一种羧肽酶(AusCpA)基因的克隆及重组酶的制备的制作方法
专利名称:一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备的制作方法
一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备技术领域：
[0001]本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶基因工程菌的构建，以其重组羧肽酶的表达及酶活测定方法，属于生物工程技术领域：
。
背景技术：
[0002]羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。[0003]曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其发明专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima 等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶0，酶活为463. 0mkat/kg(27. 780U/mg)。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。[0004]基因工程羧肽酶纯度高、不含其他蛋白酶，不含动物源性的任何物质，终产物不需进行病毒等的检疫等，不含胰蛋白酶抑制剂-PMSF，同时，利用基因工程菌生产羧肽酶不受动、植物原料来源的限制、不表达需要大面积的占地种植，也不受季节气候的影响，不破坏资源，不污染环境，是一种安全、高效、高产、高质的高新技术。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白酶Sl家族，命名为Aus CpA, 相应的基因序列命名为Aus cpA0 Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济价值。[0006]本发明的技术方案一种来源于A.USamii EOOl的羧肽酶，其全基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，全基因获取的过程如图1所示。[0007]A.usamii EOOl已在文献
宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn II在不同毕赤酵母中的分泌表达，生物加工过程，第6卷第2期，2008年3月
中公开，本发明人承诺该微生物在20 年内向公众发放。[0008]所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。[0009]所述的羧肽酶基因的克隆及表达方法[0010](I)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0011]首先对Aspergillus terreus>Aspergi 1 Ius clavatus禾口 AspergiIlus niger 的羧肽酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；[0012]AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘[0013]AucpA-3F2 5‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘[0014]提取A. usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行RT-PCR，经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因3'端cDNA序列。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0015](2)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0016]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；[0017]AucpA-5Rl 5‘ -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘[0018]AucpA-5R2 5‘ -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘[0019]按照TaKafei生产的5' -Full RACE Kit中的说明书进行5‘ -RACE，最后经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因5'端cDNA序列，将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5'，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0020](3)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成[0021]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl为引物进行第一轮PCR，T-PrimerF和AucpA_R2为引物第二轮PCR，经过两轮PCR得到羧肽酶基因 5'端调控序列，将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列。[0022](4)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列的合成[0023]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增3‘端调控序列的正向弓丨物 AucpA-F 1 禾口 AucpA-F2 ；[0024]AucpA-Fl 5' -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘[0025]AucpA-F2 5' -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘[0026]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-Fl为引物进行第一轮PCR ；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA-F2为引物进行第二轮 PCR;将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列。[0027](5)A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析[0028]将Aus cpA的5'端cDNA与3'端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus cpA的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测和PolyA加尾信号预测。[0029](6)A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列的测定[0030]以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA_F3 禾口 AucpA-R ；[0031]AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；[0032]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGCAG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；[0033]以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行PCR， 将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用 DNAMAN 6. 0进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列。[0034](7)构建含有编码A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒[0035]以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和 AucpA-R ；[0036]AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；[0037]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；[0038]按照TaKafci 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮PCR ；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR ；将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA,经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。[0039]将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA (图 2)，并对重组质粒进行序列测定。[0040](8)GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定[0041]用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选， 得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。[0042]本发明的优点[0043]本发明提供了一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达及活性测定方法。该羧肽酶具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济意义，也为其它羧肽酶的研究奠定了理论基础。
[0044]图1 获取A. usamiiAus cpA全基因序列的流程图[0045]图2 重组质粒pPIC9K_Aus cpA构建示意图具体实施方式
[0046]实施例1A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0047]按照TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和 AucpA-3Fl 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 个循环； 72°C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA_F2为引物进行第二轮 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 个循环；72°C, IOmin)；将两轮PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0048]实施例2A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0049]按照TaKaRa 生产的 5' -Full RACE Kit 中的说明书进行 5' -RACE 以 5' RACE Outer Primer 和 AucpA_5Rl 为引物进行第一轮 PCR (94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C， lmin，30 个循环；72°C，IOmin)；以第一轮的 PCR 产物为模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5-R2 为引物进行第二轮 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，51°C，30s，72°C，lmin，30 个循环； 72°C,10min)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamiiEOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0050]实施例3A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成[0051]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl为引物进行第一轮 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA_R2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin ； 94 °C，30s，51 °C，30s，72 °C，Imin，30 个循环；72 °C，1 Omin)；将两轮 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列。