一种互花米草的抑制剂及其制备方法
专利名称:一种互花米草的抑制剂及其制备方法
一种互花米草的抑制剂及其制备方法技术领域：
[0001]本发明涉及一种微生物抑制剂，尤其是涉及一种互花米草的抑制剂及其制备方法。
背景技术：
[0002]互花米草(Spartina alterniflora)隶属禾本科，米草属的多年生草本植物，原产美洲大西洋沿岸，是潮间带滩涂生长的一种多年生植物。互花米草植株粗壮高大，根系发达，地面高度一般可达1. 0-2. 0m，根系深入土壤中可达1. 5m左右，具有较强的抗风消浪、保滩护岸、促淤造陆、绿化海滩的作用，20世纪初被许多国家引种。1979年从美国引入我们国家用作保滩护提植物，先是在江苏试种成功，1980年又引入福建，1982年扩种到江苏、广东、广西、浙江和山东等地。但是由于互花米草适应性广，抗逆性强、繁殖速度快，同时又缺乏天敌，植株高而密，与本地种竞争强烈，迅速在全国沿海各地滋生蔓延，形成单一外来入侵优势群落，给沿海地区的自然生态系统、生物多样性、环境资源和生态安全等带来一系列负面影响。2003年被国家环保局列入16种中国第一批外来入侵名单。[0003]目前控制互花米草的措施主要有[0004]1)物理控制方法通过人工或机械的措施清除，如拔除、翻耕、遮盖、水淹、別割等。但是此种方法不仅消耗大量人力物力，效率较低，而且成本较高。[0005]2)化学方法使用化学除草剂，如草甘膦、咪唑烟酸和米草星等。但是化学方法通常只能清除地表以上部分，而且造成严重环境污染问题，并且植物对化学除草剂易产生抗药性和耐性。[0006]3)生物防治运用互花米草的天敌，生物替代或者植物微生物病原菌的方法。如在其原产地美国发现食草昆虫叶蝉和玉螺能啃食互花米草，但是它们只对部分个体有效且越冬成活率低。另外利用无瓣海桑等来替代互花米草，可能会受地域限制。[0007]由于利用植物病原菌来防止杂草和外来植物投资少，专一性强，对环境安全、不产生污染等优点，所以微生物除草剂的研究成为一个热点，目前已经商品化的微生物除草剂有DeVine和Collego等七种。我国早在20世纪60、70年代就开始使用微生物除草剂“鲁保一号”，是利用盘长孢菌去除大豆菟丝子草，取得了很好的效果。目前，已经报道的可以作为微生物除草剂的真菌有镰孢菌属、链格孢菌属和盘孢菌属等九种。南京农业大学已经申请的专利是利用一种镰孢菌的孢子防治水花生(公开号CN1491563A)，中国水稻研究所利用蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵产生和提取的粗毒素具有防治杂草和防治稻纹枯病的作用(公开号CN1884559A)，另外还有上海交通大学利用链格孢菌的孢子制成的制剂对水葫芦有较好的防治作用(公开号CN1759685A)和利用弯孢霉的孢子作用于马唐(浙江农业科学院， 公开号CN1994092A;中国农业大学，公开号CN101810202A)等，但以上的研究均没有涉及到胶孢镰孢菌对互花米草的抑制。尽管有研究者在美国华盛顿Willapa海湾互花米草的种子中发现了麦角菌，可以使互花米草感染麦角病，减少种子的形成，但是互花米草繁殖能力较强，目前还未见微生物有效抑制互花米草的报道，因此寻找一种有效的控制互花米草的3病原菌对控制外来物种互花米草具有重要的意义，也具有极大的市场前景。
发明内容
[0008]本发明的目的旨在提供一种互花米草的抑制剂及其制备方法。[0009]所述互花米草的抑制剂为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。[0010]所述互花米草的抑制剂的制备方法如下[0011]将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。[0012]所述胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号3. 4730。所述培养基可为马铃薯葡萄糖液体培养基，或马铃薯葡萄糖琼脂培养基等；[0013]所述培养，可将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中25 培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，25 培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后离心，去上清液，再用无菌水悬浮离心，清洗后用加有吐温80的无菌水悬浮，即得孢子液；所述离心可在3000rpm下离心15min ；所述过滤可采用纱布过滤。[0014]使用时，将互花米草的抑制剂(孢子液)离心清洗后用 5%的吐温80或无菌水稀释，再喷洒于20 30cm高的植物叶片上或注射于植物根部，3天后与对照组进行植物叶片变化的比较，10 25天后观察植物的生长状况，对照组加同体积无菌水或同浓度同体积吐温80做同样处理。结果叶片变黄，逐渐枯萎。[0015]所述互花米草的微生物抑制剂是由胶孢镰孢菌的孢子和无菌水组成的悬浮液，所述胶孢镰孢菌的孢子的含量为每毫升无菌水中含有IO6 IO7个胶孢镰孢菌的孢子。[0016]所述互花米草的微生物抑制剂的有效物质为胶孢镰孢菌的孢子，所述胶孢镰孢菌的孢子呈长卵圆形，两端渐细，无串生着生的。[0017]将所述互花米草的微生物抑制剂作用于互花米草后，可使互花米草的植株叶片变黄，逐渐枯萎。
[0018]图1为本发明胶孢镰孢菌孢子的SEM图。在图1中，标尺为5 μ m。[0019]图2为实施例4中不同培养时间的胶孢镰孢菌对互花米草叶片的感染程度测定图。在图3中，横坐标为时间Time/h，纵坐标为感染程度DS/%。
