专利名称:Rrspg1的扩增引物、该基因的核心片段及其应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及基因工程
技术领域:
,具体涉及扩增&57從7 (水稻纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因I)的特异引物、扩增该基因核心片段的特异引物、该基因的核心片段及其应用。
背景技术:
水稻纹枯病是一种世界性的水稻三大病害之一,在我国造成了严重的经济损失。水稻纹枯病的病原菌为立枯丝核菌solani Kilhn),其分布范围和寄主范围广,除为害水稻外,还可为害玉米、大豆和马铃薯等260多种植物。由于立枯丝核菌O .■so7a/ i)种内成员复杂,所以通常采用菌丝融合群(anastomosis group, AG)进行再分类。目前立枯丝核菌0 .sWmi)至少被划分为14个AG,有些AG再划分为不同的亚群,水稻纹枯病菌属于Λ solani AG-1 IA,但其致病机制尚未清楚。
细胞壁降解酶是水稻纹枯病菌的主要致病因子。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,简称PG)是细胞壁降解酶的一种,该酶可分为内切(endo现有技术中关于多聚半乳糖醛酸酶(PG)的专利文献如下:香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆,
公开日2005/11/09,公开号1693464 ;香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取纯化方法,
公开日2005/09/28,公开号1673366 ;新的多聚半乳糖醛酸酶和它们的用途,
公开日2010/08/18,公开号101809149A ;
公开日2010/02/10,公开号101643782 ;辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因、蛋白制备方法及其应用,
公开日2010/02/03,公开号101638662 ;火把梨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PpPGIP及应用,
公开日2010/06/16,公开号101736015A ;番茄PG基因启动子反向重复序列及其载体和工程菌株,
公开日2007/10/03,公开号101045927 ;—种控制半乳糖醛酸水解酶活性延长芒果硬度的方法,
公开日2007/11/07,公开号101066068。没有检索到水稻纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因特异性扩增引物、扩增该基因核心片段的特异引物、该基因的核心片段及其应用的专利报道。
在学术期刊中检索到的相关信息如下:蔺凌云,柑橘绿霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和功能分析,浙江大学学位论文,2010-06-01 ;张强,白菜花粉外壁蛋白基因BcMF5和多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的分离及其功能验证,浙江大学学位论文,2006-05-10 ;鞠戎等,番茄多聚半乳糖醛酸酶c DNA的克隆及其对番茄中PG表达的反义抑制,生物工程学报,1994-04-23 ;杜欣可,玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶的基因克隆、表达及致病性研究,山东农业大学学位论文,2009-05-01 ;陈鑫,桃多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因克隆及反义表达载体的构建,甘肃农业大学学位论文,2009-06-01 ;孙文秀,辣椒疫霉(.Phytophthora capsici)致病遗传变异、多聚半乳糖醒酸酶基因克隆及表达特性研究,山东农业大学学位论文,2007-05-01 ;韩爽,玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆表达及致病性分析,山东农业大学学位论文,2011-05-01 ;梅眉,甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因克隆及其反义序列植物表达载体构建,甘肃农业大学学位论文,2006-06-01 ;张毁等,多聚半乳糖醛酸酶基因家族的分子进化,农业生物技术学报,2010-02-28 ;罗婭等,草莓多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP)的克隆及组织特异性表达,农业生物技术学报,2010-06-28 ;周晓婴等,核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建,江苏农业科学,2010-08-15 ;陈儒钢,辣椒多聚半乳糖醛酸酶基因CaPG的克隆与序列分析,西北植物学报,2010-10-15 ;刘乐等,柿果实多聚半乳糖醛酸酶基因克隆与序列分析,西北植物学报,2009-04-15 ;张强等,白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆、序列分析及其表达,园艺学报,2007-02-25 ;张丽等,甜瓜多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA的克隆和序列分析,内蒙古大学学报(自然科学版),2003-05-15 ;王友德,水稻纹枯病菌PG的分离纯化、理化性质IRspgl基因的克隆与表达,扬州大学学位论文,2010-04-01 ;刘颖,白菜花粉发育相关的PGIP新基因BcMF19的克隆与表达分析,浙江大学学位论文,2010-01-10。
另外,硕士学位论文“水稻纹枯病菌PG的分离纯化、理化性质及Rspgl基因的克隆与表达”(王友德,2010年5月I日)报道,根据GenBank中立枯丝核菌PG基因序列(FJ5444455,FJ5444456,DQ848983)特征设计特异引物,通过PCR技术获得水稻纹枯病菌多聚半乳糖醒酸酶全长基因该基因大小为1395bp,推测含有5个内含子(57bp、57bp、59bp、66bp、61bp),其序列与玉米纹枯病菌/^7基因(FJ544456)相似性达99%。
发明内容本发明的目的在于提供一对扩增水稻纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因I(.Rrspgl)的高效特异引物。
本发明的另一目的是提供&57從7的核心片段及其特异性扩增引物。
本发明的又一目的是提供办5/從7的核心片段的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一对扩增水稻纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因I (endo-PG基因1,简称Rrspgl)的高效特异引物,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示。
本发明根据NCBI GenBank注册号:JNl 18556公开的水稻纹枯病菌cDNA全长序列(JN118556为本实验室成果),设计了 24对扩增引物,经过实验比较分析,发现SEQID NO:1 2这对引物的扩增效率最高。
以水稻纹枯病菌强致病力菌株⑶-118的DNA和RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、5’-RACE和3’-RACE等分子技术,用上述引物(SEQ ID NO:1 2)成功克隆到办5/從7的全长序列,找出了於的5’端和3’端非翻译区及该基因的3个内含子,发现该基因与玉米纹枯病菌endo-PG基因在核酸水平上存在6个碱基的差异,在氨基酸水平上存在4个氨基
酸差异。[0014]Rrspgl RNAi表达载体的构建需要500 bp左右的核心片段,根据载体pSilent_l的特点,该核心片段不能含有III和通ο I以及命/ 1和汝7 II这四种酶的酶切位点。因此,我们共设计了 7对引物扩增该核心片段,通过序列测定与分析,最终筛选到了一对适合于构建该基因RNAi表达载体的、唯一能够扩增该核心片段的特异引物PGSlOF (SEQ IDNO: 3)和PGSlOR (SEQ ID NO: 4),其余6对引物都不适合。这对特异引物PGS10F/R的序列如下:
PGSlOF (SEQ ID NO: 3):ATGGCTTTGATGTTTCC ;
PGSlOR (SEQ ID NO: 4):ACTGCGATGTTGTTGGT。
本发明提供了办5/從2的核心片段,该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。如上所述,W^Rrspgl RNAi表达载体需要500bp左右的片段,核心片段不含有上述四种酶的酶切位点,是唯一的片段,扩增该核心片段的特异引物也是唯一的。该核心片段具备干扰Rrspgl基因的功能,是构建RNAi表达载体和进行功能研究所必需的。
本发明还首次构建了一种RNAi表达载体,该表达载体包含的核心片段。作为一种优选方案,该表达载体的出发载体优选为pSilent-Ι,是由载体pSilent-Ι与Rrspgl的核心片段构建而成,命名为pSilent-PG-2。具体构建方法是将载体pSilent-Ι分别用历/7d III和通ο I以及Kpn 1和汝7 II两组限制性内切酶进行双酶切(分两步进行),再将进行同样双酶切后的办5/從7的核心片段分别与同样双酶切后的载体pSilent-Ι连接而成的(分两步进行)。两组限制性内切酶双酶切的优点是:因为要在PSilent-1载体上的内含子(IT)两端分别引入两段反向同源的办5/從7的核心片段才能构建RNAi的表达载体pSilent-PG-2,所以要用两组限制性内切酶分别酶切IT两端的两组酶切位点(分两步进行),才能够将酶切后的核心片段与酶切后的pSilent-Ι载体相连接(分两步进行),而且连接方向刚好与期望一致,无需进行核心片段连接方向的鉴定(单酶切需要进行方向鉴定)。