[0052]实施例4A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列的合成[0053]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA_3Fl为引物进行第一轮 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA_F2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin ； 940C，30s, 470C，30s, 72°C，lmin30s, 30 个循环；72°C, IOmin)；将两轮 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AuCpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列。[0054]实施例5A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析[0055]将AucpA的5 ‘端cDNA与3 ‘端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出AucpA 的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启云力子区域预测(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信号预测(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)。[0056]实施例6A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列的测定[0057]以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行 PCR(94°C，4min ；94°C，30s，53°C，30s，72°C，2min，30 个循环；72°C，IOmin)，将 PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6. O 进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列。[0058]实施例7构建含有编码A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒[0059]按照TaKafci 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 °C， IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30个循环；72°C，10min)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA,并对重组质粒进行序列测定。[0060]实施例8GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定[0061]用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选， 得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
权利要求
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的羧肽酶，其完整的基因序列为 SEQ ID NO :1ο
2.如权利要求
1所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQID NO :2。
3.A. usamii EOOl羧肽酶基因全基因序列获得的方法(1)A.usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成首先对 Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus 禾口 Aspergillus niger 的羧妝酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘AucpA-3F2 5 ‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O中的说明书进行RT-PCR 以Oligo dT-AdaptorPrimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13PrimerM4和AucpA_3Fl 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 48 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 "C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA_F2为引物进行第二轮 PCR(940C，2min ；94°C，30s, 48°C，30s, 72°C，90s, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列；(2)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；AucpA-5Rl 5' -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘AucpA-5R2 5' -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘按照 TaKaRa 生产的 5‘ -Full RACE Kit 中的说明书进行5' -RACE:以5' RACE Outer Primer和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin，30 个循环；72°C, IOmin)；以第一轮的 PCR 产物为模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5_R2 为引物进行第二轮 PCR(94 °C，3min ； 94°C，30s，51°C，30s, 72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接， 转化JM109获重组质粒pUCm-T-AuCpA5 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列；(3)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94"C，4min ；94°C，30s, 47"C，30s, 72"C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA_R2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin -MV, 30s, 51 °C, 30s, 72°C，lmin, 30个循环；72°C，IOmin)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化 JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列；(4)A.usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析将Aus cpA的5'端cDNA与3'端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA的 cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus CpA 的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信号预测(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)；(5)A.usamiiEOOl羧肽酶基因内含子序列的测定以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA_F3和 AucpA-R ；AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；AucpA-R 5' -TTAGGCACTATCAATAGCAG-3‘，含 Not I 酶切位点；以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行PCR(94°C， 4min ；94°C，30s, 53°C，30s, 72°C，2min, 30 个循环；72°C，IOmin)，将 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接， 转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6. 0进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列；(6)构建含有编码A.usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒以预测出的A. usami i EOO1羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和 AucpA-R ；AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0中的说明书进行RT-PCR 以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 "C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30个循环；72°C，10min)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA,并对重组质粒进行序列测定；(7)GS115/AuscpA的构建、表达及活性测定用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
专利摘要
本发明提供了一种新型羧肽酶及其基因序列，新型羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达和纯化方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白水解酶S1家族，特命名为Aus CpA，相应的基因序列命名为Aus cpA。Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大工业化生产的潜力和经济价值，也为其他羧肽酶的研究奠定了理论基础。
文档编号C12R1/66GKCN102492677SQ201110410568
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日
发明者吴静, 曾研, 邬敏辰, 闵柔, 黄芳 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备技术领域：
[0001]本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶基因工程菌的构建，以其重组羧肽酶的表达及酶活测定方法，属于生物工程技术领域：
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背景技术：