具体实施方式
[0020]将所述互花米草的微生物抑制剂作用于20 30cm高的互花米草，10 25天后植株叶片变黄，逐渐枯萎。[0021]以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但这并不对本发明构成任何意义上的限定。[0022]实施例1[0023]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，28°C培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后在3000rpm下离心15min，倒掉上清液，再用无菌水悬浮离心，如此清洗3次，然后用加有1 %吐温80的无菌水悬浮，调整孢子数为IO7个/mL，所得胶孢镰孢菌孢子的SEM图参见图1。之后用喷瓶喷洒到高25cm 左右的互花米草活体植株的叶片上，对照组用同体积加有吐温80的无菌水对互花米草做同样处理，10天后观察结果，结果发现叶片较对照组变黄。[0024]实施例2[0025]将孢子悬浮液用2mL无菌一次性注射器注射于互花米草根部，20天后互花米草相对于对照组枯萎死亡。[0026]实施例3[0027]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体中培养9天，然后将培养液两层纱布过滤去掉菌丝体，之后再将滤液用滤纸过滤去掉孢子，把得到的滤液烘干，然后再用适量去离子水溶解，将溶解液刺破喷洒于高25cm左右的互花米草活体植株的叶片上，另外将同样的培养液用纱布过滤得孢子液，之后同样刺破喷洒于高25cm左右的互花米草活体植株的叶片上，结果发现，前者作用效果不明显，后者孢子悬浮液处理的互花米草叶片变黄，并逐渐枯萎。[0028]实施例4[0029]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养15天，然后从第一天开始每隔一天取2mL发酵液加入到放在平板中的叶片中，具体做法为将培养皿中铺一张滤纸加入2mL无菌水，放入几段无菌水清洗过的叶片，取2mL的培养一定时间的胶孢镰孢菌培养液加入平板中。马铃薯培养基做三瓶平行样，一瓶不接种胶孢镰孢菌的马铃薯葡萄糖液体培养基做对照，并且每瓶做3个离体叶片平板实验。三天后即对照组离体叶片开始变黄时，统计结果，以感染程度disease severity (DS，植物组织发生症状的百分率，Yasser Μ. Shabana et al. ,2010)表示。结果发现在培养第9天的时候感染程度最严重(参见图 2)。[0030]实施例5[0031]将胶孢镰孢菌分别按接种量1 %，4%，7%进行接种在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养9天，之后取2mL作用于互花米草叶片(方法同实施例4)，3天后统计结果，最后效果都差不多，4%接种量的效果相对好一点(见表1)。[0032]表 1[0033]
权利要求
1.一种互花米草的抑制剂，其特征在于为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。
2.如权利要求
1所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。
3.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
4.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述培养，是将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中25 培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，25 培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后离心，去上清液，再用无菌水悬浮离心，清洗后用加有吐温80的无菌水悬浮，即得孢子液。
5.如权利要求
4所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述离心是在 3000rpm 下离心 15min。
6.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述过滤采用纱布过滤。
专利摘要
一种互花米草的抑制剂及其制备方法，涉及一种微生物抑制剂。所述互花米草的抑制剂为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。使用时，将互花米草的抑制剂(孢子液)离心清洗后用1％～5％的吐温80或无菌水稀释，再喷洒于20～30cm高的植物叶片上或注射于植物根部，3天后与对照组进行植物叶片变化的比较，10～25天后观察植物的生长状况，对照组加同体积无菌水或同浓度同体积吐温80做同样处理。结果叶片变黄，逐渐枯萎。
文档编号A01P13/02GKCN102511505SQ201110408414
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日
发明者何宁, 卢英华, 李清彪, 王远鹏, 董国文, 龚丽博 申请人:厦门大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
