述的变异葡萄糖脱氢酶，其中，相应于3 位、365位及472位的位置以外具有序列号10所示的氨基酸序列。
8.如权利要求
1 7中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，与所述氨基酸序列中相应于3 位及365位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺及酪氨酸取代但472位未被取代的葡萄糖脱氢酶相比较，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
9.如权利要求
1 8中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶，其特征在于，二糖类为麦芽糖。
10.变异葡萄糖脱氢酶复合体，其至少包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶和电子传递亚单位。
11.如权利要求
10所述的葡萄糖脱氢酶复合体，其特征在于，电子传递亚单位为细胞色素C。
12.编码权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶的DNA。
13.微生物，其保持权利要求
12所述的DNA，产生权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶或者权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体。
14.葡萄糖检测试剂盒，其包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求
13所述的微生物。
15.葡萄糖传感器，其包含权利要求
1 9中任一项所述的变异葡萄糖脱氢酶、权利要求
10或11所述的变异葡萄糖脱氢酶复合体、或者权利要求
13所述的微生物。
专利摘要
本发明提供了一种变异葡萄糖脱氢酶，其具有和序列号3有至少80％的同一性的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性，其特征在于，所述氨基酸序列的相应于326位、365位及472位的氨基酸残基分别被谷氨酰胺、酪氨酸及酪氨酸取代，对葡萄糖的底物特异性提高，对二糖类的反应性降低。
文档编号C12Q1/02GKCN102453702SQ201110404251
公开日2012年5月16日 申请日期2011年10月27日
发明者小岛胜博, 早出广司 申请人:爱科来株式会社, 生物工程实验室有限责任公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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