[0002]羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。[0003]曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其发明专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima 等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶0，酶活为463. 0mkat/kg(27. 780U/mg)。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。[0004]基因工程羧肽酶纯度高、不含其他蛋白酶，不含动物源性的任何物质，终产物不需进行病毒等的检疫等，不含胰蛋白酶抑制剂-PMSF，同时，利用基因工程菌生产羧肽酶不受动、植物原料来源的限制、不表达需要大面积的占地种植，也不受季节气候的影响，不破坏资源，不污染环境，是一种安全、高效、高产、高质的高新技术。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白酶Sl家族，命名为Aus CpA, 相应的基因序列命名为Aus cpA0 Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济价值。[0006]本发明的技术方案一种来源于A.USamii EOOl的羧肽酶，其全基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，全基因获取的过程如图1所示。[0007]A.usamii EOOl已在文献
宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn II在不同毕赤酵母中的分泌表达，生物加工过程，第6卷第2期，2008年3月
中公开，本发明人承诺该微生物在20 年内向公众发放。[0008]所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。[0009]所述的羧肽酶基因的克隆及表达方法[0010](I)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0011]首先对Aspergillus terreus>Aspergi 1 Ius clavatus禾口 AspergiIlus niger 的羧肽酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；[0012]AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘[0013]AucpA-3F2 5‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘[0014]提取A. usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行RT-PCR，经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因3'端cDNA序列。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0015](2)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0016]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；[0017]AucpA-5Rl 5‘ -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘[0018]AucpA-5R2 5‘ -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘[0019]按照TaKafei生产的5' -Full RACE Kit中的说明书进行5‘ -RACE，最后经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因5'端cDNA序列，将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5'，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0020](3)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成[0021]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl为引物进行第一轮PCR，T-PrimerF和AucpA_R2为引物第二轮PCR，经过两轮PCR得到羧肽酶基因 5'端调控序列，将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列。[0022](4)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列的合成[0023]以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增3‘端调控序列的正向弓丨物 AucpA-F 1 禾口 AucpA-F2 ；[0024]AucpA-Fl 5' -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘[0025]AucpA-F2 5' -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘[0026]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-Fl为引物进行第一轮PCR ；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA-F2为引物进行第二轮 PCR;将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列。[0027](5)A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析[0028]将Aus cpA的5'端cDNA与3'端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus cpA的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测和PolyA加尾信号预测。[0029](6)A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列的测定[0030]以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA_F3 禾口 AucpA-R ；[0031]AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；[0032]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGCAG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；[0033]以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行PCR， 将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用 DNAMAN 6. 0进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列。[0034](7)构建含有编码A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒[0035]以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和 AucpA-R ；[0036]AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；[0037]AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；[0038]按照TaKafci 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮PCR ；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR ；将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA,经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。[0039]将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA (图 2)，并对重组质粒进行序列测定。[0040](8)GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定[0041]用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选， 得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。[0042]本发明的优点[0043]本发明提供了一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达及活性测定方法。该羧肽酶具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济意义，也为其它羧肽酶的研究奠定了理论基础。
[0044]图1 获取A. usamiiAus cpA全基因序列的流程图[0045]图2 重组质粒pPIC9K_Aus cpA构建示意图具体实施方式
[0046]实施例1A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成[0047]按照TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和 AucpA-3Fl 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 个循环； 72°C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA_F2为引物进行第二轮 PCR(94°C，2min ；94°C，30s，48°C，30s，72°C，90s，30 个循环；72°C, IOmin)；将两轮PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。[0048]实施例2A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成[0049]按照TaKaRa 生产的 5' -Full RACE Kit 中的说明书进行 5' -RACE 以 5' RACE Outer Primer 和 AucpA_5Rl 为引物进行第一轮 PCR (94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C， lmin，30 个循环；72°C，IOmin)；以第一轮的 PCR 产物为模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5-R2 为引物进行第二轮 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，51°C，30s，72°C，lmin，30 个循环； 72°C,10min)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamiiEOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。[0050]实施例3A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成[0051]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl为引物进行第一轮 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA_R2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin ； 94 °C，30s，51 °C，30s，72 °C，Imin，30 个循环；72 °C，1 Omin)；将两轮 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列。