一种互花米草的抑制剂及其制备方法技术领域：
[0001]本发明涉及一种微生物抑制剂，尤其是涉及一种互花米草的抑制剂及其制备方法。
背景技术：
[0002]互花米草(Spartina alterniflora)隶属禾本科，米草属的多年生草本植物，原产美洲大西洋沿岸，是潮间带滩涂生长的一种多年生植物。互花米草植株粗壮高大，根系发达，地面高度一般可达1. 0-2. 0m，根系深入土壤中可达1. 5m左右，具有较强的抗风消浪、保滩护岸、促淤造陆、绿化海滩的作用，20世纪初被许多国家引种。1979年从美国引入我们国家用作保滩护提植物，先是在江苏试种成功，1980年又引入福建，1982年扩种到江苏、广东、广西、浙江和山东等地。但是由于互花米草适应性广，抗逆性强、繁殖速度快，同时又缺乏天敌，植株高而密，与本地种竞争强烈，迅速在全国沿海各地滋生蔓延，形成单一外来入侵优势群落，给沿海地区的自然生态系统、生物多样性、环境资源和生态安全等带来一系列负面影响。2003年被国家环保局列入16种中国第一批外来入侵名单。[0003]目前控制互花米草的措施主要有[0004]1)物理控制方法通过人工或机械的措施清除，如拔除、翻耕、遮盖、水淹、別割等。但是此种方法不仅消耗大量人力物力，效率较低，而且成本较高。[0005]2)化学方法使用化学除草剂，如草甘膦、咪唑烟酸和米草星等。但是化学方法通常只能清除地表以上部分，而且造成严重环境污染问题，并且植物对化学除草剂易产生抗药性和耐性。[0006]3)生物防治运用互花米草的天敌，生物替代或者植物微生物病原菌的方法。如在其原产地美国发现食草昆虫叶蝉和玉螺能啃食互花米草，但是它们只对部分个体有效且越冬成活率低。另外利用无瓣海桑等来替代互花米草，可能会受地域限制。[0007]由于利用植物病原菌来防止杂草和外来植物投资少，专一性强，对环境安全、不产生污染等优点，所以微生物除草剂的研究成为一个热点，目前已经商品化的微生物除草剂有DeVine和Collego等七种。我国早在20世纪60、70年代就开始使用微生物除草剂“鲁保一号”，是利用盘长孢菌去除大豆菟丝子草，取得了很好的效果。目前，已经报道的可以作为微生物除草剂的真菌有镰孢菌属、链格孢菌属和盘孢菌属等九种。南京农业大学已经申请的专利是利用一种镰孢菌的孢子防治水花生(公开号CN1491563A)，中国水稻研究所利用蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵产生和提取的粗毒素具有防治杂草和防治稻纹枯病的作用(公开号CN1884559A)，另外还有上海交通大学利用链格孢菌的孢子制成的制剂对水葫芦有较好的防治作用(公开号CN1759685A)和利用弯孢霉的孢子作用于马唐(浙江农业科学院， 公开号CN1994092A;中国农业大学，公开号CN101810202A)等，但以上的研究均没有涉及到胶孢镰孢菌对互花米草的抑制。尽管有研究者在美国华盛顿Willapa海湾互花米草的种子中发现了麦角菌，可以使互花米草感染麦角病，减少种子的形成，但是互花米草繁殖能力较强，目前还未见微生物有效抑制互花米草的报道，因此寻找一种有效的控制互花米草的3病原菌对控制外来物种互花米草具有重要的意义，也具有极大的市场前景。
发明内容
[0008]本发明的目的旨在提供一种互花米草的抑制剂及其制备方法。[0009]所述互花米草的抑制剂为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。[0010]所述互花米草的抑制剂的制备方法如下[0011]将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。[0012]所述胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号3. 4730。所述培养基可为马铃薯葡萄糖液体培养基，或马铃薯葡萄糖琼脂培养基等；[0013]所述培养，可将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中25 培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，25 培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后离心，去上清液，再用无菌水悬浮离心，清洗后用加有吐温80的无菌水悬浮，即得孢子液；所述离心可在3000rpm下离心15min ；所述过滤可采用纱布过滤。[0014]使用时，将互花米草的抑制剂(孢子液)离心清洗后用 5%的吐温80或无菌水稀释，再喷洒于20 30cm高的植物叶片上或注射于植物根部，3天后与对照组进行植物叶片变化的比较，10 25天后观察植物的生长状况，对照组加同体积无菌水或同浓度同体积吐温80做同样处理。结果叶片变黄，逐渐枯萎。[0015]所述互花米草的微生物抑制剂是由胶孢镰孢菌的孢子和无菌水组成的悬浮液，所述胶孢镰孢菌的孢子的含量为每毫升无菌水中含有IO6 IO7个胶孢镰孢菌的孢子。[0016]所述互花米草的微生物抑制剂的有效物质为胶孢镰孢菌的孢子，所述胶孢镰孢菌的孢子呈长卵圆形，两端渐细，无串生着生的。[0017]将所述互花米草的微生物抑制剂作用于互花米草后，可使互花米草的植株叶片变黄，逐渐枯萎。
[0018]图1为本发明胶孢镰孢菌孢子的SEM图。在图1中，标尺为5 μ m。[0019]图2为实施例4中不同培养时间的胶孢镰孢菌对互花米草叶片的感染程度测定图。在图3中，横坐标为时间Time/h，纵坐标为感染程度DS/%。
具体实施方式