同时,本发明还构建了转基因型水稻纹枯病菌,是由上述RNAi表达载体,优选pSilent-PG-2转化水稻纹枯病菌⑶-118菌株获得的。
本发明成功地对的相关功能进行了研究,对揭示水稻纹枯病菌的致病机制及其与寄主互作的分子机制等方面的研究具有重要的指导意义。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明首次设计了特异引物,高效扩增出水稻纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因I (办5/從7)的核苷酸序列,与文献报道的其它PG基因的序列不同,并且构建了该基因的RNAi表达载体pSilent-PG-2,经过实验证明,转化了该表达载体的水稻纹枯病菌强致病力菌株⑶-118,其PG水解圈明显变小。
图1.实施例1获得的水稻纹枯病菌⑶-118菌株endo-PG基因I (MrspgO网上比对结果。
图2.实施例1引物对R4-1 F/R对7个Λ solani水稻菌株gDNA的PCR扩增结果,I:ddH20 ;2 -.Fusarium sp.(阴性对照);3:A1 ;4:C30 ;5:E67 ;6:GD61 ;7:GD118 ;8:YN_3 ;
9:YN-7 ;M:DL2000o
图3.实施例1弓丨物对R1-1F/R对7个Λ solani水稻菌株gDNA的PCR扩增图谱,I:ddH20 ;2:A1 ;3:C30 ;4:E67 ;5:⑶61 ;6:0)118 ;7:YN_3 ;8:YN_7 ;M:DL2000。
图4.RNAi载体的构建过程图,a:初始载体pSilent_l ;b:中间载体pSilent-PG-1 ;c:最终载体 pSilent-PG-2。
图5.多聚半乳糖醛酸酶的平板法检测结果,左侧3个水解圈为野生型菌株(⑶-118),右侧3个水解圈为RNAi 转化子菌株。[0028]图6.水稻纹枯病菌(R.s.rice)与其它相关真菌的endo-PG基因的亲缘关系进化树。
具体实施方式下面通过实施例进一步解释本发明,实施例中除作特殊说明外,均为本领域常用实验技术手段。
实施例1 Rrspgl基因的获得
1.引物设计
根据NCBI 网站(www.ncb1.nlm.nih.gov)公布的 PG 基因序列(GenBank 注册号JN118556),利用DNAMAN软件进行序列比对,找出同源序列,然后根据同源序列利用Primer5.0软件设计了 24对引物。
Rrspgl基因扩增弓丨物筛选
以水稻纹枯病菌强致病力菌株⑶-118的总DNA为模板,用上述设计的24对引物进行PCR扩增,并测序。测序结果在NCBI网上比对,根据与相应酶基因片段的同源性判断所测序列是否为需要的目的片段,进而判断引物的好坏。对于较差引物则舍弃。对于测序结果良好的引物,则进一步通过克隆后再测序,使结果更准确。
提取水稻纹枯病菌强致病力菌株⑶-118的总RNA,用One-st印RT-PCR kit(一步法RT-PCR试剂盒)进行RT-PCR扩增,对获得的24对引物进行筛选。经筛选,只有R4-1F/R和R4-2F/R两对引物的扩 增序列与Λ solani PG基因序列具有较高相似性,其它序列经NCBI网站BLAST搜索,证明无明显相关性,舍弃。同时,我们通过对两对引物扩增测得序列比对与引物比较发现,R4-1F/R和R4-2F/R两对引物的下游引物相同,R4-1F/R的上游引物(R4-1F)位于R4-2F/R的上游引物(R4-2F)的前端,所以,R4_l F/R引物扩增所得的序列包含了 R4-2 F/R扩增所得的序列,即R4-1F/R引物扩增得到的片段更大。因此,我们最终筛选出能够扩增办5/從7的高效、特异引物R4-1F/R。其中上下游引物R4-1F和R4-1R的核苷酸序列如下:
R4-1F (SEQ ID NO:1): (F)CTTTACTGTCCCTGCCG ;
R4-1R (SEQ ID NO: 2): (R)ATGTTGTTGGTGCTTCC。
Rrspgl基因扩增
以R4-1F和R4-1R为引物,以水稻纹枯病菌强致病力菌株⑶_118的总DNA为模板,进行RT-PCR扩增,经过克隆、测序后得到PG基因部分序列,然后分别通过5’ -RACE和3’ -RACE获得5’端和3’端部分序列,再经过序列拼接获得/的cDNA全长序列,即本实验室在NCBI上公开的、GenBank注册号为JN118556的水稻纹枯病菌办5/從7 cDNA全长序列。
本发明公开的引物R4-1F/R的扩增效率(图2)比其它引物(图3,R1-1F/R)高,因而优于其它引物对。如图2和图3所示。
通过上述两对引物(R4-1F/R和R1-1F/R)对7个/ .solani水稻菌株gDNA (Al ;C30 ; E67 ;GD61 ;GD118 ;YN_3 ;YN_7)的PCR扩增结果(图2和图3)的比较,我们可以看出,引物对R4-1F/R的特异性和扩增效果均较佳,全部供试菌株都扩增出明亮而整齐的条带;而引物对R1-1F/R对7个菌株gDNA的PCR扩增,部分菌株未能扩增出条带,条带亮度也不尽相同,而且片段大小略有差异,易出现非特异性扩增。因此,
权利要求1所述引物对R4-1F/R是扩增基因的特异性引物。
实施例2水稻纹枯病菌endo1.RNAi载体的构建