[0052]实施例4A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列的合成[0053]利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA_3Fl为引物进行第一轮 PCR (940C，4min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA_F2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin ； 940C，30s, 470C，30s, 72°C，lmin30s, 30 个循环；72°C, IOmin)；将两轮 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AuCpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列。[0054]实施例5A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析[0055]将AucpA的5 ‘端cDNA与3 ‘端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA 的cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出AucpA 的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启云力子区域预测(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信号预测(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)。[0056]实施例6A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列的测定[0057]以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行 PCR(94°C，4min ；94°C，30s，53°C，30s，72°C，2min，30 个循环；72°C，IOmin)，将 PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6. O 进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列。[0058]实施例7构建含有编码A. usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒[0059]按照TaKafci 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的说明书进行 RT-PCR 以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 °C， IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30个循环；72°C，10min)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA,并对重组质粒进行序列测定。[0060]实施例8GS115/Aus cpA的构建、表达及活性测定[0061]用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选， 得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
权利要求
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的羧肽酶，其完整的基因序列为 SEQ ID NO :1ο
2.如权利要求
1所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQID NO :2。
3.A. usamii EOOl羧肽酶基因全基因序列获得的方法(1)A.usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成首先对 Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus 禾口 Aspergillus niger 的羧妝酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘AucpA-3F2 5 ‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O中的说明书进行RT-PCR 以Oligo dT-AdaptorPrimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13PrimerM4和AucpA_3Fl 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 48 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 "C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA_F2为引物进行第二轮 PCR(940C，2min ；94°C，30s, 48°C，30s, 72°C，90s, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列；(2)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；AucpA-5Rl 5' -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘AucpA-5R2 5' -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘按照 TaKaRa 生产的 5‘ -Full RACE Kit 中的说明书进行5' -RACE:以5' RACE Outer Primer和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin，30 个循环；72°C, IOmin)；以第一轮的 PCR 产物为模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5_R2 为引物进行第二轮 PCR(94 °C，3min ； 94°C，30s，51°C，30s, 72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接， 转化JM109获重组质粒pUCm-T-AuCpA5 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列；(3)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94"C，4min ；94°C，30s, 47"C，30s, 72"C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA_R2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin -MV, 30s, 51 °C, 30s, 72°C，lmin, 30个循环；72°C，IOmin)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化 JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列；(4)A.usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析将Aus cpA的5'端cDNA与3'端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA的 cDNA序列，在NCBI上进行开放阅读框架(Open Reading Frame)分析，进而推测出Aus CpA 的氨基酸序列，然后进行信号肽预测；将cDNA序列与两侧调控序列进行拼接，然后进行启动子区域预测(http //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html)禾口 PolyA 力口尾信号预测(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)；(5)A.usamiiEOOl羧肽酶基因内含子序列的测定以预测出的A. usamii EOOl羧肽酶基因的cDNA为模板，设计一对引物AucpA_F3和 AucpA-R ；AucpA-F3 5' -GAATTCATGCTGTTTCGCAGTCTGTT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；AucpA-R 5' -TTAGGCACTATCAATAGCAG-3‘，含 Not I 酶切位点；以A. usamii EOOl的基因组DNA为模板，AucpA_F3和AucpA-R为引物进行PCR(94°C， 4min ；94°C，30s, 53°C，30s, 72°C，2min, 30 个循环；72°C，IOmin)，将 PCR 产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接， 转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA-DNA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶编码区的DNA序列；将DNA序列与cDNA用DNAMAN 6. 0进行序列比对，便能得出A. usamii EOOl羧肽酶基因内含子序列；(6)构建含有编码A.usamii EOOl羧肽酶成熟肽基因的表达质粒以预测出的A. usami i EOO1羧肽酶成熟肽基因为模板设计一对引物AucpA-F和 AucpA-R ；AucpA-F 5' -GAATTCATCCCTGTCGAGGACTAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点；AucpA-R 5' -GCGGCCGCTTACAGGGTATCACGCCG-3 ‘，含 Not I 酶切位点；按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0中的说明书进行RT-PCR 以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和AucpA-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 50 "C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 "C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、AucpA-F和AucpA-R为引物进行第二轮PCR(94°C， 2min ;94°〇，308，501，308，721，908，30个循环；72°C，10min)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-Aus cpA，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定。将测序结果正确的pUCm-T-Aus cpA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Aus cpA,并对重组质粒进行序列测定；(7)GS115/AuscpA的构建、表达及活性测定用Mc I对pPIC9K-Aus cpA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的重组GS115/Aus cpA,以手册上的标准流程进行诱导表达，对表达产物用茚三酮法进行活性分析。
专利摘要
本发明提供了一种新型羧肽酶及其基因序列，新型羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达和纯化方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白水解酶S1家族，特命名为Aus CpA，相应的基因序列命名为Aus cpA。Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大工业化生产的潜力和经济价值，也为其他羧肽酶的研究奠定了理论基础。
文档编号C12R1/66GKCN102492677SQ201110410568
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日
发明者吴静, 曾研, 邬敏辰, 闵柔, 黄芳 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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