[0020]将所述互花米草的微生物抑制剂作用于20 30cm高的互花米草，10 25天后植株叶片变黄，逐渐枯萎。[0021]以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但这并不对本发明构成任何意义上的限定。[0022]实施例1[0023]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，28°C培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后在3000rpm下离心15min，倒掉上清液，再用无菌水悬浮离心，如此清洗3次，然后用加有1 %吐温80的无菌水悬浮，调整孢子数为IO7个/mL，所得胶孢镰孢菌孢子的SEM图参见图1。之后用喷瓶喷洒到高25cm 左右的互花米草活体植株的叶片上，对照组用同体积加有吐温80的无菌水对互花米草做同样处理，10天后观察结果，结果发现叶片较对照组变黄。[0024]实施例2[0025]将孢子悬浮液用2mL无菌一次性注射器注射于互花米草根部，20天后互花米草相对于对照组枯萎死亡。[0026]实施例3[0027]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体中培养9天，然后将培养液两层纱布过滤去掉菌丝体，之后再将滤液用滤纸过滤去掉孢子，把得到的滤液烘干，然后再用适量去离子水溶解，将溶解液刺破喷洒于高25cm左右的互花米草活体植株的叶片上，另外将同样的培养液用纱布过滤得孢子液，之后同样刺破喷洒于高25cm左右的互花米草活体植株的叶片上，结果发现，前者作用效果不明显，后者孢子悬浮液处理的互花米草叶片变黄，并逐渐枯萎。[0028]实施例4[0029]将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养15天，然后从第一天开始每隔一天取2mL发酵液加入到放在平板中的叶片中，具体做法为将培养皿中铺一张滤纸加入2mL无菌水，放入几段无菌水清洗过的叶片，取2mL的培养一定时间的胶孢镰孢菌培养液加入平板中。马铃薯培养基做三瓶平行样，一瓶不接种胶孢镰孢菌的马铃薯葡萄糖液体培养基做对照，并且每瓶做3个离体叶片平板实验。三天后即对照组离体叶片开始变黄时，统计结果，以感染程度disease severity (DS，植物组织发生症状的百分率，Yasser Μ. Shabana et al. ,2010)表示。结果发现在培养第9天的时候感染程度最严重(参见图 2)。[0030]实施例5[0031]将胶孢镰孢菌分别按接种量1 %，4%，7%进行接种在马铃薯葡萄糖液体培养基中培养9天，之后取2mL作用于互花米草叶片(方法同实施例4)，3天后统计结果，最后效果都差不多，4%接种量的效果相对好一点(见表1)。[0032]表 1[0033]
权利要求
1.一种互花米草的抑制剂，其特征在于为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。
2.如权利要求
1所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。
3.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
4.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述培养，是将胶孢镰孢菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中25 培养，3天后转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，25 培养15天后，用无菌水清洗孢子，之后离心，去上清液，再用无菌水悬浮离心，清洗后用加有吐温80的无菌水悬浮，即得孢子液。
5.如权利要求
4所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述离心是在 3000rpm 下离心 15min。
6.如权利要求
2所述的一种互花米草的抑制剂的制备方法，其特征在于所述过滤采用纱布过滤。
专利摘要
一种互花米草的抑制剂及其制备方法，涉及一种微生物抑制剂。所述互花米草的抑制剂为胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)的孢子液。将胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)在培养基中培养，过滤后得孢子液，即为互花米草的抑制剂。使用时，将互花米草的抑制剂(孢子液)离心清洗后用1％～5％的吐温80或无菌水稀释，再喷洒于20～30cm高的植物叶片上或注射于植物根部，3天后与对照组进行植物叶片变化的比较，10～25天后观察植物的生长状况，对照组加同体积无菌水或同浓度同体积吐温80做同样处理。结果叶片变黄，逐渐枯萎。
文档编号A01P13/02GKCN102511505SQ201110408414
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日
发明者何宁, 卢英华, 李清彪, 王远鹏, 董国文, 龚丽博 申请人:厦门大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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