用引物PGSlOF (核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示)和PGSlOR (核苷酸序列如SEQID NO: 4所示)扩增办5/從7的核心片段PGS,得到其序列(核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示)。引物PGSlOF和PGSlOR序列如下:
PGSlOF (SEQ ID NO: 3):ATGGCTTTGATGTTTCC ;
PGSlOR (SEQ ID NO: 4):ACTGCGATGTTGTTGGT。
分别用历/ d III和沿O I认RKpn I和沒^/ II两组限制性内切酶进行双酶切,再将目的片段即办5/從7部分核心片段PGS (SEQ ID NO: 5)和载体pSilent-Ι构建正反向连接反应,得到新的重组载体。
具体操作步骤为JfpSilent-1载体(图4_a)在Intron上游接入endo-PG基因PGS片段(SEQ ID NO: 5),得到载体pSilent-PG-Ι(图4_b),再在Intron下游反向接入endo-PG基因PGS片段(SEQ ID NO: 5),得到两端具有反向同源序列的RNAi载体pSilent-PG_2(图4_c)0
遗传转化
采用原生质体转化法,用构建好的载体pSilent-PG-2对水稻纹枯病菌Λ solaniAG-1 IA进行遗传转 化,得到转化子菌株。通过比较转化子菌株与野生型菌株的PG活性,计算平均基因沉默效率。同时,通过酶水解圈实验证明载体pSilent-PG-2对水稻纹枯病菌成功实现了 RNA干扰,达到了理想的沉默效果。
基因沉默效率的检测
①endo-PG酶活性的检测:提取水稻纹枯病菌强致病力野生型菌株GD-118 (即水稻纹枯病菌强致病力菌株GD-118)和转化子菌株的endo-PG,比较两者的酶活性差异。
RNAi沉默效率的计算公式:
沉默效率(%)=[(野生型菌株酶活性-转化子菌株酶活性)/野生型菌株酶活性]X100%
②平板检测法
参考Chatterjee et al.(Chatterjee A, Cui Y, Liu Y, et al.1995.1nactivation of rsmA leads to overproduction of extracellular pectinases,cellulases, and proteases in Erwinia carotovora subsp.carotovora in theabsence of the starvation / cell density检测结果
表I显示了不同转化子菌株⑶118-RNA1-l ⑶118_RNAi_10的PG酶活性和RNAi
沉默效率。
表I转化子菌株与野生型菌株的PG酶活性及RNAi沉默效率
权利要求1.Rrspgl的核心片段,其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
2.—种RNAi表达载体,其特征在于包含
权利要求1所述的的核心片段。
3.根据
权利要求2所述RNAi表达载体,其特征在于由
权利要求1所述的核心片段插入到载体pSilent-Ι的多克隆位点构建而成。
4.
权利要求3所述RNAi表达载体的构建方法,其特征在于将载体pSilent-Ι分别用历/7d III和通ο I以及KPn 1和及^7 II两组限制性内切酶进行双酶切,再将
权利要求1所述Rrspgl的核心片段经^ifldIII和沿ο I以及Kpn 1和欲7 II两组限制性内切酶进行双酶切后与双酶切后的pSilent-Ι载体正反向连接而成的。
5.一种转基因水稻纹枯病菌,其特征在于由
权利要求2或3所述RNAi表达载体转化水稻纹枯病菌GD-118菌株获得的。
6.
权利要求1所述的核心片段在研究水稻纹枯病菌的致病机制和/或水稻纹枯病菌与寄主相互作用的分 子机制中的应用。
专利摘要本发明公开了Rrspg1的扩增引物、该基因的核心片段及其应用。该Rrspg1基因的扩增特异引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示;扩增该基因核心片段的特异引物如SEQIDNO:3~4所示;该基因的核心片段核苷酸序列如SEQIDNO:5所示;本发明还构建了Rrspg1核心片段的RNAi表达载体pSilent-PG-2,该RNAi表达载体是由载体pSilent-1和Rrspg1核心片段分别均经过HindⅢ和XhoⅠ以及KpnⅠ和BglⅡ两组限制性内切酶进行双酶切,再正反向连接而获得的;本发明同时研究了Rrspg1核心片段的功能,对揭示水稻纹枯病菌的致病机制及其与寄主互作的分子机制等方面的研究具有重要的指导意义。
文档编号C12N15/63GKCN102433335 B发布类型授权 专利申请号CN 201110423424
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日
发明者周而勋, 杨迎青, 杨媚, 舒灿伟, 郑丽 申请人:华南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),